老年痴呆发病机制的研究：APP17肽对β-淀粉样肽导致神经元毒性作用的影响

背景：老年斑是老年性痴呆(Alzheimer’s Disease，AD)的主要病理特征之一，以β-淀粉样肽(β-Amyloid，Aβ)沉积为核心，Aβ的神经元毒性定位于Aβ25-35。Aβ前体蛋白(β-amvloid proteln precursor，APP)中319-335肽段即APP17肽(APP17-mer peptide)，具有神经营养和神经保护作用。目的：通过观察APP17肽对AB引起神经毒性作用的影响，进一步证实此肽的神经营养作用，并为阐明AD的发病机制和临床治疗提供理论依据。设计：标准对照实验研究。地点和材料：本研究的地点为首都医科大学宣武医院神经生化研究室。SY5Y细胞株由瑞典卡罗琳斯卡研究所赠送，APP17肽和Aβ25-35由本室用固相法合成，高效液相纯化。方法：固相法合成APP17肽、Aβ25-35，高效液相纯化，以人神经母细胞瘤株SY5Y为细胞模型，分为正常对照组、Aβ25-35 10μmol／L损伤组和Aβ25-35 10μmol／L加APP17肽10μmol／L保护组。以细胞计数、噻唑蓝代谢率、乳酸脱氢酶漏出率、细胞轴突长度、胞体面积和细胞内游离钙离子(Ca^2+)浓度为观察指标。结果：与正常对照组相比，Aβ25-35损伤组轴突长度(35．74&;#177;16．25)和胞体面积(495．92&;#177;87．68)均缩小，细胞计数接种后第6天[(8．39&;#177;1．31)&;#215;10^7L^-1]减少，噻唑蓝代谢率降低，乳酸脱氢酶漏出率升高，细胞内游离钙离子浓度升高，而加入APP17肽保护后，可使上述指标恢复或接近正常。结论：APP17肽具有神经营养和神经保护作用，可减轻Aβ引起的神经元损伤。     

短肽N328-332对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响

目的:分析淀粉样β蛋白前体蛋白N端328-332对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响,在体外寻找具有神经营养作用、促进神经细胞生长的最适浓度,为进一步细胞损伤的保护及药物体内研究提供理论依据。方法:细胞分组:根据实验目的不同,分组处理如下:第一步分为对照组、短肽N328-3322.5,5,10,20,40,80,160μmol/L组。第二步分为对照组、短肽N328-33240μmol/L组。以MTT代谢率测定细胞存活率以筛选肽对神经细胞生长促进的最佳有效浓度。以MTT代谢率测定细胞存活率、细胞计数观察细胞增长情况、乳酸脱氢酶漏出率观察细胞死亡率和WesternBlotting检测P-CREB、Bcl-2表达水平为观察指标,分析短肽N328-332对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响。结果:①从10μmol/L起,短肽N328-332即对SY5Y细胞生长有促进作用,其最小有效浓度为20μmol/L,40μmol/L促进作用最强,80μmol/L开始作用减弱,故选用40μmol/L浓度作为以下试验浓度。②短肽N328-33240μmol/L加药组代表细胞存话率的A值高于对照组,组间比较差异有显著性意义(0.9741±0.0047,0.6001±0.0019,P<0.01。③短肽N328-33240μmmol/L加药组乳酸脱氢酶漏出率明显低于对照组,组间比较差异有显著性意义(84.9135±31.5759,199.6252±40.7273,P<0.01。④从接种第4天始,短肽N328-332组SY5Y细胞数增加,与对照组相比,差异有显著性意义(P<0.05)。⑤短肽N328-33240μmol/L组P-CREB、Bcl-2蛋白表达高于对照组(37424.08±83.59,34957.24±78.03,19110.24±45.80,2761.36±58.61,P<0.05)。结论:短肽N328-332对SY5Y细胞具有神经营养作用,40μmol/L浓度,效果优于其他浓度。     

何首乌有效成分二苯乙烯甙对神经细胞保护作用的机制

目的:观察2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖甙对两种拟痴呆细胞模型的作用,探讨何首乌主要有效成分二苯乙烯甙神经保护作用的机制,为阐明何首乌及以其为主要成分的中药复方的功效机制提供实验依据。方法:不同浓度二苯乙烯甙(5～400μmol/L)分别与SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞共孵育6,24h,加入工具药β-amyloid25-35(终浓度25μmol/L)孵育24h或500μmol/L过氧化氢孵育2h。MTT法测定细胞存活率,细胞膜损伤测定乳酸脱氢酶漏出率(LDH%)。结果:①50～400μmol/L二苯乙烯甙与细胞预孵育6h可明显拮抗β-amyloid25-35引起的细胞存活率下降,随剂量增加,保护作用上升,至200μmol/L保护作用最强。200,400μmol/L二苯乙烯甙能拮抗β-amyloid25-35引起的细胞乳酸脱氢酶漏出率增高。5～200μmol/L二苯乙烯甙与细胞预孵育24h,可使β-amyloid25-35引起的细胞存活率下降恢复正常。200μmol/L二苯乙烯甙使β-amyloid25-35引起的细胞LDH%增多恢复正常。②5μmol/L二苯乙烯甙与细胞预孵育6h,即可明显拮抗过氧化氢引起的细胞存活率下降及LDH%增多犤LDH%:(62.47±2.43)%;MTT(A):0.1093±0.0074犦,至200μmol/L保护作用最强犤LDH%:(46.10±2.10)%;MTT(A):0.2487±0.0283犦。二苯乙烯甙与细胞预孵育24h,5～400μmol/L二苯     

复智散对神经细胞胞体面积和轴突长度变化的影响(英文)

背景:自制中药复智散经已往的实验证实可延缓大鼠的自然老化过程提示该药可能具有对抗衰老作用。目的:观察复智散培养神经细胞最佳有效浓度对神经母细胞瘤株SHSY5Y细胞形态学改变的影响。设计:重复测量设计。材料:实验于2002-06/2003-04在首都医科大学宣武医院北京脑老化重点实验室完成。自制中药复智散(菖蒲、远至等6味中药组成)由哈尔滨医科大学第一临床医学院神经科王德生教授和上海东方医院神经科徐晓云教授共同组方,淀粉样β蛋白25-35片段,SH-SY5Y神经母细胞瘤株。方法:用不同浓度的复智散孵育神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞,利用噻唑蓝比色法测定细胞存活率,制定量-效关系曲线,寻找最佳药物浓度;6孔板培养细胞分为正常对照组、淀粉样β蛋白25-3525μmol/L组、淀粉样β蛋白25-3525μmol/L+复智散45×10-3g/L组和复智散45×10-3g/L组,孵育24h,观察细胞形态学改变,测定神经细胞的胞体面积和轴突长度。主要观察指标:①各组SH-SY5Y细胞噻唑蓝代谢率的变化。②各组神经细胞胞体面积及轴突长度。结果:①复智散可增进SH-SY5Y细胞的存活,最佳有效浓度为45×10-3g/L。②SH-SY5Y细胞胞体面积和轴突长度:淀粉样β蛋白25-3525μmol/L组明显低于正常对照组犤(505.5±122.36),(599.8±141.25)μm2;(26.0±13.97),(36.5±15.58)μm,(t=3.903,3.447,P=0.000)犦。复智散45×10-3g/L组与淀粉样β蛋白25-3525μmol/L+复智散45×10-3g/L组均明显高于淀粉样β蛋白25-3525μmol/L组犤(918.3±178.34),(896.6±257.14),(505.5±122.36)μm2;(96.8±43.31),(88.3±30.23),(26.0±13.97)μm,(t=10.922,14.172,P=0.000)犦。结论:在淀粉样β蛋白25-35损伤条件下复智散依旧有促进培养神经细胞存活的作用,表现在增进细胞胞体面积的增长和轴突的延伸方面。     

短肽N328—332对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响

目的：分析淀粉样β蛋白前体蛋白N端328—332对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响，在体外寻找具有神经营养作用、促进神经细胞生长的最适浓度，为进一步细胞损伤的保护及药物体内研究提供理论依据。方法：细胞分组：根据实验目的不同，分组处理如下：第一步分为对照组、短肽N328—3322．5，5，10，20，40，80，160μmol／L组。第二步分为对照组、短肽N328—33240μmol／L组。以MTT代谢率测定细胞存活率以筛选肽对神经细胞生长促进的最佳有效浓度。以MTT代谢率测定细胞存活率、细胞计数观察细胞增长情况、乳酸脱氢酶漏出率观察细胞死亡率和WesternBlotting检测P-CREB、Bcl-2表达水平为观察指标，分析短肽N328—332对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响。结果：①从10μmoL／L起，短肽N328—332即对SY5Y细胞生长有促进作用，其最小有效浓度为20μmol／L，40μmol／L促进作用最强，80μmol／L开始作用减弱，故选用40μmol／L浓度作为以下试验浓度。（9短肽N328—33240μmol／L加药组代表细胞存话率的A值高于对照组，组问比较差异有显著性意义（0．9741&;#177;0．0047，0．6001&;#177;0．0019，P〈0．01。⑧短肽N328—33240μmmoL／L加药组乳酸脱氢酶漏出率明显低于对照组，组间比较差异有显著性意义（84．9135&;#177;31．5759，199．6252&;#177;40．7273，P〈0．01。④从接种第4天始，短肽N328—332组SY5Y细胞数增加，与对照组相比，差异有显著性意义（P〈0．05）。⑤短肽N328—33240μmol／L组P-CREB、Bcl-2蛋白表达高于对照组（37424．08&;#177;83．59，34957．24&;#177;78．03，19110．24&;#177;45．80，2761．36&;#177;58．61，P〈0．05）。结论：短肽N328—332对SY5Y细胞具有神经营养作用，40μmol／L浓度，效果优于其他浓度。     

右美托米啶对β-淀粉样肽引起的SH-SY5Y细胞凋亡的影响

目的:探讨右美托米啶(dexmedetomidine,Dex)对β-淀粉样肽(amyloid-βpeptide,Aβ)引起的SH-SY5Y细胞(神经母细胞瘤细胞)凋亡的影响作用。方法:体外培养SH-SY5Y细胞,随机分为4组:阴性对照组,不同浓度Aβ25-35组(2.5、5.0、10.0μmol/L组),观察不同浓度的Aβ25-35对SH-SY5Y细胞的作用。同时进一步观察Dex与Aβ联合应用对SH-SY5Y细胞的作用,实验随机分为5组:阴性对照组,Aβ组(10.0μmol/L Aβ25-35),Aβ+Dex 0.1组(10.0μmol/L Aβ25-35+0.1μmol/L Dex),Aβ+Dex 1.0组(10.0μmol/L Aβ25-35+1.0μmol/LDex)和Aβ+Dex 10.0组(10.0μmol/L Aβ25-35+10.0μmol/L Dex),分别处理24 h后,采用DAPI荧光染色法计数凋亡细胞数,计算凋亡率。结果:Aβ25-35可以促进SH-SY5Y细胞的凋亡,且呈时间和浓度依赖性;而在Aβ25-35中同时加入Dex作用后,细胞凋亡明显受到抑制,细胞凋亡率明显下降(P<0.05),但仍明显高于阴性对照组。结论:Dex可以有效的抑制Aβ25-35引起的SH-SY5Y细胞的凋亡。     

复智散对神经细胞胞体面积和轴突长度变化的影响

背景:自制中药复智散经已往的实验证实可延缓大鼠的自然老化过程,提示该药可能具有对抗衰老作用.目的:观察复智散培养神经细胞最佳有效浓度对神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞形态学改变的影响.设计:重复测量设计.材料:实验于2002-06/2003-04在首都医科大学宣武医院北京脑老化重点实验室完成.自制中药复智散(菖蒲、远至等6味中药组成)由哈尔滨医科大学第一临床医学院神经科王德生教授和上海东方医院神经科徐晓云教授共同组方,淀粉样β蛋白25-35片段,SH-SY5Y神经母细胞瘤株.方法:用不同浓度的复智散孵育神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞,利用噻唑蓝比色法测定细胞存活率,制定量-效关系曲线,寻找最佳药物浓度;6孔板培养细胞分为正常对照组、淀粉样β蛋白25-35 25μmol/L组、淀粉样β蛋白25-35 25μmol/L+复智散45×10-3g/L组和复智散45×10-3g/L组,孵育24 h,观察细胞形态学改变,测定神经细胞的胞体面积和轴突长度.主要观察指标:①各组SH-SY5Y细胞噻唑蓝代谢率的变化.②各组神经细胞胞体面积及轴突长度.结果:①复智散可增进SH-SY5Y细胞的存活,最佳有效浓度为45×10-1g/L.②SH-SY5Y细胞胞体面积和轴突长度:淀粉样β蛋白25-35 25 μmol/L组明显低于正常对照组[(505.5±122.36),(599.8±141.25)μm2;(26.0±13.97),(36.5±15.58)μm,(t=3.903,3.447,P=0.000)].复智散45×10-3 g/L组与淀粉样β蛋白25-35 25 μmol/L+复智散45×1003g/L组均明显高于淀粉样β蛋白25-35 25μmol/L组[(918.3±178.34),(896.6±257.14),(505.5±122.36)μm2;(96.8±43.31),(88.3±30.23),(26.0±13.97)μm,(t=10.922,14.172,P=0.000)].结论:在淀粉样β蛋白25-35损伤条件下复智散依旧有促进培养神经细胞存活的作用,表现在增进细胞胞体面积的增长和轴突的延伸方面.     

何首乌有效成分二苯乙烯甙对神经细胞保护作用的机制

目的：观察2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖甙对两种拟痴呆细胞模型的作用，探讨何首乌主要有效成分二苯乙烯甙神经保护作用的机制。为阐明何首乌及以其为主要成分的中药复方的功效机制提供实验依据。方法：不同浓度二苯乙烯甙(5～400μmol／L)分别与SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞共孵育6，24h，加人工具药β-amyloid25-35(终浓度25μmol／L)孵育24h或500μmol／L过氧化氢孵育2h。MTT法测定细胞存活率，细胞膜损伤测定乳酸脱氢酶漏出率(LDH％)。结果：①50～400μmol／L二苯乙烯甙与细胞预孵育6h可明显拮抗β-amyloid25-35引起的细胞存活率下降，随剂量增加，保护作用上升，至200μmol／L保护作用最强。200，400μmol／L二苯乙烯甙能拮抗β-amyloid25-35引起的细胞乳酸脱氢酶漏出率增高。5～200μmol／L二苯乙烯甙与细胞预孵育24h，可使β-amyloid25-35引起的细胞存活率下降恢复正常。200μmol／L二苯乙烯甙使β-amyloid25-35引起的细胞LDH％增多恢复正常。②5μmol／L二苯乙烯甙与细胞预孵育6h，即可明显拮抗过氧化氢引起的细胞存活率下降及LDH％增多[LDH％：(62．47&;#177;2．43)％；MTT(A)：0.1093&;#177;0.0074]，至200μmol／L保护作用最强[LDH％：(46．10&;#177;2．10)％；MTT(A)：0.2487&;#177;0.0283]。二苯乙烯甙与细胞预孵育24h，5～400μmol／L二苯乙烯甙均能拮抗过氧化氢引起的细胞存活率下降及LDH%增多(P&;lt;0.05)，呈明显剂量依赖关系，且各浓度保护作用均较药物预孵育6h增加，200μmol／L二苯乙烯甙组细胞存活率及LDH％基本恢复正常。结论：二苯乙烯甙对β-淀粉样蛋白和过氧化氢致神经细胞存活率下降及乳酸脱氢酶漏出增多有明显拮抗作用。二苯乙烯甙作为何首乌的主要有效成分对老年性痴呆等神经系统退性行疾病的防治有良好应用前景。     

黄芪提取物的神经营养作用研究

目的:探讨黄芪提取物(EA)的神经营养作用,为EA临床治疗阿尔茨海默病(AD)提供实验依据.方法:体外常规培养小胶质细胞(BV2),收集不同浓度(20、40、80 mg/L)EA作用BV2细胞24 h的条件培养基,酶联免疫吸附(Elisa)法检测胶质源性神经营养因子(GDNF)含量并将条件培养基预处理原代培养的新生小鼠大脑皮层神经元6 h,随后加入Aβ25-35损伤神经元,观察细胞形态学变化并应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率.结果:80mg/LEA处理的BV2细胞条件培养基GDNF释放增加,可使Aβ25-35损伤的皮层神经元出现形态学变化、存活率增加,差异有统计学意义(P<0.05).结论:EA可通过促进GDNF的释放对抗Aβ25-35的毒性而发挥神经保护作用.     

三七总皂甙对淀粉样β25～35肽诱导的NG108-15细胞老年性痴呆模型的保护作用

背景阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)的病理病因虽然还没有完全清楚,但目前认为β-淀粉样肽(amyloid β-peptide,Aβ)是引起AD的胆碱能神经功能紊乱的主要成分.因此,Aβ的产生及其对神经细胞的影响,以及寻找该病的发病机制、治疗方法及其有效的治疗药物成了医药界的研究热点.目的观察三七总皂甙(PNS)对NG108-15细胞老年性痴呆模型的影响,为寻找该病的发病机制提供佐证,为研究和开发中药的新成分提供理论依据.设计体外平行对照实验.单位广西中医学院新药开发中心,广西中医学院生物化学教研室.对象实验在广西中医学院新药开发中心完成.NG108-15细胞中国科学院上海细胞研究所提供.PNS云南玉溪维和制药厂生产.Aβ25～35片段德国Sigma公司产品,批号042K49501.MTT(四甲基噻唑蓝),德国Sigma公司产品,批号020609.cAMP(环一磷酸腺苷)日本ヤマサ酱油株式会社产品,批号00207.胚胎牛血清(FBS)由美国Hyclone公司提供,批号0405.DMEM培养基美国GIBCO公司产品,批号0311.干预NG108-15细胞培养法含50 mL/L胚牛血清、10 g/L HAT、10 g/L青霉素和链霉素(11)的DMEM培养液,置100 mL/L CO2、37℃用的培养箱内培养殖,每隔一天换一次液,4 d传代一次.主要观察指标利用MTT法、细胞计数法和细胞形态学检测法观察PNS对NG108-15细胞存活率和细胞突起的改变.结果PNS能增加Aβ25～35片段神经毒性诱导的NG108-15细胞存活率[增殖状态(311±21)%,分化状态(113±31)%,P＜0.05,F=5.567]、细胞突起率[增殖状态(25.66±3.65)%,分化状态(67.97±2.47)%,P＜0.05,F=6.471]和细胞突起平均长度[增殖状态(25.66±3.09)μm,分化状态(25.66±3.65)μm,P＜0.001,F=12.641].结论PNS具有减轻细胞对Aβ的神经毒性反应和促进细胞突起生长的作用,表明PNS能对老年性痴呆的病理发展有拮抗作用.     

β淀粉样前体蛋白17肽对糖尿病大鼠海马神经细胞线粒体膜电位和凋亡的干预

背景糖尿病大鼠存在学习和记忆障碍,β淀粉样前体蛋白17肽具有改善这一行为的作用.糖尿病是否通过影响海马区神经细胞的膜电位及凋亡导致学习和记忆障碍以及β淀粉样前体蛋白17肽的相关作用机制尚不清楚.目的观察糖尿病大鼠海马区神经细胞的线粒体膜电位和凋亡以及β淀粉样肽前体蛋白干预对其影响.设计完全随机分组设计,对照实验.单位首都医科大学宣武医院北京脑老化研究实验室和河北保定市第一中心医院内分泌科.材料实验中指标测定部分于2002-05/2002-08在解放军总医院仪器测试中心完成.动物造模及干预阶段在首都医科大学附属宣武医院动物室完成.选用Wistar雄性大鼠18只.将大鼠按随机抽签法分为3组,正常对照组,糖尿病模型组,β淀粉样前体蛋白17肽治疗组,每组6只.方法①糖尿病模型组和β淀粉样前体蛋白17肽治疗组大鼠禁食12 h后用pH值4.4链脲佐菌素按60mg/kg腹腔注射诱发糖尿病模型.3 d后测尾静脉血糖＞15 mmol/L为造模成功.正常对照组大鼠不造模.β淀粉样前体蛋白17肽治疗组于背部皮下注射β淀粉样前体蛋白17肽,3.4μg/只,每周3次,共10周.正常对照组及糖尿病组给予等量的生理盐水相同部位注射,每周3次,共10周.②满10周时,将大鼠麻醉,断头取脑后冰浴下取海马组织制备单细胞悬液,采用线粒体膜电位特异性荧光探针JC-1标记线粒体及Annexin-V-FITC&PI双染色技术,进行流式细胞仪上机检测线粒体膜电位和凋亡发生率.③数据间差异比较采用单因素方差分析.主要观察指标各组大鼠海马神经细胞线粒体膜电位和海马单细胞凋亡率比较结果.结果进入结果分析大鼠18只,每组6只.①海马神经细胞线粒体膜电位糖尿病模型组明显低于正常对照组[(551.91±53.36),(809.88±82.41)道,P＜0.01],β淀粉样前体蛋白17肽治疗组高于糖尿病模型组[(705.99±89.92)道,P＜0.05],与正常对照组相近(P=0.146).②海马单细胞凋亡率糖尿病模型组明显高于正常对照组和β淀粉样前体蛋白17肽治疗组[(5.32±1.37)%,(1.03±0.55)%,(2.80±0.92)%,P＜0.01,0.05].结论海马线粒体膜电位下降和细胞的凋亡可能参与糖尿病脑病的发生发展;β淀粉样前体蛋白17肽具有改善这一病理过程的作用.     

APP17肽通过抑制细胞内ROS保护紫外线照射后人皮肤成纤维细胞(英文)

Objective Ultraviolet light (UV) is known to cause photoaging of skin.UV irradiation can damage proliferation capacity and induce collagenase in fibroblasts in the dermis.Many researchers have explored the potential photo-protective agents;however,no ideal agent has been widely accepted.Amyloid precursor protein 17-mer peptide (APP17-mer peptide),an active peptide segment,has been reported to be responsible for the trophic effect in clonal CNS neuronal line,fibroblast cell line and HaCat cells.The aim of this study was to explore the effects of APP17-mer peptide on cultured fibroblasts after ultraviolet irradiation.Methods Human skin fibroblasts were cultured in DMEM medium with or without APP17-mer peptide (concentrations ranging from 20μmol/L,40 μmol/L,to 80μmol/L).The cultured fibroblasts were exposed to a single UV irradiation,and the proliferation activity of fibroblasts was detected by a MTT assay.The expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) mRNA was analyzed quantitatively following real-time RT-PCR.The generation of intracellular reactive oxygen species (ROS) was measured with fluorescent quantitation method.Results A single exposure to UV irradiation depressed proliferation activity of fibroblasts compared with sham-irradiated control (P<0.05).40μmol/L and 80μmol/L APP17-mer peptide increased the cellular proliferation activity in UV irradiated and unirradiated fibroblasts (P<0.05),however,20μmol/L did not show such protective effects (P>0.05).A single exposure of fibroblasts to UV irradiation resulted in 1.78 fold up-regulation of MMP-1 mRNA compared with unirradiated sample (P<0.05),and 40μmol/L and 80μmol/L APP17-mer peptide decreased the expression of MMP-1 mRNA (P<0.05 and P<0.01,respectively).UV irradiation increased generation of ROS in cultured fibroblasts (P<0.05).40μmol/L APP17-mer peptide inhibited the generation of ROS in irradiated fibroblasts.Conclusions APP17-mer peptide can enhance proliferation activity of fibroblasts after exposure to UV irradiation;it can also inhibit MMP-1 mRNA expression and ROS generation induced by UV irradiation.Inhibition of ROS generation after UV irradiation might be involved in the protective mechanism of APP17 peptide on proliferation activity and collagenase induction in UV-irradiated fibroblasts.     

APP17肽调节胰岛素受体底物1在糖尿病小鼠脑内分布及对脑海马区神经元退行性变的作用

背景:胰岛素在脑内通过胰岛素受体底物发挥作用,APP17肽有神经营养功能,可能通过影响胰岛素受体底物改善胰岛素缺乏引起的糖尿病脑病。目的:制备小鼠糖尿病模型熏观察APP17肽对糖尿病小鼠胰岛素受体底物1的影响。设计:随机对照动物实验。单位:首都医科大学基础医学院病理学教研室,宣武医院脑老化研究室。材料:实验于2003-09/10在首都医科大学基础医学院病理学教研室及宣武医院脑老化研究室完成,选择雄性昆明小鼠18只,随机分为正常对照组、糖尿病组和APP17肽治疗组3组,每组6只。方法:①糖尿病组和APP17肽治疗组小鼠按200mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素熏3d后测尾部非禁食血糖熏大于15mmol/L者被认为糖尿病模型建立。②APP17肽治疗组于糖尿病造模2周后皮下注射APP17肽熏每次0.35μg/只熏1次/d熏共注射2周。正常对照组大鼠不干预。③给链脲佐菌素4周后熏处死动物取脑组织进行胰岛素受体底物1免疫组化染色。主要观察指标:各组小鼠脑胰岛素受体底物1阳性细胞形态及分布。结果:18只小鼠全部进入结果分析。①糖尿病组胰岛素受体底物1阳性反应细胞广泛分布于皮质、海马、丘脑、下丘脑等部位熏而正常对照组及APP17肽治疗组仅在皮质、海马见有阳性反应细胞熏且着色淡。②糖尿病组、正常对照组及APP17肽治疗组脑海马胰岛素受体底物1免疫组化阳性反应细胞数分别为(28.7±1.5),(9.2±1.5),(10.1±1.4)个/10倍物镜,糖尿病组高于其他两组(P<0.001)。结论:糖尿病小鼠脑内多个区域的神经元存在较多的胰岛素受体底物1阳性细胞熏APP17肽能使胰岛素受体底物1阳性反应细胞出现的部位和数量正常化熏从而改善糖尿病小鼠海马神经元的退行性变。     

胰岛素样生长因子-1受体在糖尿病小鼠脑内的分布

目的:观察糖尿病小鼠脑内胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)的分布及APP17肽对其分布的影响,为多肽对糖尿病脑病和AD的治疗提供理论依据。方法:雄性昆明小鼠体质量28～32g,鼠龄8周,共18只。随机分为3组,正常对照组(C组)、糖尿病对照组(DM组)和APP17肽治疗组(APP17peptide+DM组)。用链脲佐菌素诱发小鼠糖尿病模型,并皮下注射APP17肽(β-淀粉样肽前体蛋白319～335)给予治疗。4周后取脑组织进行IGF-1R免疫组化染色。结果:糖尿病组IGF-1R阳性反应细胞广泛分布于皮质、海马、丘脑、下丘脑等部位,而正常对照组及APP17肽治疗组仅在皮质、海马可见阳性反应细胞,DM组与C组、APP17peptide+DM组海马阳性反应细胞数分别为(22.3±1.7),(14.5±1.4),(15.2±1.1)个/10倍物镜。后两组与DM组比较差异有显著性意义(F=0.1,0.2,P<0.001)。C组与DM+APP17peptide组小鼠海马IGF-1R免疫组化红、绿、蓝像素值分别为86±8,101±6,130±5(F=3.3,0.6,0.5,P<0.01)和84±6,102±6,132±6(F=1.2,6.0,7.0,P<0.01),且着色淡。结论:糖尿病小鼠脑内多个区域存在较多的IGF-1R阳性神经元,而APP17肽能使IGF-1R阳性反应细胞出现的部位和数量正常化。     

心肺复苏大鼠海马神经元磷脂酰肌醇-3-激酶、蛋白激酶B和磷酸化cAMP应答元件结合蛋白表达的变化及APP17肽的影响

目的 探讨心肺复苏后大鼠海马神经元磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)、磷酸化cAMP应答元件结合蛋白(phosphorylation of cAMP respouse element binding protein,p-CREB)表达的变化,以及APP17肽对它们的影响.方法 实验地点在宣武医院神经变性病学重点实验室.雄性Wistar大鼠21只,随机分3组,每组7只:假手术对照组(A组)、心肺复苏组(B组)、心肺复苏+APP17肽组(C组).自主呼吸循环恢复(return of spontaneous circulation,ROSC)标准为心电图出现正常的QRS波群,心室内压≥60 mmHg,持续10 min以上;夹闭气管制作大鼠心跳呼吸停止模型,行心肺复苏.当大鼠出现ROSC时,复苏组静脉注射生理盐水;APP17肽组静脉注射APP17肽10μg·(300 g)~(-1).对照组行假手术,静脉注射生理盐水.维持生命体征至2 h,断头取脑,行冰冻切片.应用免疫组化法观察3组大鼠复苏2 h后海马神经元PI3K,PKB,p-CREB表达情况;三组中各取1只大鼠于ROSC后2 h,分离海马;应用Western-blot方法测定海马神经元PKB,p-CREB蛋白含量.数据以均数±标准差((x)±s)表示,组间数据用方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义.结果 免疫组化法显示:B组PI3K阳性细胞表达为(2.75±1.80),略高于A组(2.53±1.53),差异没有统计学意义;而C组为(5.85±2.83),较B组增加,差异具有统计学意义(P<0.01).B组PKB和p-CREB阳性细胞分别较A组明显减少[(2.45±1.36)vs.(5.22±2.50),(P<0.05);(2.41±1.11)vs.(8.31±3.02),P<0.01];C组PKB和p-CREB阳性细胞分别较B组增高[(9.66±4.32)vs.(2.45±1.36),P<0.01;(14.18±3.96)vs.(2.41±1.11),P<0.01].Western-blot法测定PKB,p-CREB蛋白含量B组较A组明显减少;C组较B组明显增加.结论 心肺复苏大鼠ROSC 2 h海马神经元PKB,p-CREB表达降低,APP17肽能恢复神经元PI3K,PKB,p-CREB的表达,对心肺复苏后海马神经元损伤有保护作用.     

APP17肽对血管性痴呆大鼠行为学及额叶Bcl-2,Bax蛋白表达的影响

目的研究APP17肽对血管性痴呆大鼠行为学及额叶Bcl-2，Bax蛋白表达的影响。方法采用双侧颈总动脉结扎方法制备前脑缺血致血管性痴呆大鼠模型，并观察APP17肽的保护作用，采用Morris水迷宫检测行为学，免疫组织化学检测额叶Bcl-2，Bax蛋白表达。结果手术组与对照组相比认知能力明显下降（P＜0．01），Bcl-2、Bax蛋白表达增加（P＜0．01），治疗组与手术组相比认知能力改善（P＜0．01），Bcl-2蛋白表达明显增加（P＜0．01），Bax蛋白表达明显减少（P＜0．01）。结论APP17肽可以通过调节Bcl-2、Bax蛋白表达来抑制细胞凋亡，改善血管性痴呆大鼠的认知能力。     

复智散对淀粉样β蛋白25-35神经细胞毒性效应的影响及其机制

.背景淀粉样β蛋白是老年斑的核心成分,其毒性片段淀粉样β蛋白25-35近年广泛用于实验研究中.已往研究表明自制中药复智散可促进培养神经细胞存活,可能具备治疗阿尔茨海默病的效用.目的研究复智散对抗淀粉样β蛋白25-35对培养神经细胞的毒性作用及其发挥这一作用的可能途径.设计以细胞为研究对象,重复测量设计.单位一所大学医院的神经内科和一所大学医院的脑老化重点实验室.材料实验于2002-06/2003-04在宣武医院北京脑老化重点实验室完成.人多巴胺能神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞.淀粉样β蛋白25-35片段.中药复智散文火煎制,留取上清冷冻抽干配成浓度为0.5 g/mL的贮存液备用.抗体cAMP应答元件结合蛋白、B淋巴细胞白血病-2基因产物中的Bcl-2、细胞色素C由宣武医院北京脑老化研究实验室制备.方法用不同剂量的淀粉样β蛋白25-35单独或与复智散共同孵育SH-SY5Y细胞,与空白对照组相比,测定在不同孵育条件下培养神经细胞的噻唑蓝代谢率.利用Western-blot法测定复智散单独孵育、淀粉样β蛋白25-35单独孵育及两者共同孵育条件下与空白对照相比蛋白质表达的变化.主要观察指标各实验组与空白对照组相比的噻唑蓝代谢率.与神经细胞存活及死亡相关蛋白cAMP应答元件结合蛋白,Bcl-2及细胞色素C的表达水平.结果复智散单独孵育可使SH-SY5Y细胞存活率增加11.4%,与淀粉样β蛋白25-35共同孵育时培养神经细胞存活率较淀粉样β蛋白25-35单独孵育明显提高.淀粉样β蛋白25-35损伤组cAMP应答元件结合蛋白和Bcl-2表达减少,复智散组这两种蛋白质表达增加.淀粉样β蛋白25-35损伤组胞浆内细胞色素C表达增加,复智散孵育下该蛋白质表达水平下降.结论复智散有促进培养神经细胞存活作用,在淀粉样β蛋白25-35损伤条件下该种保护作用依旧存在.复智散可能通过影响细胞存活/死亡相关蛋白质的表达发挥这一效应.     

NOS及NO在介导Aβ神经毒性和阿尔茨海默病发病机制中的作用

目的观察诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂胍氨酸(AG)及神经元型一氧化氮合酶(nNOS)抑制剂7-硝基吲哚(7-NI)对β淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)在体神经毒性的干预,进一步探讨一氧化氮合酶(NOS)及一氧化氮(NO)在Aβ神经毒性和Alzheimer病(AD)发病机制中的介导作用。方法雄性SD大鼠35只,随机分为正常对照,生理盐水注射,Aβ1-40注射,AG+Aβ1-40,7-NI+Aβ1-40,花生油(Peanutoil,PO)+Aβ1-40、生理盐水+Aβ1-40共7组,每组5只。观察各组大鼠的Y迷宫学习记忆作业及局部神经元损伤情况。结果Aβ1-40海马组大鼠Y迷宫作业的获得和再现尝试次数均显著增加,分别是(27.8±2.3)和(19.7±4.7)次,与前两组比较有显著性意义(F获得=146.438,P获得=0.000;F再现=113.654,P再现=0.000)。海马齿状回颗粒细胞背侧带受损长度为(1.93±0.26)mm,局部胶质细胞反应明显。AG可逆转Aβ1-40导致的学习记忆和神经元损伤,其获得和再现尝试次数分别为(14.6±4.9)次和(8.5±2.1)次,与Aβ1-40注射组比较明显减少(F获得=146.438,P获得=0.000;F再现=113.654,P再现=0.000)。细胞带受损长度为(0.41±0.21)mm,胶质细胞反应减轻。7-NI则无干预作用。结论iNOS/NO参与了在体条件下对Aβ神经毒性的介导,在AD发病机制中具有重要作用。     

APP17肽改善糖尿病小鼠脑组织Tau蛋白过度磷酸化

背景:Tau蛋白的过度磷酸化是痴呆的一个因素,国外学者研究发现APP17肽对其可能产生影响。目的:观察注射APP17肽后糖尿病小鼠Tau蛋白Ser202/Thr205磷酸化的变化。设计:随机对照实验。单位:首都医科大学病理学教研室,首都医科大学宣武医院脑老化研究室。材料:实验在首都医科大学病理学教研室、北京市宣武医院脑老化研究室完成。选用8周龄雄性昆明小鼠18只,体质量28～32g,随机分为3组:对照组,糖尿病组,APP17肽治疗组,每组6只小鼠。方法:用链脲佐菌素选择性地破坏胰岛β-细胞,诱发小鼠糖尿病模型,并皮下注射APP17肽给予治疗。4周后取脑组织进行AT-8(抗Ser202/Thr205特异单抗)免疫组化染色。主要观察指标:①形态学观察。②AT-8分布。③免疫组化染色定量分析。结果:糖尿病组AT-8阳性反应细胞广泛分布于压后颗粒皮层、海马、丘脑、下丘脑等部位,而对照组及APP17肽治疗组仅在压后颗粒皮层、海马可见阳性反应细胞,且着色淡。结论:糖尿病脑内多个区域的神经元可能存在较多的AT-8阳性细胞,而APP17肽可能使AT-8阳性反应细胞出现的部位和数量正常化。