脐带间充质干细胞转染趋化性基因的初步分析

目的研究人脐带间充质干细胞转染外源基因后的细胞生物学特性。方法培养人脐带间充质干细胞并免疫荧光鉴定。用脂质体法转染pEGFP-C1-SDF-1转入3代的HUCMSCs细胞,应用抗生素G418筛选2周后挑取转基因抗性细胞集落扩大培养。激光共聚焦显微镜下观察转染的细胞。结果培养的细胞经免疫荧光检测为HUCMSCs,pEGFP-C1-SDF-1表达载体转染到MSCs,24h后细胞免疫荧光检测可见SDF-1融合蛋白表达。结论研究结果为建立和优化HUCM-SCs细胞转染外源基因平台奠定了工作基础。     

构建人热休克蛋白70基因重组腺病毒载体及鉴定

背景：腺病毒载体作为低毒高效的基因载体已被广泛应用,但是人热休克蛋白70基因腺病毒载体较为少见。 目的：构建重组人热休克蛋白70基因的腺病毒载体,鉴定外源基因在真核细胞中的良好表达。 方法：采用AdMax腺病毒系统将外源基因人热休克蛋白70基因重组入腺病毒载体中,转染人胚肾293细胞并重组包装出毒,检测外源基因的表达和病毒滴度。 结果与结论：观察转染后的人胚肾293细胞出现明显细胞病变效应后,收获并纯化重组病毒;荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况良好,Western blot检测人热休克蛋白70蛋白表达良好,收获病毒的滴度为1×1011 efu/mL,证明实验已成功构建携带人热休克蛋白70基因的重组腺病毒载体。     

重组外源性人热休克蛋白70基因真核表达载体的构建及鉴定

背景：热休克蛋白70的肿瘤免疫作用近年来受到国内外学者的广泛关注,然而目前常用的诱导内源性热休克蛋白70表达的方法,如热应激、缺血预处理等均存在一些弊端。 目的：拟构建携带并正确表达外源性人热休克蛋白70基因的重组真核表达载体。 方法：外源性热休克蛋白70基因连接入真核表达载体pDC315-EGFP中,转化大肠杆菌感受态细胞,重组真核表达载体外源基因测序及PCR检测鉴定阳性克隆后转染人胚肾293细胞,荧光显微镜及western blot鉴定外源基因在细胞中的表达。 结果与结论：经PCR和测序证实外源性人热休克蛋白70基因正确重组入真核表达载体pDC315-EGFP,转染293细胞后荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白GFP的表达,Western blot检测到热休克蛋白70在293细胞中有效表达。     

神经干细胞体外长期培养和外源基因表达

目的：探讨胚胎大鼠神经干细胞的体外培养条件及外源基因的表达效率。方法：从胚胎大鼠脑皮质中机械分离细胞，应用N2培养基进行培养和扩增，采用免疫组织化学方法进行鉴定，应用Ad5βgal重组腺病毒载体检测神经干细胞表达外源基因的能力。结果：从胚胎大鼠的大脑皮质中成功分离培养出神经干细胞，在悬浮状态下培养形成典型的神经球并表达波形蛋白和巢蛋白。近100％的细胞可被Ad5βgal基因感染并表达lacZ基因。细胞可用机械方法传代，常规冻融和复苏，体外长期培养可达3个月。结论：神经干细胞可在体外长期稳定培养和传代，能表达βgal外源基因，是细胞治疗和基因治疗的良好载体。     

鸡胚胎干细胞分离方法和培养体系的优化

背景：胚胎干细胞是从动物早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的具有发育全能性的一种未分化的无限增殖细胞系。而鸡胚胎干细胞则是从X期鸡胚的胚盘分离而来。 目的：优化鸡胚胎干细胞分离方法和离体培养体系。 方法：采用滤纸纸环-发环的方法从X期鸡胚分离胚盘细胞,并采用STO细胞作为饲养层和大鼠肝细胞(BRL)条件培养基(CM)+细胞因子作为离体培养体系对分离的胚盘细胞进行培养。 结果与结论：滤纸纸环-发环法获得的完整胚盘率为75%~85%,克隆形成率约为50%。BRL-CM+饲养层培养体系,鸡胚胎干细胞可传至7代,而BRL-CM+饲养层+细胞因子培养体系,鸡胚胎干细胞可传至25代。分离到的鸡胚胎干细胞,经碱性磷酸酶染色、SSEA-1染色鉴定,表明鸡胚胎干细胞处于未分化状态。提示,实验不仅优化了鸡胚胎的分离方法,获得完整且杂质少的胚盘,而且进一步优化了鸡胚胎干细胞体外培养体系。     

基因枪转人碱性成纤维细胞生长因子基因促进深Ⅱ度烧伤创面的愈合

背景: 大量的体内和体外实验已证实,碱性成纤维细胞生长因子对不同组织和细胞具有广泛作用,可加快创面愈合进程。 目的：观察基因枪转人碱性成纤维细胞生长因子基因促进深Ⅱ度烧伤创面愈合的效果和可行性。 设计、时间及地点：完全随机设计,观察实验,于2007-12/2008-10在解放军第二军医大学长海医院全军烧伤中心实验室完成。 材料： SD清洁级大鼠,体质量200~250 g,雌雄不拘。 方法：将天然人碱性成纤维细胞生长因子基因重组优化,以pCI-neo为载体构建重组人碱性成纤维细胞生长因子基因高效真核表达载体pCI-neo-bFGF,并转染人胚肾细胞293T细胞,转染后以dot blot 和western blot检测碱性成纤维细胞生长因子的表达。利用基因枪技术对SD大鼠深Ⅱ度烧伤创面模型进行转基因,以转染pCI-neo-bFGF为实验组,以转染空载体pCI-neo为对照组。 主要观察指标：记录创面愈合时间,在转基因后24 h,48 h,96 h,7 d,10 d和14 d测定创面组织羟脯氨酸和胶原酶Ⅰ水平,评价创面愈合情况。 结果：重组构建的pCI-neo-bFGF经转染人胚肾细胞293T细胞,dot blot和western blot检测结果显示,构建的pCI-neo-bFGF表达载体可表达人碱性成纤维细胞生长因子,荧光显微镜下合成基因的表达水平明显高于天然基因表达;基因枪转基因实验结果显示,实验组创面愈合时间为(13.00±1.31) d,对照组为(14.75±1.28) d,两组相比较差异有显著性意义(P < 0.05);两组羟脯氨酸及胶原酶Ⅰ水平均于基因枪转染后48 h即伤后第5天达到高峰,随后逐渐下降至一定水平后维持,实验组各时间点羟脯氨酸水平均高于对照组(P < 0.05,P < 0.01);实验组转基因后48 h和96 h胶原酶Ⅰ水平明显高于对照组(P < 0.01)。 结论：基因枪转人碱性成纤维细胞生长因子基因可以缩短创面愈合时间,增加创面愈合期间组织羟脯氨酸和胶原酶Ⅰ水平,加快深Ⅱ度烧伤创面愈合进程。     

胚胎干细胞及在生殖医学中的应用

背景：有报道胚胎干细胞体外培养可分化为原始生殖细胞并进一步生成配子,受精后发育为胚泡,并产生成活的子代。 目的：阐述近年胚胎干细胞在生殖医学中的研究进展。 方法：应用计算机检索清华同方系列数据库2000/2009有关生殖细胞、中药的相关研究文章,检索词：生殖细胞、中药,并限定文章语言种类为中文;同时应用计算机检索Pubmed数据库1998/2009相关文章,检索词：embryonic stem cells,stem cells,germ cells,oocyte,sperm,differentiation,限定文章语言种类为“English”。 结果与结论：胚胎干细胞在体外分化受到内、外源因素的影响,可以诱导分化为精子和卵母细胞,是研究哺乳动物早期胚胎发育的理想模型;目前研究体外培养原始生殖细胞和配子是可行的,但体外培养生殖细胞的特性和功能仍不确定,要应用于临床需进一步确定其安全性和有效性。     

壳聚糖季铵盐作为基因递送载体的初步研究**

背景：非病毒载体因其安全性好而在基因治疗领域赢得了广泛的关注,各种各样的非病毒载体处在不断的研究中,壳聚糖季铵盐作为一种新的生物材料,同样也具有作为基因递送载体的潜质。 目的：考察壳聚糖季铵盐体外基因转染活性,寻求一种新的非病毒基因载体递送系统。 设计、时间及单位：对比观察实验,于2008-04/12在浙江省医学科学院生物工程所完成。 材料：质粒pcDNA3.1-EGFP为浙江省医学科学院生物工程实验室保存。以3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵作为改性剂制备壳聚糖季铵盐,用复凝聚法制备载基因纳米粒。 方法：凝胶阻滞实验分析壳聚糖季铵盐包裹质粒的能力,DNase I的保护实验分析载基因纳米粒的抵抗核酸酶降解的能力,体外基因转染实验评价纳米粒的体外转染活性,用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪测定转染结果。通过考察转染液中有无牛血清和递送不同剂量的基因对转染效率的影响,寻求本递送系统较好的转染条件。另外,用MTT法测定壳聚糖季铵盐的细胞毒性。 主要观察指标：壳聚糖季铵盐和pcDNA 3.1-EGFP以何种比例结合形成的纳米粒、转染液中有无牛血清,质粒的量为多少时对人胚肾T细胞的转染效率是最高的;不同浓度的壳聚糖季铵盐对细胞生长的影响。 结果：壳聚糖季铵盐纳米粒能转入人胚肾T细胞,虽然转染效率略逊于聚乙烯亚胺,但是细胞毒性明显小于聚乙烯亚胺。壳聚糖季铵盐纳米粒转染细胞72 h后效率较高,经综合分析,当pcDNA质量为2 μg,壳聚糖季铵盐和pcDNA以质量比为5结合形成的纳米粒,在无血清条件下对人胚肾T细胞进行转染,转染效率是最高的。 结论：壳聚糖季铵盐纳米粒能将基因递送到细胞内,并且报告基因能在细胞内表达。因此,壳聚糖季铵盐用做基因递送的载体系统值得进一步的研究。     

小鼠IL-10重组腺病毒载体的构建及对树突状细胞的基因修饰

目的 构建mIL-10腺病毒重组体Ad-mIL-10,获得mIL-10基因修饰的树突状细胞。方法 根据IL-10基因序列及腺病毒载体的多克隆位点,合成包括酶切位点的基因序列,连接到pMD18-T载体并测序鉴定。用基因工程的方法将小鼠IL-10基因克隆到BD Adeno-XTM腺病毒载体,于人胚肾293细胞中包装、扩增病毒并测定IL-10蛋白表达,转染到体外培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞。结果 成功构建小鼠Ad-mIL-10重组腺病毒载体并高包装、扩增成功,测定高表达IL-10蛋白,体外成功培养小鼠骨髓来源的小鼠树突状细胞并顺利转染Ad-mIL-10。结论 用基因工程方法构建小鼠Ad-mIL-10重组腺病毒载体并转染小鼠骨髓来源的树突状细胞是可行的,为进行相关的基因治疗的可能性提供了更充足的理论依据。     

人胚胎原始生殖细胞移植治疗大鼠急性肝损伤**☆

目的：胚胎原始生殖细胞能以原始胚胎状态无限增殖，并可通过异体移植或适宜的体外环境自然分化为胚胎生殖层。实验拟进一步观察体外培养的胚胎原始生殖细胞对急性肝损伤大鼠的治疗效果，及其能否在大鼠体内分化为肝细胞。 方法：实验于2003-09/2005-05在中南大学肝病研究所完成。①细胞及动物：经中南大学湘雅二医院医学伦理委员会批准，取孕4~12周流产人胚胎，其双亲3代内无遗传性疾病，孕妇对流产胚胎用于实验均签署知情同意书。清洁级健康成年SD大鼠50只，随机数字表法分为5组：培养基对照组、单纯人胚原始生殖细胞组、人胚原始生殖细胞+环磷酰胺组、单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组，10只/组。另选取健康成年SD孕鼠4只用于分离鼠胚原始生殖细胞。动物均由中南大学湘雅二医院动物实验中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：从人胚胎中分离出原始生殖嵴组织，悬浮培养获取人胚原始生殖细胞，用含15%胎牛血清的高糖DMEM基础培养基调节细胞浓度至1×108 L-1。取SD孕鼠胚胎分离生殖嵴，消化离心培养鼠胚原始生殖细胞，浓度1×108 L-1。各组大鼠均于腹腔内注射D-氨基半乳糖建立急性肝损伤模型，造模后48 h，培养基对照组自尾静脉输注基础培养基，其余4组给予对应细胞悬液及免疫抑制剂环磷酰胺。③实验评估：从细胞形态、表面标记及体外分化等方面检测人胚原始生殖细胞的生物学特性；比较各组大鼠肝功能、增殖细胞核抗原阳性率、糖原染色阳性率、肝脏病理改变；检测各组大鼠肝脏病理切片中人白蛋白、甲胎蛋白的表达。 结果：①人胚原始生殖细胞的生物学特性：培养1 d后单个原始生殖细胞形成细胞集落，以后集落逐渐增大并隆起，形成鸟巢状，周边界限清晰，内部细胞排列紧密。传代后原始生殖细胞集落呈自发分化趋势，周边出现成纤维样细胞，最后分化为梭形细胞、多边形细胞等。原代至第3代未分化的人胚原始生殖细胞集落碱性磷酸酶染色均呈阳性，分化的细胞及成纤维细胞呈阴性。②肝功能检测：细胞输注前各组丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素水平均基本相似(t=0.361~1.183，P均 > 0.05)。输注后7 d与培养基对照组比较，单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组上述3项指标水平均明显降低(t=2.532~8.361，P均 < 0.05)；后两组间比较差异无显著性意义(t=0.340~1.712，P均 > 0.05)。③增殖细胞核抗原阳性率：细胞输注后7d与培养基对照组比较，单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组的增殖细胞核抗原阳性率均明显升高（t=9.020~10.747，P均 < 0.001）；后两组间比较差异无显著性意义(t=0.752，P=0.462)。④糖原染色：细胞输注后7 d，培养基对照组着色相对浅淡，呈细颗粒状，；单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组着色相对深粗，呈斑块状聚集。⑤病理检测：细胞输注后7 d，培养基对照组肝索、肝窦结构排列欠规则，坏死区可见少量肝细胞再生，汇管区有大量炎症细胞浸润；单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组各项病理情况均显著改善。⑥大鼠肝组织人白蛋白、甲胎蛋白的表达：细胞输注后14，21 d，单纯人胚原始生殖细胞组、人胚原始生殖细胞+环磷酰胺组表达人白蛋白及甲胎蛋白阳性细胞，培养基对照组未见表达。 结论：①胚胎原始生殖细胞移植有利于激发急性肝损伤大鼠肝细胞的增殖，改善肝功能，加速受损肝细胞的病理修复。②胚胎原始生殖细胞可在受体肝脏组织中生存，并分化为具有合成白蛋白及甲胎蛋白功能的肝细胞样细胞。