维生素D受体基因多态性与多发性硬化的相关研究

目的：探讨维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)基因ApaI及BsmI酶切多态性是否与中国多发性硬化(multiple sclerosis，MS)的发生相关。方法：应用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(RFLP—PCR)分析方法，检测63例北京大学第三医院收治的MS患者和95例对照者VDR基因ApaI和BsmI酶切多态性。结果：VDR基因ApaI酶切多态性从，Aa，aa3种基因型频率的分布在MS组和对照组分别为14．3％，27．0％，58．7％和15．8％，30．5％，53．7％，两组间的差异无统计学意义(P=0．822)。A等位基因和a等位基因频率的分布在两组间的差异无统计学意义(P=0．533)。VDR基因BsmI酶切多态性在MS组和对照组均未见BB基因型。Bb，bb两种基因型频率在MS组和对照组分别为11．1％，88．9％和11．6％，88．4％。在两组间的差异无统计学意义(P=0．797)。B等位基因和b等位基因频率的分布在两组间的差异亦无统计学意义(P=0．930)。结论：VDR基因ApaI和BsmI酶切多态性各基因型和等位基因型与MS的发生无明显相关性。     

乙型肝炎病毒基本核心启动子A1762T／G1764A位点基因多态性检测方法的建立及应用

[目的]建立多聚酶链式反应-限制性片段长度多态分析（PCR-RFLP）法检测乙型肝炎病毒（HBV）C区基本核心启动子区（BCP）A1762T／G1764A联合突变并对部分临床标本进行检测。[方法]根据HBVBCP区基因设计引物，在G1764位设计MboⅠ酶切位点，根据PCR产物酶切结果判断该位点为G或A。[结果]测序及序列比较显示本文一株突变株：DT-BCP确为1762T／1764A变异株；HBeAg阳性慢性乙肝A1762T和G1764A位点双突变率为60％（18／30），HBeAg阴性组为53．3％（16／30），两组变异率无显著性差异（X^2=0．271，P=0．602）。[结论]本文建立的方法可用于检测HBV BCP区A1762T／G1764A位点双突变。     

HLA—DR、DQ座位等位基因与HIV感染及AIDS发病相关性的研究

[目的]研究中国人HLA—DR、DQ座位等位基因与HIV感染及AIDS发病的相关性，为HIV的预防、治疗提供依据，并从免疫学指标作进一步观察。[方法]应用微量聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR～SSP)技术对18例AIDS患者及18例HIV抗体阴性高危人群进行了HLA—DR、DQ座位等位基因的检测，并与81例中国人群的正常对照组进行了比较。同时对AIDS患者组的免疫球蛋白(IgG、IgM)、补体(C3、C4)、抗溶血性链球菌O(ASO)、类风湿因子(RF)、白细胞介素(IL-2、IL-6)进行了检测。[结果]发现AIDS患者组的HLA—DR8的基因频率为38．9％，正常对照组的基因频率为12．3％，AIDS患者组明显高于正常对照组，P值为0．007；HIV抗体阴性高危人群组的HLA—DR9的基因频率为0．0％，正常对照组的基因频率为19．8％，HIV阴性高危人群组明显低于正常对照组，P值为0．040。AIDS患者组与正常对照组相比较，IgG、IgM、ASO、RF有显著性差异，C3、C4、IL-2、IL-6无显著性差异。[结论]本文发现HLA—DR9与中国人HIV的易感性有关，是HIV的易感基因；HLA—DR8与中国人HIV感染后的疾病进程有关，造成AIDS的快速发展；同时伴有免疫异常，说明有内在关联性。     

多重逆转录聚合酶链反应同步检测A组轮状病毒G基因型的研究

目的　为了检测A组轮状病毒VP7的基因型 ,建立一步多重逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)同步检测A组轮状病毒G基因型技术。方法　在参照文献并分析A组轮状病毒VP7基因的基础上 ,选取了一个共用的下游引物RVG9和 6个A组轮状病毒G基因型G1、G2、G3、G4、G8和G9的特异性上游引物 ,利用多重RT PCR技术对标准株和样品进行检测。结果　进行一轮RT PCR ,即可至少同时检出 5种不同标准株混合物中的各个基因型。对纯化的A组轮状病毒标准株RNAO2 6 5进行系列稀释后 ,其检测灵敏度可达 1PFU。经对A组轮状病毒阳性的 6 0份样本进行检测 ,其中G3有 5 1例、G2有 4例 ,G1与G3混合感染 3例 ,另外尚有 2例不能分型。　结论　本研究建立的一步多重RT PCR技术对A组轮状病毒基因型研究将为临床诊断和实验研究提供一种快速、灵敏和特异的检测手段。     

河南省婴幼儿轮状病毒腹泻病原研究

目的了解河南省5岁以下儿童轮状病毒发病率，实验室检出率和病毒的基因分型。方法收集2005年10月-2006年10月两个监测点5岁以下儿童腹泻粪便标本585例，用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测腹泻患儿粪便中的轮状病毒，然后用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法对粪便中提取的轮状病毒RNA做基因分型。结果585份腹泻患儿粪便标本中检测出轮状病毒304份，全年轮状病毒阳性率51．97％。在304份ELISA阳性的标本中，随机取103份标本用RT—PCR法进行轮状病毒基因G．P分型，分型率为65．05％，其中P[8]G3为主要流行型，占所有分型的41．75％。结论轮状病毒腹泻仍然是河南省婴幼儿腹泻的主要病原体，但轮状病毒主要流行的血清型已由1990～1997年间监测的G1型转变为目前的G3型。     

乙型肝炎病毒前C区G1896A位点变异检测方法的建立及应用

[目的]建立等位基因特异性PCR（AS-PCR）法检测乙型肝炎病毒（HBV）前C区G1896A位点变异并对部分慢性乙型肝炎标本进行检测。[方法]根据HBV前C区G1896A位点设计只有3＇末端有一个碱基不同的两对等位基因特异性引物，根据PCR结果判断该位点为G或A。[结果]本文测定的两株克隆序列与AS-PCR结果一致；HBeAg阳性慢性乙肝G1896A突变率为50％（15／30），HBeAg阴性组为90％（27／30），两组变异率有显著性差异（X^2=29．382，P=0．000）。[结论]本文建立的方法可用于检测HBV前C区G1896A位点的突变。     

ACE基因多态性及线粒体5178A／C基因型与心肌梗死的关系研究

[目的]探讨血管紧张素转换酶（ACE）基因插入／缺失（I／D）多态性及线粒体（mt）5178A／C基因型与心肌梗死的关系。[方法]采用PCR法检测心肌梗死患者84例及正常对照80例的ACEI／D多态性。采用PCR—RFLP方法检测心肌梗死患者84例及正常对照者80例的mr5178A／C基因型。并对结果进行统计学分析。[结果]在心肌梗死患者中，ACE基因的DD基因型频率及D等位基因频率显著高于正常对照组（均P〈0．05），DD与非DD及D与I的比数比（OR）分别为2．443（1．265—4．716）及1．703（1．098—2．638）。mt5178C等位基因频率也明显高于正常对照组（P=0．021），mt5178C与mt5178A的比数比为2．254（1．114—4．563）。[结论]ACE基因DD基因型及mt5178C与心肌梗死有关，可能是发生心肌梗死的重要危险因素。     

巢式RT—PCR检测肺癌患者外周血微量转移癌细胞

[目的]建立检测肺癌患者外周血微转移癌细胞的敏感的分子检测方法，探讨其临床应用的意义。[方法]从肺癌患者外周血中分离有核细胞，用TRzol提取RNA，采用巢式反转录聚合酶链反应(RT—PCR)技术特异引物扩增CK19mRNA，凝胶电泳观察结果，以检测肺癌患者外周血CK19-mRNA的表达情况。分析CK19mRNA扩增结果与患者临床指标的关系。[结果]76例肺癌患者外周血标本中39例CK19mRNA阳性，阳性率为51．3％(39／76)，27例肺良性病变中仅1例阳性，阳性率为3．7％，15例健康对照者为阴性。[结论]巢式RT—PCR检测肺癌患者外周血微量转移癌细胞具有较高的敏感性和特异性，CK19-mRNA可作为一个标志物来检测肺癌患者外周血微转移。     

基因甲基化聚合酶链反应检测体系的优化

目的：优化甲基化敏感限制性内切酶的聚合酶链反应（PCR）检测体系。方法用甲基化敏感限制性内切酶-PCR技术对10例健康未孕女性的RASSF1A基因进行甲基化检测，并对反应的缓冲体系进行优化。结果未经纯化的酶切产物直接进行 PCR时，PCR反应特异性降低，出现众多非特异 PCR产物；纯化酶切产物或用PCR缓冲液替代酶切缓冲液后，PCR反应特异性变高。结论酶切缓冲液可影响后续PCR反应的特异性，采取纯化措施或以PCR缓冲液替代酶切缓冲液能够有效提高后续PCR特异性，首选PCR缓冲液替代更为简便。     

血管基膜衍生多功能肽基因在毕赤酵母中的表达和活性鉴定

目的利用PCR技术从含有目的基因的质粒pGEX-4T-1-VBMDMP获得带有snabⅠ和NotⅠ酶切位点并融合有GST的目的基因片段并测序鉴定。方法将PCR产物纯化、酶切、回收，克隆到pPIC9K栽体，转化入大肠杆菌DH5a扩增，用琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定。BglⅡ线性新构建的表达载体pPIC9K-CST-VBMDMP，然后用原生质体转化法转化毕赤酵母细胞，并用pPIC9K空质粒也转入酵母细胞进行对照。用煮-冻-煮法裂解已转化有目的基因的毕赤酵母细胞，提取DNA并行PCR鉴定，获得阳性重组子，行多克隆筛选和表型鉴定。筛选His’Mut^8表型的转化子，在MGY液体培养基中30℃摇床培养，每24h从培养基中转移1mL培养基上清于-70℃保存，并保持培养瓶中培养基的量和培养基中甲醇0．5％的浓度不变。8d后行SDS—PACE检测表达的蛋白，用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化获得GST-VBMDMP融合蛋白；用凝血酶切割GDT—VBMDMP并分离获得VBMDMP。结果VBMDMP能够抑制鼠主动脉内皮细胞管状结构的形成；同时VBMDMP(10、6、2mg/kg)对小鼠Lewis肺癌原发瘤具有显著抑制作用(瘤重抑制率分别为96．6％、82．1％、61．2％)。VBMDMP(GST—VBMDMP 10、6、2mg／kg)对小鼠Lewis肺癌自发性肺转移具有显著抑制作用(自发性肺转移瘤结节抑制率分别为96．8％、87．9％、75．3％)。结论、VBMDMP能够抑制鼠主动脉内皮细胞管状结构的形成，并对小鼠Lewis肺癌原发瘤和肺转移具有明显的抑制作用。     

AFPmRNA检测在鉴别诊断良恶性腹水的价值

[目的]鉴别诊断良恶性腹水。[方法]采用RT—PCR技术检测腹水中是否存在肝癌细胞，其中良性腹水24例，恶性腹水32例。[结果]良性腹水AFPmRNA阳性率为8．3％(2／24)，恶性腹水阳性率为92％(29／32)，用AFPmRNA鉴别诊断良恶性腹水的特异性为91．6％，敏感性为90．6％。[结论]用Nested—RT—PCR检测方法鉴别良恶性腹水具有很高的特异性和敏感性，是一种灵敏、准确的检测手段。     

大肠癌耐药基因的表达及临床意义

[目的]研究大肠癌多药耐药基因(MDR-1)表达与临床耐药的关系。[方法]应用逆转录-多聚酶链式反应技术(RT／PCR)和免疫细胞化学染色法检测了3l例大肠癌患者(初治原发癌19例，复发转移癌12例)的MDR-1mRNA水平和多药耐药蛋白(P-170)的表达，并对两种方法进行了比较。[结果]结果显示：初治原发性大肠癌19例中MDR-l mRNA基因阳性表达15．7％，P-170阳性为15．7％；而复发转移癌12例中，MDR-l mRNA基因阳性表达66．67％，P-170阳性为58．33％。[结论]复发转移癌比初治原发癌具有更普遍的抗药性，且主要是获得性抗药，MDR-l的基因和蛋白质两^[1]种检测方法具有一定的一致性，以RT／PCR方法具有更强的敏感性，MDR-l基因表达可以作为预测化疗效果的一个重要参考指标．     

多重PCR用于缺失型α-地中海贫血的基因检测

为了探讨多重PCR技术在检测我国南方常见缺失型α—地中海贫血中的临床应用，观察缺失型α—地中海贫血的基因分布频率，采用单管多重DNA扩增的方法(M—PCR)对经血红蛋白定量分析初步诊断为标准型和静止型α—地中海贫血及血红蛋白H(HbH)病的145例患者进行基因检测。扩增产物经1．2％琼脂糖凝胶电泳，出现1．3及1．8kb条带者，提示为-^SEA／αα；1．6及1．8kb条带者为-α^4.2／αα；1．8及2．0kb条带者为-α^3.7／αα；1．3及1．6或2．0kb条带，提示为缺失型HbH病(-^SEA／-α^4.2或-^SEA／-α^3.7)。结果表明，145例受检者中发现100例-^SEA／αα(68．9％)，15例-α^3.7/ αα(10．3％)，8例-α^4.2/αα(5．52％)，2例-α^3．7／-α^4.2(1．38％)，-α^3.7及-α^4.2纯合子各1例(0．69％)；14例-SEA／αα(9．65％)，2例-SEA／-α^4.2(1．38％)；另有2例患者产前诊断证实为Bart水肿胎儿。结论：运用多重PCR技术可以准确、简便、快速地检测我国南方地区常见的-α^3.7、-α^4.2、-^SEA3种缺失型α-地中海贫血，这一技术对α—地中海贫血的大人群筛查及携带者的检出是一种较为理想的方法。     

一种新的FGA基因无义突变导致遗传性无纤维蛋白原血症

目的　对 1例遗传性无纤维蛋白原血症患者及其家系成员进行基因分析,探讨遗传性无纤维蛋白原血症发病的分子机制。方法　凝血酶法与免疫比浊法测定血浆纤维蛋白原 (Fg)含量,提取先证者及其家系成员外周血基因组DNA,PCR法扩增其Fg的FGA、FGB和FGG基因所有外显子和侧翼序列,DNA序列分析Fg的基因异常。将先证者突变序列、家系成员和 50名正常人相应序列的PCR产物用限制性内切酶RsaⅠ消化,以进一步确定基因突变位点并排除基因多态性。结果　用Clauss法检测不到先证者及其父亲的血浆Fg,用免疫比浊法测定时,Fg含量均<0. 02g/L。两人FGA基因外显子 4第 3108位核苷酸发生C→T纯合性改变,使Fg的Aα链第 150位密码子 (CAG,编码Gln)突变为终止密码TAG。先证者及其父亲的FGA基因外显子 4和侧翼序列的PCR产物,不能被RsaⅠ酶切,其母亲及部分家系成员的PCR产物被部分酶切,而正常人和该家系中的 5个成员的PCR产物可被完全酶切。结论　FGA基因(外显子 4)Q150X无义突变导致该家系先证者及其父亲遗传性无Fg血症,家系中部分成员为携带者,此突变是一种国际上尚未报道的新的突变类型。     

乳腺癌相关分子人乳腺珠蛋白基因的克隆及原核表达

[目的]克隆乳腺癌相关分子人乳腺珠蛋白（hmnan mammaglobin，hMAM）基因并诱导其表达，为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础，从而为早期发现乳腺癌提供科学的监测方法。[方法]从乳腺癌组织提取总RNA，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增hMAM基因编码序列．将扩增产物克隆至PGEM-T载体中，DNA测序。用限制性内切酶切下目的基因，与相同酶切的表达载体pQFA0连接、筛选、鉴定，构建pOE40-hMAM融合表达质粒，以硫代半乳糖苷（IPTG）诱导在大肠杆菌M15中表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析表达结果.[结果]琼脂糖凝胶电泳显示聚合酶链反应（PCR）扩增产物的分子量大小与预期相符。对重组质粒分析表明，插入片段的序列与文献报道hMAM基因编码序列一致。在IPTFG的诱导下，M15重组菌高效表达出一个相对分子质量约为34kD的产物。[结论]重组表达质粒pQE40hMAM表达成功。     

实时定量RT—PCR检测临床肝组织标本中CXCL16及其受体的表达

[目的]建立实时定量RT—PCR方法并检测不同病理状态的肝脏组织中CXCL16趋化因子及其受体CXCR6的表达变化。[方法]建立外参照标准和灵敏的荧光实时定量RT—PCR方法，检测人正常肝组织、癌旁肝组织及癌组织标本中的趋化因子CXCL16及其受体的表达变化，进一步测定和比较其它相关的趋化因子表达谱的表达情况。[结果]获得了灵敏特异的实时定量RT—PCR方法，CXCL16及其受体在癌旁肝损伤组织中显著上调表达，显著高于趋化因子表达谱中其它趋化因子的表达变化，提示它在淋巴细胞尤其是T细胞介导的肝脏损伤过程中可能发挥重要作用。[结论]简便可靠的实时定量RT—PCR适用于检测病理组织中特异基因的表达变化，趋化因子表达谱改变尤其是CXCL16及其爱体CXCR6的显著变化可能与肝脏疾病的病理发生发展密切相关。     

中国老年人心肌梗死遗传易感性与血管内皮型一氧化氮合酶基因Glu298Asp多态性的关系

背景：诸多研究认为血管内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)基因多态性与心、脑、肾疾病存在相关性，但eNOS—Glu298Asp与中国老年人心肌梗死的关系是否相关尚不明确。设计：以诊断为依据的病例对照研究。目的：探讨老年人血管内皮型一氧化氮合酶基因Glu298Asp多态性的分布，及其与老年心肌梗死的关系。地点、对象和方法：37例老年心肌梗死患者为病例组，均为南京医科大学第一附属医院门诊及住院患者，其中20例既往无高血压史者为病例亚组；172例本院体检中心复检者(对照组)，其中92例既往无高血压者为对照亚组，分别检测病例组和对照组的身高、体质量、空腹血脂等指标，采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)检测eNOS基因Glu298Asp多态性。主要观察指标：4组老年人eNOS基因Glu298Asp多态性及298Asp等位基因频率。结果：病例组Glu／Asp基因型高于对照组(32．43％和18．02％)，两组eNOS基因Glu298Asp多态性构成差异有显著性意义(x^2=3．87，P&;lt;0．05)。病例亚组Glu／Asp基因型(35．00％)高于对照亚组(10．87%)，差异有显著性意义(x^2=7．43，P&;lt;0．01)。病例组298Asp等位基因频率高于对照组，差异无显著性意义(P&;gt;0．05)。病例亚组298Asp等位基因频率高于对照亚组，差异有显著性意义(x^2=6．82，P&;lt;0．01)。结论：eNOS基因Glu298Asp多态性在中国老年人群中存在，Glu／Asp基因型和298Asp等位基因可能是中国老年人心肌梗死的遗传易感指标。     

三种方法检测乙型肝炎YMDD变异的比较研究及临床结果分析

目的对检测乙型肝炎病毒（HBV）YMDD变异的3种方法进行灵敏度和特异性比较,并结合患者治疗前HBVDNA载量、丙氨酸氨基转移酶（Au）水平免疫标志物和YMDD变异后HBVDNA载量等临床信息进行结果分析。方法分别以荧光定量PCR（FQ—PCR）、通用模板信号扩增PCR（UT—PCR）和聚合酶链反应微板核酸杂交一酶联免疫吸附法（PCRmnh—ELISA）,对拉米夫定治疗过程中血清出现HBVDNA由阴转阳的52例慢性乙型肝炎患者,进行HBVYMDD变异检测,比较3种方法的敏感性,并对3种方法检测结果不一致的标本进行测序,比较他们的特异性。结果FQ—PCR、UT—PCR和PCRmnh—ELISA对YMDD变异的检出率分别为：53．85％、48．08％、73．07％,FQ—PCR和UT—PCR均与PCRmnh—ELISA差异有统计学意义（P〈0．05）,FQ—PCR与UT—PCR差异无统计学意义（P〉0．1）。检测结果不一致的17例标本进行了测序,FQ—PCR、UT．PCR、PCRmnh—ELISA与检测结果的符合率分别为94．1％、70．6％、29．4％,3者之间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论3种方法比较,FQ—PCR检测HBVYMDD变异具有较高的灵敏性和特异性,并能同时检测出野生株和变异的混合感染,与测序结果相符,是诊断HBVYMDD变异较好的方法。     

PCR-酶谱分型检测宫颈癌活检组织中人乳头瘤病毒和疱疹病毒基因型

[目的] 探讨病毒病原学因素（人乳头瘤病毒和疱疹病毒基因型）与宫颈癌发病的相互关系。[方法] 采集390例宫颈癌，136例尖锐湿疣，176例宫颈糜烂病人宫颈活检组织，对照组94例正常妇女宫颈分泌物，应用PCR-核酸内切酶分型检测活检组织和阴道分泌物中人乳头瘤病毒（HPV）和疱疹病毒（HSV1，HSV2，CMV，EBV）基因型。[结果] 在390例宫颈癌活检组织中检出高危型HPV（16、18、35型）阳性152例（38．9％），HSV2型135例（34．6％）；176例宫颈糜烂病人检出高危型HPV（16、18、35型）阳性56例（31．8％），HSV2型33例（18．7％）；136例尖锐湿疣病人检出低危型HPV（6、11型）阳性80例（58．8％）；对照组94例正常妇女宫颈分泌物检出HPV和HSV阳性率均为3．2％。核酸内切酶分型检测结果：宫颈癌病人HPV16，18，35型和HSV2型阳性率分别为23．3％，14．6％，1．0％，34．6％，尖锐湿疣病人HPV6，11型阳性率分别为36．0％和22．8％。两组比较有显著性差异（P〈0．001）。[结论] 高危型HPV（16，18，35型）和疱疹病毒HSV2型与宫颈癌发病密切相关。     

结核分枝杆菌MPT64基因克隆与表达质粒构建

[目的] 克隆并构建编码结核分枝杆菌MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。[方法] 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出MPT64基因(687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coil DH5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。[结果] 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道一致，证实符合表达框架。[结论] 成功地克隆并构建了MPT64基因的重组表达质粒pGEX-MPT64。