H1299细胞中P1k3对p73转录活性的影响

背景与目的:研究表明蛋白激酶P1k3可以增加肿瘤抑制因子p53的转录活性,但对p73转录活性的影响尚不清楚,因此本实验旨在研究蛋白激酶P1k3对p73转录活性的影响.方法:选用p53缺失型人类肺癌细胞系H1299,采用荧光素酶报告剂分析、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及克隆形成实验的方法研究蛋白激酶P1k3及激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73转录活性的影响.结果:荧光素酶报告剂分析结果显示,单独转染p73基因可以增加p21~(WAF1)和Bax启动子介导的荧光素酶的表达(P<0.05);共转染p73基因和P1k3基因,p21~(WAF1)和Bax启动子介导的荧光素酶的表达与单独转染p73基因组相比显著降低(P<0.05),且呈浓度依赖性;而激酶活性缺失的Plk3(K52R)对p21~(WAF1)和Bax启动子介导的荧光素酶的表达没有显著影响(P>0.05).RT-PCR检测结果也显示,p73诱导p2~(WAF1)和Bax的mRNA表达(P<0.05),P1k3降低了p73诱导的p21~(WAF1)和Bax的mRNA表达水平(P<0.05);而激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73诱导的p21~(WAF1)和Bax的mRNA表达水平无显著影响(P>0.05).克隆形成实验结果显示,p73抑制了H1299细胞克隆的形成(P<0.05),P1k3降低了p73对H1299细胞克隆形成的抑制(P<0.05),而激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73抑制H1299细胞克隆形成无显著影响(P>0.05).结论:P1k3可以抑制p73的转录活性,而激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73的转录活性无明显影响.     

人黑素瘤抗原MAGE-A4对p53转录活性的影响

目的:探讨人黑素瘤抗原-A(melanoma antigen-A,MAGE-A)对p53转录活性的影响.方法:选用p53缺失型人肺癌细胞系H1299,采用荧光素酶报告分析法、RT-PCR、Western印迹法、克隆形成实验和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling,TUNEL)等方法研究MAGE-A4对p53转录活性的影响.结果:荧光素酶报告分析结果显示,转染p53基因(25 ng)可以使p21WAF1启动子介导的荧光素酶表达增加(P＜0.01);共转染恒定量(25 ng)的p53基因和不同量的MAGE-A4基因(100、200和400 ng)后, p21WAF1启动子介导的荧光素酶表达均明显高于单独转染p53基因时的表达量(P＜0.01).RT-PCR和Western印迹法检测结果也显示,转染p53基因可以使p21WAF1mRNA和蛋白表达水平增加(P＜0.01),共转染MAGE-A4基因和p53基因后,p21WAF1mRNA和蛋白表达水平均明显高于单独转染p53基因时的表达水平(P＜0.01).克隆形成实验及TUNEL染色结果显示,转染p53基因可以使H1299细胞克隆形成数减少及凋亡细胞数增加(P＜0.01),共转染MAGE-A4基因和p53基因以后,H1299细胞克隆形成数与单独转染p53基因组相比减少,而凋亡细胞数与单独转染p53基因组比较增加(P＜0.01).结论:MAGE-A4可以增强p53的转录活性及功能发挥.     

结直肠癌中survivin 、caspase-3 、p21WAF1的蛋白表达及其意义

 目的 探讨结直肠癌中survivin、caspase-3和p21^WAF1的蛋白表达与临床病理参数的联系以及survivin与caspase-3和p21^WAF1蛋白表达之间的关系。方法 采用免疫组织化学SP方法检测15例正常结直肠粘膜和62例结直肠腺癌标本中survivin、caspase-3和p21^WAF1的蛋白表达。结果 结直肠腺癌与正常结直肠粘膜比较,survivin、caspase-3和p21^WAF1的蛋白表达差异均有显著性（P〈0.05）。survivin和caspase-3的蛋白表达与淋巴结转移无明显相关（P〉0.05）;而与分化程度均显著相关（P〈0.05）。survivin蛋白与Dukes分期相关（P〈0.05）;但caspase-3的蛋白表达与Dukes分期无关（P〉0.05）。p21^WAF1蛋白表达与分化程度、淋巴结转移和Dukes分期均显著相关（P〈0.05）。survivin蛋白分别与caspase-3、p21^WAF1蛋白表达之间均呈显著负相关（P〈0.01）。结论 survivin、caspase-3和p21^WAF1蛋白在结直肠癌的发生和进展中都起着重要的作用。p21^WAF1基因与结直肠癌的恶性进展显著相关,此结论鲜见报道。     

EBV-miR-BART5-3p靶向p53对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响

目的:研究爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）-miR-BART5-3p对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响,并探讨其作用机制。方法:体外培养人EBV阳性鼻咽癌细胞（C666-1）和人鼻咽癌细胞（CNE-2Z）,将CNE-2Z组细胞设置为正常组,C666-1细胞随机分为对照组、EBV-miR-BART5-3p NC组、EBV-miR-BART5-3p mimics组和EBV-miR-BART5-3p inhibitor组。用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞及EBV阴性鼻咽癌患者和EBV阳性鼻咽癌患者癌组织中EBV-miR-BART5-3p表达情况,噻唑蓝（MTT）法检测各组细胞存活率,平板克隆实验评估各组放疗敏感性变化情况,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）法检测各组细胞凋亡敏感性变化,蛋白免疫印迹分析法检测转染后各组细胞p53、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、半胱天冬氨酸酶-3（caspase-3）和Bcl-2蛋白表达情况,双荧光素酶报告实验验证EBV-miR-BART5-3p与p53的靶向关系。结果:与EBV阴性组相比,EBV阳性组鼻咽癌组织中EBV-miR-BART5-3p表达水平显著升高（P＜0.05）。与正常组相比,对照组EBV-miR-BART5-3p表达、存活率、克隆数量和Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）,凋亡率、p53、Bax和caspase-3蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。与对照组和EBV-miR-BART5-3p NC组相比,EBV-miR-BART5-3p mimics组EBV-miR-BART5-3p表达水平、存活率、克隆数量和Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）,凋亡率、p53、Bax和caspase-3蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）;与对照组和EBV-miR-BART5-3p NC组相比,EBV-miR-BART5-3p inhibitor组EBV-miR-BART5-3p表达水平、存活率、克隆数量和Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,凋亡率、p53、Bax和caspase-3蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。双荧光素酶报告实验结果显示,与TP53-3' UTR-WT+EBV-miR-BART5-3p NC组比较,TP53-3' UTR-WT+EBV-miR-BART5-3p inhibitor组荧光素酶活性降低（P＜0.05）。结论:下调EBV-miR-BART5-3p可能通过靶向促进p53蛋白表达,提高人EBV阳性鼻咽癌细胞的放射敏感性。     

乙型肝炎病毒X基因经p53依赖性与非依赖性途径对p21WAF1表达的影响

背景与目的:研究表明,在不同情况下乙型肝炎病毒 X基因(HBx)对 p21WAF1的表达具有不同的影响,但作用机制仍不清楚.本研究的目的是探讨 HBx对 p53下游基因 p21WAF1的影响.方法:通过正、反义野生型 p53(wtp53)与 HBx单转染及共转染人肝癌细胞株 SMMC-7721细胞,以及 HBx转染不同内源性 p53状态的肝癌细胞株,检测 p21WAF1启动子荧光素酶基因表达,并用流式细胞仪观察细胞周期的变化 ,Western blot法比较 p53、p21WAF1表达水平的变化.结果:正、反义 wtp53与 HBx 单转染及共转染 SMMC-7721细胞 ,HBx与正义 wtp53共转染组(1.007± 0.098)与单转染正义 wtp53(0.490± 0.012)相比,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显升高(P< 0.05),其余各组 HBx均可导致 p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显减少(P< 0.05).Western blot法表明 HBx可导致 p53的表达增加,但 p53表达较低的 SMMC-7721细胞转染 HBx后 p21WAF1蛋白的表达减弱 ,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达(0.053± 0.010)也较对照组(0.094± 0.013)明显减少(P< 0.05),而 p53表达较强的 HepG2细胞转染 HBx后 p21WAF1蛋白的表达增强、p21WAF1启动子荧光素酶基因的表达(1.252± 0.052)较对照组明显升高(0.767± 0.031)(P< 0.05).细胞周期结果表明瞬时转染 HBx的 SMMC-7721和 Hep3B细胞停滞在 G0-G1期细胞数(42.31%、36.96%)较对照组(47.10%、42.90%)减少,而瞬时转染 HBx的 HepG2细胞(63.62%)停滞在 G0-G1期的细胞数较对照组(57.42%)增加,但稳定筛选后 ,pcDNA3HBxHepG2细胞(57.31%)停滞在 G0-G1期细胞数较对照组(61.49%)减少.结论:HBx一方面可能引起 p53蛋白在细胞内积聚导致 p21WAF1表达升高,另一方面可直接抑制 p21WAF1启动子的转录活性.     

胃癌及癌前病变组织中幽门螺杆菌感染与p53、p21WAF1、PCNA、cyclinA蛋白表达的相关性研究

目的 探讨胃癌及癌前病变中p53、p21WAF1、PCNA、CyclinA蛋白的表达及其与幽门螺杆菌感染的关系。方法 应用免疫组化SP法染色及Warthin-Starry银染色、PCR、尿素酶法检测胃癌及有关病变中p53、p21WAF1、PCNA、CyclinA蛋白的表达和幽门螺杆菌感染情况。结果 在慢性浅表性胃炎（CSG）、慢性萎缩性胃炎、（CAG）、肠上皮化生（IM）、不典型增生（Dys）及胃癌（GC）中,p53阳性表达率随病变发展而逐渐升高,p53阳性表达率分别为0、3.3%、6.7%、25.0%、70.6%。p21WAF1阳性表达率随病变发展而降低,p21WAF1阳性表达率分别为100.0%、96.7%、86.7%、75.0%、42.6%。PCNA和cyclinA阳性表达率随病变发展而升高,PCNA阳性表达率分别为45.0%、60.0%、70.0%、87.5%、85.3%;CyclinA阳性表达率分别为0、6.7%、20.0%、47.5%、58.8%。在同一病变中HP阳性组p53、p21WAF1、PCNA、cyclinA阳性表达率高于HP阴性组,GC组有显著差异（P〈0.05）。就1种基因的表达而言,HP阳性组各类病变之和与阴性组比较均有显著性差异（P〈0.05）。胃癌中p21WAF1与p53蛋白表达呈负相关关系（P〈0.01,γ=-0.598）,PCNA与cyclinA蛋白表达呈正相关关系（P〈0.01,γ=0.956）。结论 p53突变及p21WAF1失活和PC-NA、cyclinA蛋白的高表达及HP感染共同参与胃癌的发生、发展。     

MAGE-A9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞中P53转录活性及功能的影响

目的：探讨黑素瘤相关抗原-A9（melanoma-associated antigen,MAGE-A9）对人乳腺癌细胞中P53转录活性及功能的影响。 方法：通过LipofectamineTM 2000体外转染质粒pcDNA3.0、pcDNA3.0-p53、pCMV6-MAGE-A9 和pcDNA3.0-p53/MAGE-A9至人乳腺癌MDA-MB-231细胞,RT-PCR和Western blotting检测细胞中 p21WAF1 mRNA和蛋白的表达,荧光素酶报告基因分析检测细胞中 p21WAF1 启动子介导的荧光素酶表达活性,MTT法检测转染不同质粒对MDA-MB-231细胞增殖的影响。 结果： 转染pcDNA3.0-p53/MAGE-A9组MDA-MB-231细胞中 p21WAF1 mRNA和蛋白表达水平均明显低于pcDNA3.0-p53组\[(0.15±0.01) vs (0.18±0.02),(0.03±0.00) vs (0.06±0.01);均P<0.05\]。转染pcDNA3.0-p53质粒可以增强MDA-MB-231细胞中 p21WAF1 启动子介导的荧光素酶的表达\[(58.56±3.47) vs (1.00±0.12),P<0.01\],转染pcDNA3.0-p53/MAGE-A9后,MDA-MB-231细胞中 p21WAF1 启动子介导的荧光素酶的表达较转染pcDNA3.0-p53组明显降低\[(22.02±4.91) vs (58.56±3.47),P<005\]。与pcDNA3.0组相比,pcDNA3.0-p53组MDA-MB-231细胞增殖率明显明显降低\[(228.89±2239)% vs (337.23± 23.67)%,P<0.05\];而pcDNA3.0-p53/MAGE-A9组MDA-MB-231细胞增殖率明显高于pcDNA3.0-p53组\[(291.51±591)% vs (228.89±22.39)%,P<0.05\]。 结论： MAGE-A9可抑制MDA-MB-231细胞中P53的转录活性及细胞增殖。     

人Bax启动子荧光素酶报告基因的构建和鉴定

[目的]克隆人Bax基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并在细胞内检测其活性。[方法]采用PCR技术从人HepG2细胞中扩增出Bax启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,经测序确定所扩增的DNA序列,并将其转染入H1299细胞中检测其活性。[结果]测序结果表明扩增的Bax启动子序列正确,双报告基因实验检测荧光素酶活力表明构建的报告基因具有启动子活性。[结论]克隆了Bax启动子,成功构建了人Bax启动子报告基因,为p53家族凋亡通路的功能研究提供了必要的实验材料。     

人乳腺癌中p21WAF1组蛋白H3、H4乙酰化水平的表达变化

[目的]探讨人乳腺癌中p21WAF1组蛋白H3、H4乙酰化水平的变化及其意义。[方法]应用HE染色鉴定乳腺癌的病理形态变化,RT—PCR检测p21WAF1mRNA的表达,染色质免疫沉淀法检测p21WAF1组蛋白H3、H4乙酰化的状态。[结果]HE染色可见,与癌旁组织及正常乳腺组织相比,乳腺癌组织结构及细胞形态有明显的异型性。RT—PCR检测结果显示,乳腺癌组织中p21WAF1mRNA的表达水平明显低于癌旁组织及正常乳腺组织（P〈0．05）;p21WAF1mRNA在组蛋白H3、H4乙酰化水平降低乳腺癌中的表达明显低于组蛋白H3、H4乙酰化水平非降低乳腺癌中的表达（P〈0．05）;p21WAF1mRNA表达降低与人乳腺癌的临床分期、分化程度和淋巴结转移有关。染色质免疫沉淀法显示,乳腺癌组织中p21WAF1组蛋白H3、H4的乙酰化水平明显低于癌旁组织及正常乳腺组织;p21WAF1乙酰化水平降低与人乳腺癌的分化程度和淋巴结转移有关。[结论]p21WAF1组蛋白H3、H4乙酰化的表达变化与乳腺癌的发生发展密切相关。     

破坏泛素依赖的蛋白水解通路对p53转录激活的抑制作用

目的 :研究功能性泛素化及蛋白酶体水解过程对p5 3转录激活的影响。方法 :通过瞬时转染报告基因法 ,测定内源、外源性p5 3或p5 3转录活性片断的转录能力 (荧光素酶活性 ) ;Western blot法测定细胞内p5 3及其靶蛋白p2 1waf1 的表达水平。结果 :抑制蛋白酶体水解过程 ,细胞内源、外源性p5 3及p5 3转录活性片断的转录能力均降低 ;泛素化途径缺失时 ,p5 3转录能力被显著抑制 ,虽然细胞内p5 3蛋白堆积 ,但其下游靶蛋白p2 1waf1 的表达却无增加。结论 :p5 3泛素蛋白酶体水解途径与其转录激活过程存在功能性联系     

In vivo evaluation of the role of DNp73alpha protein in regulating the p53-dependent apoptotic pathway after treatment with cytotoxic drugs

The amino terminus truncated p73 isoform, DeltaNp73alpha, shows dominant negative behavior toward TAp73 and wild-type p53, and has oncogenic potential. By contrast, we recently showed that in HCT116 clones forced expression of DeltaNp73alpha did not increase in vitro cellular resistance to anticancer agents. The purpose of this study was to characterize in vivo models and to investigate the functional interaction between the DeltaNp73alpha isoform and the p53 pathway. Human colon carcinoma HCT116 clones expressing inducible DeltaNp73alpha (HCT116/DN3, HCT116/DN14) and HCT116/8a (transfected with the mock empty vector), transplanted in immunodeficient nude mice, were used to study the antitumor activity of cis-diammine-dichloro-platinum (cDDP) (4 mg/kg, i.v., q7d x 3) and Doxorubicin (DX) (7.5 mg/kg, i.v., q7d x 3), with or without tetracycline-induced DeltaNp73alpha overexpression. DeltaNp73alpha expression was confirmed by RT-PCR, immunoblotting and immunohistochemical analysis. DeltaNp73alpha subcellular localization after DX treatment was checked by an immunofluorescence assay. Western blot was used to analyze p53, p21, Bax, Bcl-2 and p53AIP1 expression. DeltaNp73alpha overexpression did not modify the antitumor activity of either DX or cDDP in xenograft models. DX reduced DeltaNp73alpha protein expression, without affecting its nuclear localization. p53, p21, Bax and p53AIP1 protein expression increased and Bcl-2 decreased in HCT116 clone derived tumors 24 hr after DX exposure, independently of the presence of DeltaNp73alpha. Overexpression of DeltaNp73alpha does not affect tumor growth in vivo, does not increase the resistance of established tumors to anticancer agents and does not antagonize p53 apoptotic functions.     

p53蛋白及其突变体对RhoE基因转录调控的影响

目的:探索p53蛋白及其突变体对RhoE基因转录调控的影响。方法:构建pEGFP-wt-p53质粒,利用基因定点突变PCR技术构建p53单点和双点突变体质粒,构建pGL3-RhoE-promotor-Luc质粒。以P21基因的启动子序列(P21-promoter-luc)为阳性对照,EGFP-N1空载体为阴性对照,将野生型和突变型p53质粒瞬时转染PC3(p53-null)细胞,利用双荧光素酶报告基因和Westernblot方法检测p53蛋白及其突变体蛋白在转录水平和蛋白水平对RhoE基因表达的影响。结果:电泳及测序表明以上质粒均构建成功。双荧光素酶报告基因检测显示野生型p53蛋白可调控RhoE基因转录,但其突变体丧失对RhoE的转录调控作用(P0.05),且不同位点的p53突变体蛋白之间对RhoE转录调控作用的差别无统计学意义(P0.05)。Western blot结果与基因转录结果一致。结论:RhoE是受p53蛋白调控的基因之一,而p53突变体失去了在转录水平调控RhoE表达的作用。     

癌基因iASPP-SV参与乳腺癌的形成

背景与目的：p53凋亡刺激蛋白抑制剂(inhibitor of apoptosis-stimulating protein of p53，iASPP)属于ASPP家族成员，其与p53结合，抑制p53靶基因的转录活性，抑制细胞凋亡，与肿瘤形成相关。先前该研究所在课题组发现了iASPP的一个新亚型iASPP剪切变异体(iASPP splice variant，iASPP-SV)，其是包含407个氨基酸残基的核蛋白，能与p53结合、抑制p53的转录活性，但是其与乳腺癌细胞增殖的作用还不清楚。因此，该研究旨在探讨iASPP-SV在乳腺癌发生、发展中的作用。方法：用5’-基因末端快速扩增(rapid ampliifcation of cDNA ends，RACE)方法检测乳腺癌细胞系MCF-7的iASPP-SV mRNA的5’末端序列。将pFLAG-iASPP-SV和pFLAG-iASPP(828)分别转染HEK 293细胞，采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测HEK293细胞及8种人类肿瘤细胞iASPP-SV的表达情况。建立稳定表达FLAG-iASPP-SV和FLAG-iASPP(828)的NIH 3T3细胞系，细胞增殖分析、克隆形成实验和软琼脂集落形成实验检测iASPP-SV、iASPP(828)是否促进细胞增殖、是否是癌基因。用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time lfuorescent quantitative polymerase chain reactive，RTFQ-PCR)的方法检测原发性乳腺癌iASPP-SV和iASPP(828) mRNA表达水平，确定人乳腺癌中iASPP-SV是否上调。用荧光素酶报告基因实验检测iASPP-SV、iASPP(828)、p53与NF-κB/p65的关系。结果：5’-RACE方法显示，MCF-7细胞中的iASPP-SV由RAI序列(DQ986418.1)编码。Western blot实验显示，多种人类肿瘤细胞系表达内源性iASPP-SV。细胞增殖分析、克隆形成实验和软琼脂集落形成实验证实iASPP-SV与iASPP(828)能促进肿瘤细胞增殖，是癌基因。RTFQ-PCR实验显示，p53野生型乳腺癌组织iASPP-SV表达水平的中位值比p53突变型显著升高。荧光素酶报告基因实验证实iASPP-SV、iASPP(828)能抑制NF-κB/p65转录，因此iASPP可能是双功能蛋白。结论：iASPP-SV可能作为乳腺癌治疗的有效靶点。