抗人巨细胞病毒中和性人源基因工程抗体的研究

目的 研究抗人巨细胞病毒(HCMV)人源基因工程抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术。首先从HCMV感染者外周血中分离淋巴细胞，提取RNA，逆转录后用特异性引物扩增轻、重链基因。然后插入噬菌体载体pComb3，构建噬菌体抗体库。使用纯化的HCMV病毒裂解物对噬菌体抗体库进行4轮富集，然后通过ELISA筛选阳性克隆，并对获得的克隆进行功能鉴定。结果 克隆和表达了3株抗HCMV人源Fab抗体，经ELISA证明均具有抗原结合活性，间接免疫荧光试验证明具有较高的特异性，最后通过病毒中和试验证明其中2株具有中和活性。结论 获得2株抗HCMV人源Fab抗体，具有一定的中和活性，为下一步研究抗HCMV人源全抗体奠定了基础。     

人源抗乙型肝炎病毒基因工程全抗体的研制

目的 研制人源化抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的IgG全抗体。方法 采用噬菌体抗体库技术,从乙肝疫苗免疫后健康人外周血淋巴细胞中提取抗体基因建立抗体库,用纯化的HBsAg筛选Fab抗体;再将获得的抗体轻、重链构建到杆状病毒表达载体pAc-κ-Fc中,转染SF9细胞表达IgG全抗体并进行纯化。免疫荧光检测抗体的表达,竞争抑制ELISA检测其与抗原的结合活性及特异性。结果 获得了一株抗乙肝表面抗原的Fab抗体;在转染后的SF9培养上清中收获到了IgG抗体,竞争ELISA证实该抗体针对HBV表面抗原的特异性抗体。结论 本实验得到了一株人源抗HBsAg的IgG抗体,并进行了纯化。     

人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建、筛选及表达

用常规RT PCR法 ,直接从 5名丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 洗脱 扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。 5轮亲和选择使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。对一阳性克隆在大肠杆菌中表达 ,经ELISA及Westernblot分析鉴定 ,证实成功表达出人源可溶性Fab。对抗体基因VH和VκDNA序列进行测定 ,证实所获基因为抗体可变区基因。抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCV单克隆抗体Fab段的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具。     

流感病毒中和性基因工程Fab抗体的研制

目的 获得基因工程抗流感病毒抗体,为检测其粘膜用药在动物模型中的抗病毒效果奠定基因。方法 从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞,提取总RNA,Oligo-dT逆转录cDNA,聚合酶链反应扩增人IgG轻、重链基因,利用pComb3载体构建噬菌体抗体库。用纯化的流感病毒A／Sydeny/5/97(H3N2）为固相抗原筛选抗体Fab段,并在大肠埃希菌中进行分泌性表达。通过血凝抑制实验、免疫荧光实验和病毒中和实验选择具有中和作用的Fab抗体。结果 分离到两株Fab克隆,IV－2和IV－6,流感病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性,间接免疫荧光实验呈阳性,它们都具有血浆抑制作用,病毒中和实验显示能使病毒滴度下降30倍和20倍。结论 获得了两株具有病毒中和活性的人源抗流感病毒悉尼株的Fab段抗体,为进一步的表达纯化及粘膜给药研究其抗病毒效果提供材料。     

人源抗乙肝表面抗原基因工程抗体的研究

目的 研制人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)基因工程抗体.方法 采集多个HBsAg加强免疫后表面抗体阳性(HBsAb+)志愿者的外周血,分离淋巴细胞,构建人源抗HBsAg Fab噬菌体抗体基因文库.用纯化的HBsAg对抗体库进行富集筛选,经过序列测定确定抗体轻重链型别,分别克隆入真核细胞表达载体pAc-FcR和HL51-14,转染昆虫Sf9细胞和293T细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统和哺乳动物细胞系统实现全抗体的分泌型表达.结果 成功筛选出20株抗HBsAg的人源Fab抗体并制备出其中6株的IgG全抗体,竞争性ELISA结果显示6株全抗体针对的是HBsAg 3个不同表位.结论 成功筛选并获得了6株针对3个不同表位的抗HBsAg的IgG全抗体,为治疗性抗体和新疫苗的研制奠定了基础.     

人源抗呼吸道合胞病毒基因工程单克隆抗体Fab段基因的筛选和表达

目的采用噬菌体表面呈现和重组抗体技术构建人噬菌体抗体基因库，筛选获得人源抗呼吸道合胞病毒（RSV）Fab段基因并在原核细胞中表达。为研制安全、有效的预防和治疗RSV感染的制剂奠定基础。方法从RSV感染患儿恢复期外周血淋巴细胞中提取细胞总RNA，用一组人IgGF出特异性引物，通过RT—PCR扩增得到一组轻链（κ和λ）和重链Fab段基因，并将此轻链和重链基因片段克隆于pComb3噬菌体载体，电转化XL1-Blu菌构建成抗RSV噬菌体抗体基因库。用纯化病毒颗粒作抗原对此抗体库进行了富集筛选，得到了特异性针对RSV的人源单克隆抗体Fab段基因，并在大肠杆菌中获得有效表达。用ELISA方法检测了此Fab抗体的抗原特异性，并对阳性克隆进行了基因序列分析。结果所构建的抗体库库容为108，从此抗体库中筛选得到的阳性克隆所表达的Fab抗体能与RSV纯化抗原特异性结合，保留了对RSV的抗原特异性。核苷酸序列分析证实，所获得的阳性克隆基因为人源IgG基因。结论本实验获得了特异性抗RSVFab抗体基因并在大肠杆菌中获得表达，表达产物能与RSV抗原特异性结合。     

人源Fab抗体库的构建和抗hPRLR抗体的筛选鉴定

目的构建人源Fab噬菌体抗体库,筛选抗hPRLR抗体片段并进行初步鉴定。方法从乳腺癌患者外周血提取总RNA,通过RT-PCR扩增人抗体轻链和重链基因,构建抗hPRLR人源Fab抗体库。分别以His-hPRLR融合蛋白、BSA-hPRLR表位多肽融合蛋白和GST-hPRLR融合蛋白作为抗原包板,经过3轮循环的吸附-洗脱-扩增的筛选及1轮交叉筛选,挑单克隆用Phage-ELISA、DNA测序筛选阳性克隆,将筛选到的阳性克隆FabG2转化至Top10’受体菌,诱导表达可溶性Fab抗体,通过Western blot和ELISA进行特异性的鉴定。结果构建的人源Fab库容为1.0×109,4轮的筛选,获得6株能与hPRLR结合的人源抗体克隆。选取的FabG2能够进行可溶性Fab抗体蛋白的表达,ELISA初步鉴定,能够与hPRLR进行特异性地结合。结论成功构建了人源Fab噬菌体抗体库,筛选并鉴定了1株抗hPRLR Fab抗体的克隆。hPRLR特异性Fab抗体的获得将为高表达hPRLR乳腺癌的生物免疫治疗奠定了基础。     

人源抗人类免疫缺陷病毒1型基因工程抗体的初步研究

目的 构建噬菌体抗体库,筛选抗HIV-1抗体Fab,并对其进行鉴定.方法 采集无症状、HIV-1抗体滴度较高的HIV-1感染者全血,分离淋巴细胞并提取总RNA,经RT-PCR扩增人轻链基因和重链Fd基因.运用噬菌体展示技术,构建噬菌体抗体库,经过3轮"吸附-洗脱-富集"筛选,将获得的克隆进行诱导表达,表达产物经ELISA检测,筛选阳性抗HIV-1 Fab克隆;对获得的克隆进行抗体基因序列测定并分析序列同源性和互补决定区(CDRs);对获得的阳性克隆与轻链克隆CL8进行链置换并检测链置换前后抗体亲和力的变化;对获得的克隆进行诱导表达及纯化,同时进行中和试验.结果 构建了库容为8×106的噬菌体抗体库;经3轮筛选,获得11株抗HIV-1 Fab克隆,测序和序列分析显示,获得了 10条轻链和8条重链,它们和已经申请专利的部分HIV-1 gp120抗体的基因序列有较高的同源性(轻链同源性为60%～90%;重链同源性为71%～85%);CDRs分析显示,11株抗体CDRHs均比较长(12～20aa);链置换后的抗体亲和力并没有明显的改进;Fab诱导表达量均大于10 mg/L,利用重组HIV-1假病毒系统进行中和试验,结果显示,3株Fab具有一定的中和作用.结论 成功获得抗HIV-1抗体Fab,为进一步对其进行研究和应用奠定基础.     

人源抗人干扰素α1b全抗体在昆虫细胞中的表达、纯化和鉴定

目的克隆、杆状病毒/昆虫表达系统表达人源抗人干扰素α1b(huIFN-α1b)全抗体基因,获得全抗体蛋白。方法利用PCR技术以gIII-scFv融合表达的噬菌粒质粒为模板,分别克隆了5株抗体基因的轻链和重链;经Nco I/Xho I和Sac I/Hind III分别酶切,与经过相同酶切的pAC-K-CH3载体连接构建了昆虫细胞sf9表达载体pAC-K-CH3-H-L;经测序鉴定正确后,转染进入昆虫细胞sf9进行异源表达。采用免疫荧光(IFA)和ELISA对全抗体的表达和结合情况进行初步鉴定。采用Protein-A亲和层析柱对收获的全抗体IgG蛋白进行纯化,将纯化后的抗体蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定。结果成功扩增了人源抗人干扰素α1b抗体轻链和重链基因;免疫荧光(IFA)鉴定表明5株重组质粒在昆虫细胞sf9表达出了全抗体蛋白,ELISA鉴定表明其中3株与huIFN-α1b特异性结合;经Protein-A亲和层析柱纯化后每升细胞培养上清收获了5~20 mg的蛋白,Western blotting鉴定表明3株纯化的全抗体蛋白和huIFN-α1b特异性结合。结论通过杆状病毒/昆虫表达系统获得了3株人源抗人干扰素α1b(huIFN-α1b)全抗体蛋白。     

人源性抗HBsAg单链Fab基因在酵母中的表达

抗乙肝表面抗原的人源性抗体(Fab)在临床上有防治乙型肝炎病毒的应用前景，如用于预防新生儿乙型肝炎病毒的垂直传播和治疗性乙肝制剂等。本文将噬菌体抗体库筛选得到的人源性抗HBsAg Fab抗体基因，通过重叠PCR的方法借Linker将Fab的轻链(L链)和重链(H链)融合构建单一的链，即单链Fab(Single chain Fab)基因，并插入到酵母表达载体pPICZaA中。     

人源性抗HER2胞外段Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建全人源抗HER2胞外段(HER2 ECD)噬菌体Fab抗体库,从中筛选出特异性的抗体,并对其进行鉴定。方法:体外致敏并用EB病毒(EBV)转化HER2高表达乳腺癌患者的外周血单核细胞(PBMC),用PCR分别扩增重链Fd和轻链κ/λ基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建抗HER2 ECD人源化Fab噬菌体抗体库。以纯化HER2 ECD蛋白为抗原进行3轮固相淘选,富集抗HER2 ECD的抗体,并随机挑选克隆进行ELISA,获得的阳性克隆进一步以Western blot鉴定其抗原结合活性,对其中活性最高的克隆进行DNA测序。结果:构建了容量为2.5×107的抗HER2 ECD的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了4株与HE2 ECD特异性结合的阳性克隆,Western blot分析显示其与HER2 ECD能较好的结合。选取结合活性最高的阳性克隆进行DNA序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。结论:成功构建了全人源抗HER2 ECD噬菌体抗体库,并筛选出抗HER2 ECD特异性较强的噬菌体克隆,为获得新的有临床应用价值的HER2 ECD抗体提供了实验基础。     

人源性Fab段噬菌体抗体库的构建及抗人β1-AR抗体克隆的筛选

目的构建人源性Fab段噬菌体抗体库并筛选抗人β1-AR抗体克隆.方法通过RT-PCR从抗人β1-AR抗体阳性的扩张性心肌病(DCM)患者的外周血淋巴细胞中扩增出人IgG重链Fd段和κ、λ两轻链基因片段,将其克隆入噬粒pComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库,并利用噬菌体表面显示技术,以人β1肾上腺素受体细胞外第二环26肽(β1-ARECⅡ)为抗原肽,对此抗体库进行淘筛富集.结果成功地构建了库容量为1.4×106的人源性Fab段噬菌体抗体库,从此抗体库中筛选到了特异性抗人β1-AR Fab段噬菌体抗体阳性克隆.结论利用噬菌体抗体库技术可以获得表达抗人β1-AR抗体的重组克隆.     

人源性噬菌体抗体库的构建和抗CEA抗体的筛选及表达

目的构建人源性噬菌体抗体库,筛选和表达人源性抗癌胚抗原(CEA)单克隆抗体。方法从结肠癌患者肠系膜淋巴结中的淋巴细胞克隆出免疫球蛋白Fd段和κ链基因,建成噬菌体抗体库。用人CEA对抗体库进行筛选,将得到的阳性克隆进行表达及检测。结果抗体库库容为5．2×106,Fab基因重组率为30％。ELISA及Western blot分析检测,证实表达出人源抗CEA单克隆抗体。DNA序列测定,证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。结论成功构建噬菌体抗体库,从中获得人源性抗CEA的单克隆抗体。     

人源抗SARS病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的: 构建人源抗SARS病毒的Fab片段抗体基因的噬菌体表面呈现文库, 筛选抗SARS病毒特异性的噬菌体抗体。方法: 用PCR扩增人Fab片段抗体基因, 连入载体pComb3内, 构建噬菌体抗体库。以固相化的SARS抗原淘筛抗体库, 并用ELISA检测噬菌体抗体结合SARS病毒的特异性。结果: 用PCR共扩增出 13条Ig基因片段。电转化构建的噬菌体抗体库的库容为 1. 3×106, Fab基因的重组率为60%。以纯化的SARS抗原淘筛 3轮, 特异性富集了抗SARS病毒的噬菌体抗体, 并用ELISA法从中筛选出了 10个结合活性好、特异性强的克隆。结论: 成功地构建了人源抗SARS病毒的组合抗体文库, 从中获得人源抗SARS病毒的特异性抗体。     

从噬菌体库中筛选抗SARS病毒S蛋白的Fab中和活性抗体研究

目的 从SARS病毒噬菌体抗体库中筛选出具有中和活性的抗S蛋白Fab片段抗体。方法ELISA方法对抗体库进行富集筛选及人源抗体克隆结合活性的测定，竞争ELISA初步筛选有中和活性的抗体，中和试验进一步确定中和活性，进而对其序列进行测定和分析。结果特异性富集了抗S蛋白噬菌体抗体，竞争ELISA筛选出两株抗体可部分阻断中和抗体2C5与S蛋白的结合，中和试验确定其具有一定巾和活性，编号为M1A和P8A，测序结果表明它们为两株不同的抗体克隆。结论筛选获得了两株抗体可部分中和SARS病毒活性，它们的获得为探索SARS病毒感染的被动免疫治疗打下了一定基础。     

人源抗HIV-1 gp120趋化蛋白受体结合位点Fab单克隆抗体基因的获得

目的：筛选人源抗HIV－1 gp120趋化蛋白受体结合位点噬菌体Fab单克隆抗体基因。方法：根据HIV－1 gp120趋化蛋白受体结合位点的氨基酸序列合成23肽，并以此为固相抗原从HIV－1噬菌体Fab抗体库筛选阳性克隆，并进行鉴定及序列测定。结果：获得了1株抗HIV－1 gp120趋化蛋白受体结合位点的人源Fab抗体克隆，具有较高的亲和力、特异性和抑制率，序列测定及分析显示该抗体属IgG I亚类，κ型，重、轻链可变区分别属VhⅢ和VκⅢ基因家族。结论：成功地获得了人源抗HIV－1 gp120趋化蛋白受体结合位点噬菌体Fab单克隆抗体基因。     

抗HBsAg/RBC双特异噬菌体抗体的构建

目的 通过不同外壳蛋白的展示，构建抗HBsAag/RBC双特异噬菌体抗体。方法通过DNA重组技术，将抗HBsAg Fab与噬菌体基因8融合，抗RBC ScFv与噬菌体基因3融合，这2种融合基因以不同的启动子驱动，并克隆于同一噬菌体表达载体上，得到双特异噬菌体抗体表达载体，转化大肠杆菌后获取噬菌体抗体上清，用ELISA和红细胞凝集试验检测其双特异活性。结果ELISA和RBC凝集实验证明，本方法可形成双特异噬菌体抗体，可使含有HBsAg的RBC悬液产生凝集。用展示性能得到提高的蛋白8变种取代野生型蛋白8可提高双特异噬菌体抗体的活性。结论 HBsAb和RBC两种抗体分子能够通过不同噬菌体外壳蛋白同时展示于同一噬菌体表面，形成双特异噬菌体抗体。可用于人外周血HBsAg的快速血凝法检测。     

抗CD71人-鼠嵌合抗体(D2C)的构建和表达

目的：构建抗CD71人-鼠嵌合抗体的真核细胞表达载体并在真核细胞中表达嵌合抗体。方法：将鼠源性抗CD71单抗(7579)重、轻链可变区基因(VB和VL)分别克隆至含有人IgG轻、重链恒定区的表达载体pγ-Expr和pκ-Expr中；将嵌合表达载体(Chi7579-pγ-Expr和Chi7579-pκ-Expr)经电转染技术共转染至真核细胞(SP2／0)中。结果：经ELISA法检验阳性转染瘤细胞培养上清，证明其表达蛋白产物中同时具有人IgG重链恒定区(pγ)和轻链恒定区(Cκ)蛋白；通过间接免疫荧光流式细胞术(FCM)和间接免疫荧光显微技术，证明该表达产物能够特异性识别和结合表达于靶细胞表面的CC71分子。结论：抗CD71人-鼠嵌合抗体(D2C)在体外真核细胞表达成功。     

bFGF人源性抗体Fab段基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 用自身免疫病患者外周血淋巴细胞获得的bFGF人源性抗体Fab基因,构建编码人源性bFGF抗体Fab表达载体在大肠杆菌中表达,检测其结合抗原的活性.方法 从筛选获得的噬菌体抗体质粒pComb3-Fab中,PCR再扩增出Fd段和κ链基因,克隆到pMD18-T载体中并测序,在NCBI/GenBank的Ig BLAST数据库进行BLAST序列分析.鉴定Fd段和κ链基因后,插入到表达载体pComb3H,切除gene Ⅲ,构建bFGF抗体Fab可溶性表达载体,并在XL1-Blue菌中表达.用SDS-PAGE、Western blot和ELISA方法 鉴定表达产物.结果 Ig BLAST数据库进行BLAST序列分析结果 显示,Fd-6、Fd-25、Fd-26的FWR区与数据库中人源抗体序列FWR区的同源性为95%、97.4%、94.3%,3个CDR区均为特异性序列,证实为人源性抗体Fd段和κ链基因.SDS-PAGE和Western blot检测到目标蛋白带.ELISA结果 显示,表达产物Fab具有与重组人bFGF特异性结合活性,与Human TNF-α、Human IL-2均无交叉反应.结论 插入到表达载体pComb3H的来源于人源性噬菌体抗体库的Fab基因证明为人源性抗体基因,该基因可在XLl-Blue菌株中可溶性表达,且具有特异结合抗原的活性.     

Raji 细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建针对B细胞淋巴瘤Raji细胞系噬菌体抗体库并从中筛选出特异性的抗体。方法以Raji细胞免疫BALB/c小鼠,RT-PCR法从脾淋巴细胞中扩增抗体轻链к和重链Fd基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3H-SS中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Raji细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Raji细胞为抗原进行筛选,获得抗Raji细胞的抗体,通过ELISA法进行抗原结合活性的测定,并对所得阳性克隆进行基因测序分析。结果构建了容量为2.18×107的抗人B细胞淋巴瘤Raji细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Raji细胞系特异性识别结合的8株阳性克隆。对其中两个阳性克隆进行基因序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与免疫球蛋白基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区序列具有高度同源性。结论成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Raji细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础。