ANGPTL4 基因对不同肝癌细胞株生长的影响

目的:观察血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like 4, ANGPTL4 )基因对不同肝癌细胞株生长的影响. 方法:用RT-PCR和Western印迹法检测9种不同肝癌细胞及永生化肝细胞中ANGPTL4的表达水平;选择ANGPTL4低表达的Huh-7、MHCC-LM3 和中度表达的MHCC-97L共3个肝癌细胞株,以pEGFP-N1质粒为载体,用Lipofectamine 2000脂质体转染 ANGPTL4 基因,用G418筛选结合FCM法对转染阳性细胞进行筛选,建立过表达ANGPTL4的稳定细胞株.制备细胞芯片,用 Ki-67 荧光免疫细胞化学技术检测3个稳定细胞株的体外增殖率,用裸小鼠体内成瘤实验观察ANGPTL4对这3个细胞株在裸小鼠体内生长的影响.结果:ANGPTL4 mRNA在未转染肝癌细胞Huh-7和MHCC-LM3中低表达,在MHCC-97L细胞中中度表达,在Hep3B细胞中高表达.细胞芯片检测结果表明,与空载体组相比,稳定过表达ANGPTL4的Huh-7细胞体外增殖率较低( P=0.000 74),而稳定过表达ANGPTL4的MHCC-LM3( P =0.073 08)和MHCC-97L( P=0.011 52)细胞株的体外增殖率则较高.体内实验证实,ANGPTL4可以明显抑制Huh-7细胞的裸鼠体内成瘤( P ＝0.001 10),而促进MHCC-LM3细胞( P＝0.057 50) 和MHCC-97L细胞( P＝0.018 91)的裸鼠体内成瘤.结论:ANGPTL 4对不同肝癌细胞株的生长有不同影响,而对同一种细胞株体内和体外生长的影响基本一致.     

Notch信号通路对肝癌细胞迁移的调控机制研究

目的：探讨Notch信号通路对肝癌细胞迁移的调控机制。方法体外培养HepG2、MHCC97H、Huh-7肝癌细胞株和HL-7702正常肝细胞株,Transwell小室检测细胞迁移能力,蛋白免疫印迹法检测各细胞系Snail、E-cadherin蛋白表达水平,实时定量RT-PCR检测Snail、E-cadherin mRNA表达水平;采用DAPT阻断Notch信号通路,比较其对细胞迁移能力和Snail、E-cadherin蛋白及mRNA表达水平的影响。结果 HepG2、MHCC97H、Huh-7细胞株迁移能力高于HL-7702细胞株（P﹤0.05）,HepG2、MHCC97H、Huh-7肝癌细胞株迁移能力比较差异无统计学意义（P﹥0.05）。HepG2、MHCC97H、Huh-7细胞Snail蛋白及mRNA高于HL-7702细胞,E-cadherin蛋白及mRNA表达低于HL-7702细胞（P﹤0.05）,HepG2、MHCC97H、Huh-7细胞间Snail、E-cadherin蛋白及mRNA表达差异无统计学意义（P﹥0.05）。HepG2、MHCC97H、Huh-7细胞经DAPT处理后迁移能力低于未经DAPT处理的细胞株（P﹤0.05）,HL-7702细胞DAPT处理与未经DAPT处理迁移能力比较差异无统计学意义（P﹥0.05）。DAPT处理后,HepG2、MHCC97H、Huh-7细胞株Snail蛋白及mRNA表达水平降低,E-cadherin蛋白及mRNA表达增加,与未经DAPT处理的细胞株比较差异具有统计学意义（P﹤0.05）,HepG2、MHCC97H、Huh-7细胞间Snail、E-cadherin蛋白及mRNA表达差异无统计学意义（P﹥0.05）。结论 Notch信号通路可能是通过调控Snail、E-cad-herin通路调控肝癌细胞的迁移过程。     

CTHRC1基因在人肝癌中高表达并促进MHCC97L肝癌细胞的转移

目的：分析CTHRC1基因在人肝癌组织和肝癌细胞株中的表达情况及其对MHCC97L肝癌细胞转移能力的影响。方法：采用northem blot、RT—PCR和荧光定量PCR分析人肝癌组织和肝癌细胞株中CTHRC1 mRNA水平。构建包含CTHRC1基因编码框的真核表达载体pCMV-3Tag-CTHRC1，通过体外实验分析CTHRC1在MHCC97L细胞中过表达对MHCC97L细胞迁移、侵袭等转移能力的影响。结果：Northern blot、RT—PCR和荧光定量PCR结果显示，14例肝癌患者中11例存在癌组织CTHRC1 mRNA表达水平高于癌旁组织，8种肝癌细胞株中5种肝癌细胞株存在着CTHRC1的高表达。当CTHRC1过表达后，MHCC97L细胞的迁移及侵袭能力显著增强（P〈0．001）。结论：CTHRC1基因在人肝癌组织和人肝癌细胞株中存在着高表达，同时该基因可使肝癌细胞MHCC97L的转移能力明显增强，提示CTHRC1基因可能在肿瘤转移中起重要作用。     

糖基因和N-糖链介导入肝癌细胞转移及耐药性的研究

目的通过研究糖基因、N-糖链在人肝癌高、低转移细胞株MHCC97-H和MHCC97-L中的差异表达,明确二者与肝癌转移及其耐药的相关性,确证肝癌转移诊断及抗肿瘤治疗新靶点。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR）分析糖基因,异硫氰酸荧光素（FITC）-凝集素结合分析糖链的特征;通过RNA干扰技术干预差异表达的糖基因,检测干扰前后MHCC97-H细胞的体外侵袭力及其药物敏感性。进一步修饰N-糖基化（衣霉素和糖基肽酶处理）,检On,0N-糖基化修饰前后MHCC97-H细胞的体外侵袭力、体内成瘤性及药物敏感性。结果糖基因、N-糖链在人肝癌高、低转移细胞株中表达差异有统计学意义;通过特异性RNA干扰技术使MHCC97-H细胞中N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（MGAT5）表达下调时,该细胞在体外的侵袭能力下降,药物敏感性增强（t=7．312,P〈0．05）。MHCC97．H细胞经N．糖基化修饰后在体外的侵袭能力下降,体内成瘤性受到抑制,药物敏感性增强。结论人肝癌细胞中糖基因、糖蛋白N-糖链的差异表达与肿瘤细胞的转移及其耐药密切相关,可为肿瘤化疗提供新靶点。     

CHST13抑制肝癌细胞侵袭能力的研究

目的 通过研究磺基转移酶CHST13在人肝癌高转移细胞株MHCC97-H和人肝癌低转移细胞株MHCC97-L中的差异表达,明确其与肝癌转移的相关性,从而证实肝癌转移诊断及抗肿瘤治疗新靶点.方法 采用实时PCR、Western blot分析磺基转移酶CHST13在人肝癌高、低转移细胞株的差异表达,通过RNA干扰技术干预CHST13基因,检测干扰前后MHCC97-L细胞的体外侵袭力及体内成瘤性.结果 CHST13在人肝癌高、低转移细胞株中表达具有明显差异;下调MHCC97-L细胞中CHST13基因表达后,穿过基底膜的细胞数量[（30±3）个]明显多于未处理组[（14±2）个],体外侵袭力显著增强（t=2.8,P=0.005）;相对于正常细胞[（0.5±0.06）g],干扰后细胞的肿瘤平均重量[（0.9±0.10）g]明显增大,体内成瘤性明显提高（t=2.5,P=0.01）.结论 磺基转移酶CHST13与肝癌细胞的侵袭、成瘤性密切相关,其有望成为肝癌临床治疗的新靶点.     

SOCS3对人肝癌MHCC97-H细胞上皮间质转化的影响

目的:研究细胞因子信号转导抑制因子3（suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3）对人肝癌细胞MHCC97-H细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响。方法:体外培养人肝癌高转移细胞株MHCC97-H,应用25 nmol/L的SOCS3 siRNA瞬时转染细胞（阳性转染组）,同时使用空质粒转染细胞（阴性对照组）。24 h后用荧光显微镜观察转染后的细胞荧光表达情况。48 h后,应用倒置显微镜观察细胞形态变化情况,采用细胞免疫荧光染色法检测MHCC97-H 细胞中EMT的上皮标志物E-cadherin和间质标志物α-SMA的表达情况。结果:与阴性对照组相比,SOCS3 siRNA成功转染的MHCC97-H细胞显示出绿色荧光。SOCS3 siRNA瞬时转染后肝癌细胞从呈现上皮样特征的鹅卵石形态,向具有间质细胞形态的纺锤形和梭形特征发生转变。免疫细胞荧光检测E-cadherin和α-SMA的表达结果显示,SOCS3 siRNA阳性转染组上皮标志物E-cadherin的免疫荧光表达明显减弱,而细胞的间质标志物α-SMA的免疫荧光表达显著增强。结论:本实验研究显示,下调肝癌细胞的SOCS3表达,其通过改变细胞的EMT表型分子及表型特征,促进肝癌的增殖,提示SOCS3可能在肝癌细胞的EMT中发挥着重要作用。调控SOCS3表达水平可以抑制肝癌的发生发展,为临床防治肝癌提供了新思路。     

siRNA沉默Livin基因表达在抑制裸鼠肝癌生长中的作用研究

目的目的应用RNA干扰技术抑制人肝癌细胞株MHCC97H中凋亡抑制因子Livin的表达,研究Livin基因在抑制裸鼠肝癌细胞移植瘤生长中的作用。方法设计针对Livin基因目标序列的siRNA,将其经脂质体Lipofectamine~(TM)2000转染至肝癌细胞株MHCC97H细胞,采用RT-PCR、Westernblot方法检测转染后的MHCC97H细胞中Livin基因的mRNA和蛋白质表达。通过建立裸鼠的荧光素酶(Luciferase)标记的MHCC97H肝癌细胞移植瘤模型,监测肿瘤体积、重量,通过活体成像技术观察siRNA注射治疗移植瘤的效果。结果在Livin-siRNA转染后的MHCC97H细胞中,Livin基因的mRNA和蛋白质表达显著下降(P0.05),siRNA注射治疗移植瘤后,肿瘤重量、体积及荧光素酶信号均显著性下降(P0.05)。结论通过RNA干扰技术阻断MHCC97H细胞中Livin的表达,可抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长,提示Livin基因在肝癌的发生、发展过程中起重要作用。     

反义皮层肌动蛋白基因对肝癌细胞功能影响的研究

目的:将反义的皮层肌动蛋白(cortactin)基因转染入人肝癌细胞中,观察其表达效果及其对细胞本身的影响以及该基因在肝癌细胞转移中的作用。方法:Trizol试剂法提取体外培养的人肝癌高转移细胞株MHCC97总RNA,经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的片段,PCR产物及真核表达载体分别双酶切后进行连接,并转化入大肠杆菌Ecoli.Dh5α扩增以获得重组质粒。重组质粒、空质粒分别转染入人高转移肝癌细胞株,进行扩增培养,分别绘制MHCC97/vect-cortactin( )、MHCC97/vect和MHCC97细胞生长曲线;并进行Western-blot实验及通过小室培养模型进行细胞侵袭力实验。结果:RT-PCR获得预期大小的特异性DNA片段,经PCR、双酶切鉴定及测序证实人皮层肌动蛋白基因cDNA片段已正确的反向插入真核表达载体中。细胞生长曲线提示转染与未转染该基因的肝癌细胞生长曲线相同;Western-blot结果显示转染反义基因的肝癌细胞皮层肌动蛋白cortactin呈低表达或不表达;细胞侵袭力实验表明转染有反义基因的肝癌细胞穿膜细胞数较未转染的有非常显著差异(P<0.01)。结论:从蛋白水平和细胞水平均证实该反义基因能抑制肝癌细胞的皮层肌动蛋白的表达和游走而不影响细胞的生长特性。     

hAph2β和c-abl在肝细胞癌中的表达及其相互作用

目的:探讨hAph2β蛋白与c-abl蛋白在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的相互作用.方法:RT-PCR和Western 印迹法分析c-abl基因和hAph2基因在肝癌细胞株及永生化人肝细胞株中的表达.脂质体转染、免疫共沉淀和Western印迹法检测hAph2β与c-abl在SMMC-7721细胞中的相互作用.激光共聚焦-荧光显微镜观察hAph2β和c-abl在SMMC-7721细胞中的定位.用组织芯片结合免疫组织化学法检测hAph2β和c-abl蛋白在肝癌和相应癌旁组织中的表达差异,统计学分析其表达差异的临床意义.结果:RT-PCR检测结果表明,c-abl mRNA在HepG2、L-02及MHCC-LM3细胞中高表达,在SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B和Chang's liver细胞中中度表达,而在Huh-7、MHCC-97L细胞中低表达.Western印迹法检测结果发现,hAph2总蛋白在HepG2、Huh-7、MHCC-LM3和MHCC-97L细胞中高表达,在BEL-7402、L-02细胞中低表达;c-abl蛋白在Huh-7细胞中低表达.免疫共沉淀观察发现SMMC-7721细胞中过表达的hAph2β-GFP和内源性c-abl相互作用.荧光免疫细胞化学检测发现hAph2β和c-abl在SMMC-7721细胞中部分共定位.免疫组织化学检测结果表明,hAph2β/c-abl蛋白在人正常肝组织、硬化肝组织、癌旁肝及原发性HCC癌组织中的强阳性率分别为:100%/50%、91.7%/100%、100%/89.5%和50.9%/19.3%,其中hAph2β和c-abl在癌旁肝组织中的表达均明显高于肝癌组织(均P<0.001),2者在56.1%(32/57)的肝癌组织中同时高或低表达.结论:hAph2β和c-abl在SMMC-7721细胞中相互作用,在原发性HCC及相关组织中共表达.     

T细胞因子4基因表达与肝癌侵袭转移的关系

目的 研究人T细胞因子4基因（hTcf-4)在原发性肝癌及肝癌细胞株中表达情况，以探讨hTcf-4基因与肝癌发生发展的关系。方法 用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR），检测了32例原发性肝癌组织、癌旁组织及5株肝癌细胞株中hTcf-4基因表达。结果 hTcf-4 mRNA在癌旁组织中的表达率为71．9％，而在癌组织中的表达率达90．6％。且癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织（P＜0．001）。同时在肿瘤包膜不完整及有转移的癌组织中该基因表达明显增高。不同细胞株中均有hTcf-4基因表达。肝癌细胞株中表达水平高于正常肝细胞株（P＜0．001），而高转移肝癌细胞株MHCC97中表达水平又高于低转移肝癌细胞株（P＜0．05）。结论 hTcf-4基因表达增高与肝癌发生发展及侵袭转移有关，提示hTcf-4可能成为协助肝癌诊断、判断预后及疗效评价的指标。     

热休克蛋白90α在人类肝癌细胞外的表达及其对侵袭、迁移能力的影响

目的探讨细胞外热休克蛋白90α（HSP90α参与肝癌细胞转移的可能分子机制。方法采用免疫印迹法检测HSP90α在低、高转移性肝癌MHCC97-L和MHCC97-H细胞外的表达。选取高转移潜能MHCC97-H细胞,应用不穿透细胞膜的小分子抑制剂抑制细胞外HSP90α表达,体外侵袭实验观察细胞侵袭、迁移能力的变化,明胶酶谱法分析基质金属蛋白酶2（MMP-2）活性的改变。免疫印迹和免疫共沉淀法检测细胞外辅助分子伴侣HSP70和MMP-2的表达及其与HSP90d的相互作用。利用RNA干扰技术下调细胞HSP70表达,观察细胞外HSP90仅与MMP-2相互作用及其细胞转移潜能的变化。结果HSP90d在不同转移潜能肝癌细胞内外均表达,且与肝癌细胞转移潜能呈正相关。MHCC97-H细胞经特异性HSP90抑制剂二甲氨基乙氨基-17-去甲氧基格尔德霉素-N-氧化物（DMAG—N—oxide）作用24h后,穿过上室基底膜的细胞数较未处理组和空白对照组明显下降（P〈0．01）,分别为（28．11±3．56）、（80．12±4．16）、（82．24±4．12）个。体外侵袭实验显示,穿过Matrigel人工基底膜的细胞数低于未处理组和空白对照组,分别为（36．54±4．12）、（95．12±3．48）、（101．11±3．36）个,差异有统计学意义（P=0．017）,并伴有细胞外MMP-2活性减低。HSP70和MMP-2均可在MHCC97-H细胞外表达,且能与HSP90α相互结合。小分子干扰RNA（siRNA）能有效抑制细胞HSP70表达,MHCC97-H细胞外HSP90d和MMP-2相互作用减弱,MMP-2活性下降,细胞侵袭、迁移能力受抑制。同时联合应用MMP-2抑制剂,具有协同抑制效应。结论细胞外HSP90饯可能通过与HSP70形成伴侣复合体介导MMP-2成熟活化,增强肝癌细胞侵袭、迁移运动,提示其可能是潜在的对肝癌转移实施防治的靶点。     

IGF －1R 阻断剂抑制人肝癌细胞 MHCC97－H 增殖转移的研究

目的：探讨 IGF －1R 阻断剂在人肝癌细胞 MHCC97－H 增殖转移中的作用。方法：培养人肝癌细胞株 MHCC97－H,预先给予 IGF －1R 阻断剂鬼臼苦素（picropodophyllin,PPP）10μmol／L 干预1h,然后给予 IGF－II 50ng／ml 作用48h,观察各组细胞形态变化,噻唑兰（MTT）法分析细胞生长情况,Brdu 法检测细胞增殖潜能,平板克隆实验观察并计算细胞克隆形成率,Real －time PCR 及 Western blot 法观察细胞增殖核抗原（PC-NA）、基质金属蛋白酶－9、－2（MMP －9、MMP －2）mRNA 及蛋白表达情况,进一步分析细胞增殖转移情况。结果：IGF －1R 阻断剂 PPP 可使 MHCC97－H 细胞形态发生明显改变;IGF －1R 阻断剂 PPP 显著抑制 MH-CC97－H 细胞存活率、细胞增殖及克隆形成（P ＜0．05）;与对照组相比,IGF －II 组 MHCC97－H 细胞中 PC-NA、MMP －9及 MMP －2的 mRNA 和蛋白表达显著升高（P ＜0．05）,而与 IGF －II 组相比,IGF －1R 阻断剂PPP 可明显抑制 MHCC97－H 细胞中 PCNA、MMP －9及 MMP －2的 mRNA 和蛋白表达（P ＜0．05）。结论：IGF －1R 阻断剂通过抑制人肝癌细胞 MHCC97－H 生长增殖,下调 PCNA、MMP －9及 MMP －2的表达,发挥阻碍人肝癌细胞 MHCC97－H 增殖转移的功效。     

miR-144-3p 通过靶向FZD4 阻断Wnt/β-catenin 通路抑制肝癌Huh-7 细胞的恶性生物学行为

[摘要] 目的: 探讨miR-144-3p 通过阻断卷曲受体4（FZD4）/Wnt/β-catenin 信号通路对肝癌Huh-7 细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其作用机制。方法：收集2012 年3 月至2017 年7 月在柳州市工人医院手术切除的18 例肝癌患者的癌组织及相应的癌旁组织标本,以及肝癌细胞系Huh-7、SMMC7721 和MHCC97 和人正常肝上皮细胞株THLE-3,用qPCR 检测肝癌组织及细胞系中miR-144-3p 的表达水平。将miR-144-3p mimics/inhibitor 和FZD4 敲降载体转染至Huh-7 细胞中,用CCK-8、Transwell、划痕愈合实验和Annexin V-FITC/PI 染色流式细胞术检测Huh-7 细胞的增殖、迁移和凋亡水平。用双荧光素酶报告基因验证miR-144-3p 和FZD4 的靶向关系。结果：在肝癌组织和细胞系中miR-144-3p 均呈低表达（P<0.05 或P<0.01）。过表达miR-144-3p 可显著抑制Huh-7 细胞增殖、迁移并诱导细胞凋亡（均P<0.01）。双荧光素酶报告基因实验证明miR-144-3p 靶向作用FZD4 并下调其表达水平。体外实验进一步证实,过表达miR-144-3p 靶向FZD4 并阻断Wnt/β-catenin 通路,进而抑制Huh-7 细胞增殖、迁移和促进细胞凋亡（均P<0.01）。结论：miR-144-3p 通过阻断FZD4/Wnt/β-catenin 通路抑制肝癌Huh-7 细胞的恶性生物学行为,为肝癌诊断或治疗提供了潜在分子靶点。     

ANGPTL4基因及缺失突变体对肝癌细胞生长的影响

目的:探讨ANGPTL4基因及其缺失突变体对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响。方法:构建ANGPTL4基因全长及其功能结构域缺失突变体的融合表达载体,即ANGPTL4-GFP-N1、ANGPTL4-del1-GFP-N1、ANGPTL4-del2-GFP-N1、ANGPTL4-del3-GFP-N1,脂质体法将EGFP-N1空载体、ANGPTL4基因及其缺失突变体分别转染肝癌细胞SMMC-7721,G418筛选,建立稳定细胞系,用MTT试验法、细胞集落形成试验检测细胞体外生长活性和增殖能力;流式细胞仪检测ANGPTL4基因对细胞凋亡的影响;裸鼠移植瘤试验检测转染细胞的体内成瘤特性。结果:ANGPTL4基因及其缺失突变体体外对肝癌细胞SMMC-7721的生长、集落形成具有明显的抑制作用(均为P<0.01);ANGPTL4全长基因及其缺失突变体ANGPTL4-del1-GFP-N1和ANGPTL4-del2-GFP-N1均对SMMC-7721细胞体内成瘤有明显抑制作用(均为P<0.01)。但转染ANGPTL4全长基因及其缺失突变体的SMMC-7721细胞的细胞凋亡发生率与转染空载体组相比没有明显差别(均为P>0.05)。结论:ANGPTL4基因及其缺失突变体对肝癌SMMC-7721细胞体内、外生长均具有明显抑制作用,但该抑制作用不是通过促进细胞凋亡实现的。     

脱水淫羊藿素对肝癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的:研究异戊烯基类黄酮化合物脱水淫羊藿素（AHI）对人肝癌细胞株MHCC-97H的增殖、迁移和凋亡的影响。方法:体外培养人肝癌细胞株MHCC-97H及人正常肝细胞株L02，分别用0、20、40、80、120、160、200 μg/ml浓度的AHI处理MHCC-97H细胞，用0、25、50、100、150、200、400、500 μg/ml浓度的AHI处理L02细胞。采用CCK-8和克隆形成实验检测细胞增殖情况;划痕实验检测细胞迁移情况;Hoechst33342实验和流式细胞术检测细胞凋亡情况;蛋白质印迹法检测细胞凋亡相关蛋白表达情况。结果:经0、20、40、80、120、160、200 μg/ml AHI处理24 h后，MHCC-97H细胞的存活率分别为（100.00±0.00）%、（97.41±2.10）%、（96.58±3.23）%、（87.72±4.85）%、（78.33±3.76）%、（56.97±2.61）%、（15.25±2.51）%，差异有统计学意义（ F=429.20， P<0.001）;80、120、160、200 μg/ml AHI与0 μg/ml AHI相比，差异均有统计学意义（均 P<0.001）。经0、25、50、100、150、200、400、500 μg/ml AHI处理24 h后，L02细胞存活率分别为（100.00±0.00）%、（96.82±3.79）%、（95.36±3.43）%、（90.79±5.75）%、（77.67±5.66）%、（63.98±5.22）%、（34.22±4.01）%、（33.84±4.41）%，差异有统计学意义（ F=233.20， P<0.001）;100、150、200、400、500 μg/ml AHI与0 μg/ml AHI相比，差异均有统计学意义（均 P<0.05）。AHI处理L02细胞24 h半抑制浓度（IC 50）为（300.20±17.10） μg/ml，明显大于MHCC-97H细胞IC 50（158.60±5.50） μg/ml，差异有统计学意义（ t=13.65， P<0.001）。经0、120、160、200 μg/ml AHI处理24 h后，MHCC-97H细胞克隆数分别为1 993.00±46.29、1 355.00±54.84、998.33±21.03、218.33±35.95，差异有统计学意义（ F=954.80， P<0.001）;120、160、200 μg/ml AHI与0 μg/ml AHI相比，差异均有统计学意义（均 P<0.001）。经0、120、160、200 μg/ml AHI处理24 h后，MHCC-97H细胞愈合率分别为（51.68±1.93）%、（16.04±0.73）%、（8.88±0.31）%、（-6.94±0.46）%，差异有统计学意义（ F=1 616.00， P<0.001）;120、160、200 μg/ml AHI与0 μg/ml AHI相比，差异均有统计学意义（均 P<0.001）。Hoechst33342实验显示，经0 μg/ml AHI处理的MHCC-97H细胞于倒置显微镜下显示出均匀的暗蓝色，并呈现出完整的细胞核状态;相较于0 μg/ml，120、160、200 μg/ml AHI处理的细胞出现皱缩、破碎的现象，细胞核形态异常，部分细胞核被染为亮蓝色，且该情况随着浓度的增加愈为明显。经0、120、160、200 μg/ml AHI处理24 h后，MHCC-97H细胞凋亡率分别为（10.51±0.56）%、（42.23±0.87）%、（61.92±0.52）%、（72.05±0.74）%，差异有统计学意义（ F=4 677.00， P<0.001）;120、160、200 μg/ml AHI与0 μg/ml AHI相比，差异均有统计学意义（均 P<0.001）。经0、120、160、200 μg/ml AHI处理的MHCC-97H细胞Bax、Cleaved Caspase-3/Caspase-3、Cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bcl-2蛋白相对表达量差异均有统计学意义（ F=30.43， P<0.001;F=212.80， P<0.001;F=475.30， P<0.001;F=10.75， P=0.004）;160、200 μg/ml AHI Bax蛋白表达与0 μg/ml AHI相比，均显著升高（均 P<0.001）;120、160、200 μg/ml AHI Cleaved Caspase-3/Caspase-3、Cleaved Caspase-9/Caspase-9蛋白表达与0 μg/ml AHI相比，均显著升高（均 P<0.001）;120、160、200 μg/ml AHI Bcl-2蛋白表达与0 μg/ml AHI相比，均显著降低（均 P<0.05）。 结论:AHI可抑制人肝癌细胞株MHCC-97H的增殖、迁移，并促进其凋亡。     

miR-199-3p通过对FGF2的调控抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖、迁移作用及机制

目的:探讨miR-199-3p通过靶向调控抑制靶基因FGF2从而抑制肝癌MHCC97H细胞的增殖和迁移及机制。方法:qRT-PCR检测癌旁正常组织及肝癌肿瘤组织中miR-199-3p的表达水平;Transwell细胞侵袭实验检测肝癌细胞株Huh7、MHCC-97L、SMMC7721、HepG2和MHCC97H株其侵袭能力;qRT-PCR检测miR-199-3p在5株肝癌细胞系中的表达量;通过生物信息软件预测靶基因FGF2 mRNA 3' UTR的碱基存在miR-199-3p可能互补结合的位点并用荧光报告基因法及WB进行验证;通过qRT-PCR、免疫组化及Western blot检测FGF2在肝癌肿瘤组织和癌旁正常组织及各类肝癌细胞株表达的影响;Transwell、划痕、CCK8及流式细胞法检测miR-199-3p与FGF2对肝癌MHCC97H细胞增殖、侵袭、迁移及周期S期聚集能力的调控;采用MHCC97H细胞构建肝癌肿瘤异种移植小鼠模型进行肿瘤观测及免疫组化实验验证miR-199-3p对肝癌的调控作用。结果:miR-199-3p的表达水平与肝癌细胞侵袭转移能力相关;miR-199-3p能够通过抑制FGF2的mRNA翻译,抑制FGF2蛋白水平表达;FGF2与肝癌细胞侵袭转移能力相关;miR-199-3p可以负调控FGF2抑制肝癌MHCC97H细胞的生物行为;miR-199-3p 可抑制肝癌细胞中阳性信号,细胞增殖水平显著降低。结论:miR-199-3p通过抑制FGF2抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖和迁移。     

类泛素化蛋白酶1基因的表达与肝癌细胞株侵袭转移的关系

研究类泛素化蛋白酶-1（sentrin-specific protease-1,SENP-1）基因在不同侵袭潜能肝细胞肝癌细胞株及人永生化肝细胞中mRNA和蛋白的表达水平及其与肝癌细胞侵袭能力的关系。方法：使用RT-PCR、Real-time PCR、Western blotting和免疫荧光方法对肝癌细胞株MHCC97L（低侵袭性）、MHCC97H和HCCLM3（高侵袭性）、SMMC-7721和HepG2（无明显侵袭性）SENP-1 mRNA和蛋白表达水平进行检测,以人永生化肝细胞株HL-7702为对照,分析SENP-1的表达与肝癌细胞株侵袭转移能力的关系。结果：RT-PCR和Real-time PCR检测结果显示,SENP-1 mRNA（F=5.658;P=0.042）和蛋白（F=88909,P=0.000）在肝癌细胞株中的表达随着肝癌细胞株侵袭潜能的增高而增高;Western blotting检测结果显示,5种肝癌细胞株SENP-1蛋白水平均显著高于人永生化肝细胞株;免疫荧光法观察发现,SENP-1蛋白在肝癌细胞株内主要为胞质表达,部分胞核表达。结论：SENP-1基因在肝癌细胞株中的高表达可能具有促进肝癌细胞侵袭转移的作用。     

Osteoglycin高表达降低小鼠肝癌Hca-F细胞淋巴环境中MMPs分泌能力

目的：研究Osteoglycin表达与肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）的关系。方法：构建真核表达载体pIRESpur03 Osteoglycin（＋），将其转染至高淋巴道转移能力小鼠肝癌Hca—F细胞，接种于615小鼠皮下，体内试验评价转移能力；同期采用酶谱法体外试验评价不同环境中Hca—F细胞表达Osteoglycin与其分泌MMPs的关系。结果：转染pIRESpuro3 Osteoglycin（＋）的Hca—F细胞Osteoglycin在mRNA和蛋白水平表达显著增高，体内试验显示，其外周淋巴结转移率明显降低（P=0．028）；体外试验表明，转染Osteoglycin基因显著降低了Hca-F细胞淋巴环境中MMPs分泌能力（P〈0．05或P〈0．01），然而未能影响肝匀浆或脾匀浆环境或DMEM培养基中肿瘤细胞MMPs分泌能力。结论：高表达Osteoglycin降低小鼠肝癌Hca—F细胞淋巴环境中MMPs分泌能力，抑制肿瘤细胞MMPs分泌能力可能是Osteoglycin调控肿瘤淋巴道转移机制之一。     

新基因pp3774的亚细胞定位以及在肝癌细胞系和组织中的表达谱研究

目的探讨新基因pp3774在肝癌细胞系、人肝癌及癌旁肝、肝硬化以及正常肝组织中的表达差异及其生物学功能.方法脂质体转染-荧光观察pp3774-GFP融合蛋白的亚细胞定位;合成新基因pp3774特异性多肽,制备兔源性多克隆抗体;用RT-PCR、蛋白印迹、免疫细胞化学及免疫组化方法检测pp3774基因在7个肝癌细胞系及214例肝细胞癌、18例肝硬化及10例正常肝组织中的表达差异.流式细胞术检测转染pp3774基因的SMMC-7721细胞的凋亡率.结果 pp3774蛋白主要定位于细胞质(内质网为主);RT-PCR检测结果表明pp3774 mRNA在肝癌细胞系BEL-7402、Huh-7、MHCC-97L及HepG2中高表达,SMMC-7721、MHCC-LM3及人永生化肝细胞系L-02中度表达,而在Hep3B中低表达;肝癌及癌旁组织中pp3774 mRNA的表达表现为癌旁高于癌(P<0.05);免疫组化结果显示pp3774蛋白表达程度依次为正常肝≥肝硬化≥癌旁肝组织>肝癌.转染pp3774基因的SMMC-7721细胞的凋亡发生率高于对照组约10%.结论 pp3774基因是一个具有抑制肝癌细胞生长功能的新基因.     

微小RNA-451调控COX-2等细胞因子对人肝癌细胞株增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨微小RNA-451(miRNA-451)通过调控COX-2等细胞因子对人肝癌细胞株增殖和侵袭能力的影响.方法 采用RT-PCR法检测正常肝细胞株以及人肝细胞癌细胞株中miRNA-451的表达情况;利用慢病毒转染的方法使MHCC-97H细胞过表达miRNA-451,利用RT-PCR法检测MIF 、MAPK 、ERK 、COX-2 、TGF-β 、VEGF和PGE2 mRNA的表达水平;通过平板克隆实验和Transwell小室分别检测miRNA-451过表达后MHCC-97H的增殖和侵袭能力的变化.结果 HCC细胞株HCCLM-3、MHCC-97H、MHCC-97L、Huh-7、SMMC-7721、HepG2中miRNA-451的相对表达量分别为(0.11±0.01)、(0.23±0.01)、(0.44±0.03)、(0.55±0.02)、(0.74±0.03)、(0.70±0.01),与正常肝细胞株L-02细胞比较,差异均有统计学意义(P﹤0.05).转染72 h后,LV-pre-miRNA-451组miRNA-451的相对表达量较空白对照组上调了(12.09 ± 0.15)倍(P﹤0.05).miRNA-451过表达后,MIF 、MAKP 、ERK 、COX-2 、TGF-β 、VEGF 、PGE2 mRNA的相对表达量分别为(0.30 ± 0.13)、(0.68 ± 0.02)、(0.48 ± 0.02)、(0.56±0.01)、(0.51±0.02)、(0.42±0.02)、(0.76±0.03),与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P﹤0.05).培养24 h后,LV-pre-miRNA-451组侵袭至Transwell膜背面的细胞数量为(53±5)个,明显低于空白对照组的(79±4)个,差异有统计学意义(t=7.700,P﹤0.01);HCC细胞株MHCC-97H过表达miRNA-451后的平板克隆形成率为(15.7± 0.5)%,明显低于空白对照组细胞的(27.0±0.4)%,差异有统计学意义(t=31.705,P﹤0.01).结论 miRNA-451通过MIF/MAPK/ERK途径可调控肿瘤微环境内的细胞因子,从而影响肿瘤细胞的侵袭能力.