Taqman荧光探针技术检测结核分枝杆菌

目的：比较Taqman荧光探针技术与常规PCR电泳技术检测结核分枝杆菌的灵敏度及特异性，评价Taqman荧光探针技术（Taqman技术）检测临床标本中结菌的应用价值。方法：应用细菌培养法，常规PCR电泳技术与Taqman技术检测300份临床结核病患者痰标本及50份非结核呼吸系统疾病患者痰标本。结果：细菌培养法检测结核阳性率为112/300；常规PCR电泳技术检测结核菌阳性率为169/300，特异性96%；Taqman荧光探针技术检测结核菌阳性率为141/300，特异性100％。结论：Taqman荧光探针技术是一种全新的PCR分子杂交模式，集PCR扩增、荧光探针杂交、荧光检测一体化，在单一管内完成，简便、快速、防污染、敏感性高、特异性强，是结核病辅助诊断的有效方法。     

202株铜绿假单胞菌的临床分布及药物敏感性分析

目的：了解铜绿假单胞菌的临床分布及药物敏感性,为临床合理使用抗生素提供依据。方法：对各种临床标本分离出的202株铜绿假单胞菌的临床分布和药物敏感试验结果进行分析。结果：铜绿假单胞菌从痰标本分离出的菌株最多,阳性率为45.55%。铜绿假单胞菌对亚胺培南、美罗培南、头孢哌酮＋舒巴坦的敏感性较高。结论：根据药敏结果合理使用抗生素可避免耐药菌株的产生,有效控制感染。     

应用PCR技术快速诊断感染性角膜溃疡

目的探讨PCR技术快速诊断感染性角膜溃疡的临床应用。方法以源于医学条件致病性真菌18srRNA和细菌16srRNA基因保守区各自的一对寡核苷酸序列为通用引物，对临床拟诊为感染性角膜溃疡的标本进行PCR检测，并与培养方法进行对比。结果在310bp处出现DNA扩增带者为真菌感染；520bp处出现DNA扩增带者为细菌感染；310bp和520bp处同时出现DNA扩增带者为真菌和细菌混合感染。32例临床标本培养阳性率为59．38％，而经PCR扩增阳性率为78．13％。结论应用PCR技术检测感染性角膜溃疡速度快、阳性率高，有助于角膜溃疡的病原学快速诊断。     

基于颜色判定的环介导恒温扩增技术快速检测铜绿假单胞菌的研究

目的建立了一种基于颜色判定的,能够快速准确地检测铜绿假单胞菌的LAMP方法。方法针对铜绿假单胞菌OprL基因设计3对LAMP引物,通过引物特异性识别OprL的8个独立区域来快速检测铜绿假单胞菌。如果在反应前添加荧光染料羟基萘酚蓝(HNB)或钙黄绿素(Calcein),其结果可以通过肉眼观察反应前后颜色变化来判定并经琼脂糖凝胶电泳验证。对该技术进行特异性、灵敏度分析,利用LAMP和PCR同时检测临床标本。结果设计出针对铜绿假单胞菌OprL基因的恒温扩增检测方法。本恒温扩增检测法只扩增铜绿假单胞菌DNA,对其他菌不扩增,显示出良好的特异性。其最低检测限为17.414 pg/μl,PCR方法最低检出限为174.414 pg/μl,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法检测灵敏度的10倍,灵敏度高。LAMP法对临床阳性标本检出率与PCR法相当(27/27)。结论 LAMP方法用于快速检测铜绿假单胞菌具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果肉眼可辨别、灵敏度高和特异性强的特点,适合用于现场和基层检疫及医疗单位的快速诊断。     

PCR检测在真菌性角膜溃疡中的诊断价值

目的探讨聚合酶链反应(PCR)快速检测在真菌性角膜溃疡诊断中的价值。方法以源于医学条件致病性真菌18srRNA基因保守区的一对寡核苷酸序列为通用引物,对临床拟诊为真菌性角膜溃疡的36例标本进行PCR检测,并与培养方法进行对比。结果在400bp处出现DNA扩增带者为阳性。36份临床标本的真菌培养阳性率为58.3%,而经PCR扩增阳性率为86.1%,PCR扩增准确性为72.2%,敏感性为100.0%,特异性为33.3%。结论真菌通用引物进行PCR反应检测真菌性角膜溃疡速度快、阳性率高,有助于真菌性角膜溃疡的快速诊断。     

113株铜绿假单胞菌感染分布及耐药分析

目的: 了解铜绿假单胞菌感染在我院临床标本中的分布及耐药特点。方法: 分析2 640份临床感染标本中铜绿假单胞菌感染及其耐药性资料。结果: 分离出铜绿假单胞菌113株,总检出率为4.2%,其中烧伤创面分泌物铜绿假单胞菌检出率最高,喹诺酮类环丙沙星对铜绿假单胞菌敏感性最高达83%,青霉素类哌拉西林、三代头孢菌素及亚胺培南敏感率为71.2%;一、二代头孢菌素及复方磺胺甲口恶唑、氯霉素对铜绿假单胞菌不敏感,耐药率高达90%以上。结论: 警惕并重视铜绿假单胞菌感染,注意病原菌及耐药率的监测,规范抗生素应用,保持敏感抗生素的抗菌活性。     

环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的研究

用环介导等温扩增技术(LAMP)快速、灵敏地检测铜绿假单胞菌.利用铜绿假单胞菌gbca基因,特异性设计3对LAMP引物,在反应体系中添加羟基萘酚蓝(HNB)荧光染料,通过反应前后颜色的变化肉眼观察结果,并用琼脂糖凝胶电泳加以验证.对临床标本利用LAMP和PCR法平行检测,验证该法灵敏度、特异性.针对铜绿假单胞菌DNA特异性引物的LAMP法可以扩增,其他无扩增产物.本实验建立的LAMP法具备简便、快速、特异性强和灵敏度高的特点,适于实际应用.     

胆汁细菌培养与药敏分析

目的：了解胆汁中病原菌菌群分布情况,分析胆汁中细菌药物敏感性。方法：应用BACTEK9120培养系统和VITEK32全自动细菌鉴定及药敏分析系统对81例胆汁标本进行细菌鉴定和药敏分析。结果：胆汁细菌培养阳性率为88．9％,主要菌种有大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肠球菌,肠球菌比率较高;需氧茵中革兰氏阴性菌对亚胺培南、哌拉西林／他唑巴坦、头孢他啶的敏感性较好．肠球菌只对左氧氟沙星、氨苄西林敏感性较好。结论：胆汁细菌培养阳性率很高,有一定的临床价值。     

PCR法与培养法检测儿童肺炎易感细菌结果比较

目的探讨PCR法和培养法对儿童肺炎易感细菌检测的应用价值。方法采用PCR法及细菌培养法对113例呼吸道感染患儿的临床标本进行检测,对两种检测方法的结果进行比较。结果 113例临床标本中,培养法检测阳性率46.9%(53/113),其中流感嗜血杆菌2例,大肠埃希菌8例,肺炎克雷伯菌15例,肺炎链球菌3例,金黄色葡萄球菌12例,表皮葡萄球菌6例,铜绿假单胞菌7例。PCR法检测阳性率69.9%(79/113),在79例阳性标本中检出病原菌85株,其中73例标本检测出单一病原,6例标本为混合感染。流感嗜血杆菌18例,大肠埃希菌8例,肺炎克雷伯菌17例,肺炎链球菌16例,金黄色葡萄球菌10例,表皮葡萄球菌10例,铜绿假单胞菌6例。结论与培养法相比,PCR法可以提高肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等较难培养细菌的检出率,应将PCR法与培养法结合作为肺炎易感细菌的检测方法,为临床医师合理选择抗生素奠定基础。     

126株铜绿假单胞菌耐药分析

目的：了解铜绿假单胞菌感染在我院临床标本中的分布及耐药特点。方法：将分离培养的细菌用法国生物梅里埃公司的20E鉴定卡进行鉴定并记录其感染部位。结果：分离出铜绿假单胞菌126株,其中痰液标本中铜绿假单胞菌检出率最高。美洛培南、亚胺培南、环丙沙星以及β-内酰胺酶抑制剂复合物对铜绿假单胞菌有良好的效果,敏感性都在60%以上。结论：铜绿假单胞菌感染以上呼吸道为主,可引起多部位感染,它对多种抗生素具有较高的耐药性,因此应加强药物检测,指导临床用药。     

真菌通用引物PCR反应鉴别兔眼真菌性和细菌性角膜溃疡

目的 利用真菌通用引物PCR反应，鉴别兔眼真菌性和细菌性角膜溃疡。方法 根据临床上常见的致病细菌菌株(金葡菌、绿脓菌)，真菌菌株(烟曲霉菌、白念菌、镰刀菌)，制作兔眼角膜溃疡的动物模型，选取一对真菌通用引物，一对寡核苷酸引物B2F(5'ACTITCGTAGGATAG-3')和B4R(5'-TGATCGtcttccataaata-3')，对标本进行聚合酶链反应。结果 在687bp处出现DNA扩增带者为阳性。造模后第3d真菌组出现扩增带阳性的90％，第5d真菌组出现扩增带阳性的96．6％。细菌组始终未出现阳性结果。结论 真菌通用引物PCR反应检测鉴别真菌性与细菌性角膜溃疡有较好的敏感性和特异性。     

16SrRNA基因聚合酶链反应快速检测烧伤脓毒症细菌病原体的研究

目的为早期诊断烧伤脓毒症，探索一种能迅速检测细菌感染的方法。方法按标准收集可疑脓毒症患者39人外周静脉血标本共41份。将每份标本一分为二分别行血培养和用细菌通用引物行16SrRNA基因聚合酶链反应检测，用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，比较两种方法在检测细菌病原体时的快速性和敏感性，分析血培养及药敏结果。结果16SrRNA基因PCR方法的阳性率（41．16％）是血培养阳性率（21．95％）的近两倍。P〈0．05。16SrRANA基因PCR方法出结果需4、5h，血培养需12～24h（多数需2、3d）。9例血培养阳性患者中，8例为单一铜绿假单孢菌感染，1例为单一溶血链球菌感染。结论16SrRNA基因PCR检测细菌感染的方法具有特异性、快速性、敏感性的优点。在该中心，使用抗生素治疗后，引起脓毒症的细菌主要为铜绿假单孢菌。该菌对目前常用广谱抗生素耐药。     

PCR扩增梅毒螺旋体poIA基因及其在一期梅毒诊断中的应用

目的提高对梅毒诊断的灵敏性和特异性。方法运用PER扩增了梅毒螺旋体(Tp)的DNA多聚酶I基因(polA)的特异性片段,检测了该方法的特异性和灵敏性;用该方法检测了118例生殖器溃疡,同时用Tp PCR试剂盒和血清学方法平行检测同批病人的溃疡或血清标本。结果polA PCR只在扩增Tp时有特异性产物,灵敏性约为20个Tp拷贝;检测118例生殖器溃疡标本,用Tp PCR试剂盒为对照,polA PCR方法的特异性和灵敏性分别为96.8％和95.7％,两种PCR检验结果差异无显著性(x2=0.25,P>0.05);polA PCR方法与血清学方法对一期梅毒诊断结果差异有显著性(x2=4.45,P<0.05)。结论polA PCR方法高度敏感、特异,在一期梅毒诊断中优于血清学方法,可作为血清学方法的补充用于梅毒的诊断。     

铜绿假单胞菌oprI基因的反向斑点杂交检测法

目的 建立一种早期快速检测铜绿假单胞菌的方法。方法 根据铜绿假单胞菌特异的oprI基因设计引物，聚合酶链反应合成特异探针，光敏生物素标记细菌DNA，应用反向斑点杂交法检测铜绿假单胞菌。结果 所合成的探针具有高度特异性，能鉴别铜绿假单胞菌，与其他细菌、病毒、真菌间无交叉反应。该方法能检测出100ng细菌DNA。结论 反向斑点杂交法具有快速、特异的优点，对铜绿假单胞菌的早期检测具有重要意义。     

多重荧光定量PCR快速检测6种常见下呼吸道感染病原菌

目的:探讨多重实时荧光定量PCR(MRT-PCR)检测6种常见呼吸道病原菌的检测方法。方法:采用BeaconDesigner7.9设计引物和探针建立MRT-PCR法,通过构建质粒标准品分析该方法的最低检出限。对176例临床标本中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和鲍曼不动杆菌进行回顾性检测,并用一代基因测序验证。结果:MRT-PCR法检测病原菌的最低检出限达103 copies/mL,大肠埃希菌19例,金黄色葡萄球菌30例,铜绿假单胞菌37例,肺炎克雷伯菌53例,阴沟肠杆菌15例,鲍曼不动杆菌22例,与传统鉴定方法报告病原菌一致,特异性达100%。通过一代基因测序结果完全符合。结论:使用多荧光通道PCR仪,采用多重PCR技术检测痰液标本中6种常见病原菌的基因检测方法,敏感性和特异性高,提高了检测效率。     

肺癌K-ras基因突变的二步PCR检测及其临床应用

目的　探讨高敏感性Kras基因点突变检测方法在肺癌临床的应用价值。方法　应用二步(巢式)聚合酶链反应结合限制性片断多态性分析方法(PCRRFLP)检测临床肺癌标本Kras基因第12密码子点突变。结果　二步PCRRFLP法检测Kras点突变的敏感性较一步法提高约64倍。55例肺癌石蜡包埋标本中,Kras点突变检出率为47.3%;对另67例纤支镜标本进行基因检测,以Kras突变进行基因诊断的敏感性为70.9%,特异性为91.7%。结论　二步PCRRFLP法对临床肺癌标本Kras点突变检出率较高,对肺癌有一定的辅助诊断价值     

Diagnostic multiplex polymerase chain reaction assay for the identification of Pseudomonas aeruginosa from the skin biopsy specimens in burn wound infections and detection of antibiotic susceptibility

OBJECTIVE: To identify Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) from the skin biopsy specimens in burn wound infections by multiplex polymerase chain reaction (M-PCR) and detection of antimicrobial susceptibility of isolates from culture. METHODS: We conducted this cross-sectional study in 140 patients with wound infections who admitted to the referral burn center of Motahari, Tehran, Iran, during a 12-month period from 2005-2006. Skin biopsy specimens were aseptically taken from each patient, one for PCR and one for bacterial culture. A M-PCR test based on the simultaneous amplification of 2 lipoprotein genes: oprI and oprL, was used to directly detect fluorescent pseudomonades and P. aeruginosa in skin biopsy specimens. The susceptibility of P. aeruginosa isolates to 16 antibiotics was determined using the disc diffusion method. RESULTS: Out of 140 biopsy specimens, M-PCR detected 66 (47.2%) isolates, while culture detected 57 (40.7%) isolates as P. aeruginosa. Positive results for both genes which observed only for P. aeruginosa, while only one gene, oprI, was amplified from other fluorescent pseudomonades n=12 and all other bacterial tested n=62 were negative by the amplification test. The most effective antibiotics against isolate of P. aeruginosa were cefepime (79%), azetreonam (76%), ticarcillin-clavulanic acid (68%), tobramycin (62%), and amikacin (61%). CONCLUSION: Multiplex PCR assay appears promising for the rapid and sensitive detection of P. aeruginosa from the burned skin biopsy specimens. Simultaneous amplification of 2 lipoprotein genes: oprI and oprL, could detect P. aeruginosa, and oprI gene only for other fluorescent pseudomonades.     

核酸扩增-液相杂交法检测沙眼衣原体DNA

目的：探讨用核酸扩增（PCR）－液相杂交法检测沙眼衣原体DNA的效果。方法：用PCR－液相杂交法对616份临床标本进行了沙眼衣原体检测，并与培养法比较，对与培养法结果不相符合的标本及部分阴性标本进行连接酶链反应（LCR）复检。结果：PCR－液相杂交相法检测沙眼衣原体特异性良好。灵敏度达到0.1fg，临床标本沙眼衣原体DNA阳性检出率为27.6％，显著高于培养法的6.3%（P＜0.001）。以培养法为标准，此法的灵敏度为100％。以LCR法为标准，此法的灵敏度为97.2％,特异度为80.7%，2者具有较好的相符性。结论：PCR－液相杂交法检测沙眼衣原体DNA操作简便，特异性强，灵敏度高，适合临床应用。