初级纤毛介导的Shh信号对大鼠骨髓基质细胞神经元样细胞分化的影响

目的 探讨初级纤毛介导的Sonic hedgehog(Shh)信号对大鼠骨髓基质细胞(MSCs)神经元样细胞分化的影响。方法 全骨髓贴壁法分离培养大鼠MSCs。实验分为白藜芦醇正常培养组、白藜芦醇诱导组、Smoothened (Smo)激动剂SAG组、Smo抑制剂环巴明组,分别给予相应的药物处理。倒置显微镜下观察各组细胞形态; 免疫荧光法检测各组细胞初级纤毛及Shh信号通路相关蛋白\[Ac-Tu、Patched (Ptc)、Smo、Gli1\]的表达; RT-PCR检测各组细胞Smo、Gli1 mRNA的表达;蛋白质印迹法检测各组细胞Smo和Gli1蛋白的表达。结果 正常培养的大鼠MSCs不表达初级纤毛。经过预诱导或饥饿处理24 h后,MSCs表达初级纤毛及Ptc、Smo和Gli1蛋白,其中Smo和Gli1蛋白位于胞质,Ptc蛋白位于初级纤毛。正常培养时,白藜芦醇不能促使Smo移位及MSCs向神经元样细胞分化。当MSCs表达初级纤毛时,白藜芦醇及SAG可使Smo从胞质进入初级纤毛,同时伴随MSCs向神经元样细胞分化及 Smo、Gli1 mRNA和蛋白表达水平的增加(P<0.05); 加入抑制剂环巴明后,Smo仍主要表达于胞质,Smo、Gli1 mRNA和蛋白的表达水平降低(P<0.05),MSCs向神经元样细胞的分化受抑制。结论 MSCs表达初级纤毛并存在Shh信号,初级纤毛介导的Shh信号参与调控大鼠MSCs的神经元样细胞分化。     

U0126对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖、迁移及侵袭的影响

[目的]探讨U0126对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖、迁移及侵袭的影响.[方法]用不同浓度MEK/ERK抑制剂U0126(25,50,100μmol/L)处理Tca8113细胞24,48,72 h,采用MTT法检测细胞增殖抑制情况,划痕实验检测细胞迁移距离,Transwell实验检测48 h时的细胞侵袭率,细胞免疫荧光染色和Western blot法检测48h时的细胞ERK1/2,p-ERK1/2,MEKK1,p-MEKK1在细胞内定位和蛋白表达情况及E-cadherin和Vimentin表达水平.[结果]U0126对细胞的增殖、迁移和侵袭具有明显的抑制作用(P<0.01),且呈现出浓度和时间依赖性;细胞中磷酸化的ERK1/2主要表达在细胞核膜和核内,U0126对磷酸化的ERK1/2表达具有明显的抑制作用(P<0.01);与对照组比较,U0126各剂量组E-cadherin蛋白表达水平均明显升高(P<0.01),而Vimentin蛋白表达水平明显降低(P<0.01),且均呈现出浓度依赖性.[结论]U0126可抑制Tca8113细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制认为可能与抑制ERK1/2活化、促进E-cadherin表达及抑制Vimentin表达有关系.     

白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞的神经元样细胞分化伴Shh信号激活

目的 研究Sonic Hedgehog(Shh)信号在白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)分化为神经元样细胞中的作用.方法 采用全骨髓贴壁法分离培养MSCs.MSCs分为3组,白藜芦醇诱导组:用含白藜芦醇的无血清DMEM/F12诱导MSCs分化;对照组:用无血清DMEM/F12诱导MSCs分化;正常组:不做诱导处理.倒置显微镜下观察细胞形态,免疫荧光法、免疫印迹法检测NSE、MAP-2、GFAP、Smo和Gli1蛋白的表达和移位.结果 白藜芦醇诱导后细胞胞体收缩,伸出长突起,类似神经元.免疫荧光显示正常组及对照组MSCs轻度表达神经元NSE蛋白,白藜芦醇诱导组MSCs NSE、MAP-2阳性,但诱导前后细胞始终未表达胶质细胞GFAP蛋白.免疫荧光显示,MSCs具有初级纤毛,并表达Smo和Gli1.白藜芦醇诱导组Smo从细胞质进入初级纤毛,Glil从细胞质进入细胞核,同时,Smo、Glil蛋白的表达增加(P＜0.01).对照组则无明显变化.结论 白藜芦醇能诱导MSCs分化为神经元样细胞;此过程中Shh信号通路被激活,推测Shh信号在MSCs分化过程中可能发挥着重要作用.     

真核表达质粒pBK-Fas的构建及转染舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑瘤效应

目的 研究Fas基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑制作用,构建Fas基因真核表达质粒pBK-Fas并将其转导入舌鳞癌Tca8113细胞,为舌鳞癌的Fas基因治疗提供实验基础.方法 采用RT-PCR反转录成cDNA扩增Fas基因全长,亚克隆到真核表达载体pBK-CMV内,构建出重组真核表达质粒pBK-Fas,酶切鉴定并测序.脂质体法将pBK-Fas转染入Tca8113细胞,RT-PCR检测Fas mRNA表达及半定量分析,琼脂糖凝胶电泳检测Fas转染细胞凋亡,流式细胞仪检测Fas蛋白表达.通过细胞生长曲线描记和软琼脂集落形成实验研究Fas基因的体外抑瘤效应.结果 PCR扩增后的产物在约1 008 bp处出现明显的特异性条带,重组质粒pBK-Fas经酶切和测序鉴定,表明均含有大小正确的Fas基因片段.经检测Fas基因转染能提高Fas mRNA 表达水平、Fas 蛋白表达强度,以及细胞凋亡指数.Fas基因转染能提高Fas蛋白的表达强度,由转染前的34.01±4.76上升到转染后的55.72±7.33,差异有统计学意义(P<0.01).Fas转染细胞株在Fas抗体作用下能够有效启动Fas介导的细胞凋亡途径.MTT法检测细胞增殖抑制率的结果显示PBK-Fas转染组 Tca8113细胞的增殖抑制作用最明显,表明Fas基因转染能增加舌鳞癌Tca8113细胞的增殖抑制率,结果与细胞生长曲线测定(计数法)结果具有一致性.软琼脂集落形成实验结果显示,与未转染细胞相比,重组质粒转染的Tca8113细胞群体倍增时间延长,克隆形成能力降低.结论 Fas基因片段被成功插入真核表达载体pBK-Fas质粒的多克隆位点.Fas基因转染能有效的抑制体外培养的舌鳞癌Tca8113细胞的生长.     

蛇床子素对人舌鳞癌Tca8113细胞凋亡和自噬的影响

目的 研究蛇床子素对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖、凋亡和自噬的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 体外培养Tca8113细胞,并将细胞分为不加药的对照组和分别加入40、80、120、160 μmol/L蛇床子素的实验组。用四甲基偶氮唑盐实验和集落形成实验检测蛇床子素对Tca8113细胞的增殖作用,通过Hoechst33342染色法和流式细胞仪检测蛇床子素对人舌鳞癌Tca8113细胞24 h凋亡情况,Western blot检测Bcl-2、Bax、活化的半胱氨酸蛋白酶3及LC3、P62的表达情况。结果 蛇床子素可以明显抑制Tca8113细胞增殖,且药物对细胞的抑制率呈浓度依赖性;细胞集落形成能力降低;Hoechst33342染色和流式细胞术结果显示,蛇床子素呈浓度依赖性诱导细胞死亡;Western blot结果显示,蛇床子素能上调Bax和活化的半胱氨酸蛋白酶-3蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达。同时增加LC3Ⅱ、P62的表达,降低LC3Ⅰ的表达。结论 蛇床子素能抑制人舌鳞癌Tca8113细胞增殖,其机制可能与促进细胞凋亡并抑制细胞自噬流、自噬途径损伤而抑制细胞自噬有关。     

增强DNA聚合酶beta基因表达对人舌癌细胞生物学行为的影响

目的探讨DNA聚合酶beta（polβ）对人舌癌Tca8113细胞增殖和侵袭力的影响。方法运用野生型人polβ重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-polβ转染Tca8113细胞,分别用RT-PCR、Western blot检测polβ转录及蛋白表达水平;细胞生长实验检测舌癌细胞增殖的变化;Boyden室细胞侵袭实验检测舌癌细胞侵袭能力的变化。结果 pEGFP-C3-polβ转染Tca8113细胞获得稳定细胞株,与空白对照组及空载体组比较,polβmRNA及蛋白表达水平均明显增高,野生型polβ导入的舌癌细胞增殖和侵袭能力均明显减弱（P〈0.05）。结论 DNA polβ表达增强能够降低人舌癌细胞的增殖和侵袭能力。     

靶向舌癌Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子基因的siRNA表达载体构建及体外抑制作用

目的构建靶向舌癌Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因的siRNA表达载体并在体外检测其对VEGF基因表达的抑制作用。方法设计合成靶向舌癌Tca8113细胞VEGF基因的siRNA cDNA序列并与Psilencer2.1-U6-neo连接,构建VEGF-siRNA表达载体（Pu-VEGF-siRNA）,酶切鉴定和测序确认后,经脂质体Lipofectamine2000转染入Tca8113细胞,以空载体组为实验对照组（Pu-HK）,未转染组为空白对照组。采用酶联免疫吸附（ELISA）和免疫组化方法检测染后Tca8113细胞VEGF蛋白表达差异。结果经过双酶切鉴定和测序分析,成功构建了靶向Tca8113细胞VEGF基因的siRNA表达载体。与实验对照组和空白对照相比较,转染Pu-VEGF-siRNA后Tca8113细胞的VEGF蛋白表达明显下降（P〈0.05）,但两对照组间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论成功构建了靶向舌癌Tca8113细胞VEGF基因的siRNA表达载体,且该载体在体外能有效抑制Tca8113细胞VEGF蛋白的表达。     

量子点为载体转染survivin siRNA至人舌鳞癌Tca8113细胞的研究

目的靶向survivin基因的siRNA通过量子点为载体转染至人舌鳞癌Tca8113细胞中,研究其对survivin基因表达的影响,为量子点在肿瘤的基因治疗方面提供实验依据。方法 Survivin siRNA通过量子点转染至人舌鳞癌Tca8113细胞中,同时设立LIPOFECTTAMINE2000脂质体为转染载体的对照组以及未转染的空白组,采用实时定量RT-PCR检测各组Tca8113细胞中survivin mRNA表达的改变情况。结果实验组用50pmolQD转染100pmol survivin siRNA入Tca8113细胞48h后,检测到survivin siRNA mRNA表达量相对于空白组下降64%,QD与siRNA的使用比例为1∶2;对照组中用100pmol lipofectamine2000脂质体转染100pmol survivin siRNA入Tca8113细胞48h后,检测到survivin siRNA mRNA表达量相对于空白组下降90%,QD与siRNA的使用比例为1∶1。结论量子点为载体转染survivin siRNA能够有效的抑制Tca8113细胞survivin mRNA的表达,量子点有望作为RNA干扰技术的新型载体。     

异土木香内酯对人舌鳞癌Tca8113细胞的增殖、迁移和侵袭的影响

目的 研究异土木香内酯对舌鳞癌细胞Tca8113的增殖、迁移和侵袭能力的影响.方法 用CCK-8法检测异土木香内酯作用于舌鳞癌Tca8113细胞的半数抑制浓度(IC50),EDU实验方法检测异土木香内酯抑制Tca8113细胞增值能力.检测土木香内酯对Tca8113细胞凋亡影响实验.Western Blot检测异土木香内酯对Tca8113细胞凋亡蛋白表达的影响.结果 实验结果表明,异土木香内酯作用于舌鳞癌Tca8113细胞的半数抑制浓度(IC50)为20μM,20μM异土木香内酯可以抑制舌鳞癌Tca8113细胞活性(P<0.01),细胞增值能力(P<0.01);进一步结果表明,异土木香内酯还可以抑制对Tca8113 P迁移,同时降低Tca8113细胞侵袭能力(P<0.01);促进Tca8113细胞凋亡的影响(P<0.01).Western Blot实验结果表明,异土木香内酯可以下调舌癌Tca8113细胞的Bcl-2蛋白,上调caspase3蛋白的表达.结论 实验结果表明异土木香内酯对舌癌Tca8113细胞有抑制作用.