电针、艾灸预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌自噬相关蛋白LC 3、Beclin 1表达的影响

目的:观察针灸预处理对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠心肌自噬相关蛋白LC 3、Beclin 1表达的影响,探讨针灸预处理在MIRI过程中对自噬调控的作用机制。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、缺血预适应(IP)组、电针组和艾灸组,每组8只。冠状动脉结扎法建立大鼠MIRI模型。电针组及艾灸组造模前分别电针或艾灸"内关"穴,每次20min,每日1次,连续7d。HE染色法及透射电镜检测左心室心肌病理形态学的变化,TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况及凋亡指数,Western blot法检测LC 3、Beclin 1蛋白在心肌细胞中的表达。结果:模型组心肌损伤较严重,心肌细胞排列紊乱、边界模糊,炎性细胞浸润,部分横纹坏死、溶解,线粒体结构紊乱、模糊,空泡化严重,并出现大量双层膜结构的自噬小体;IP组、电针组及艾灸组心肌损伤较模型组轻微,肌纤维大多正常,肌丝间局灶性水肿,线粒体丰富伴空泡增多,偶见自噬体。与假手术组比较,模型组凋亡指数、LC 3Ⅱ及Beclin 1蛋白表达水平、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ均明显升高(P0.01),LC 3Ⅰ蛋白表达显著下降(P0.01);与模型组比较,IP组、电针组及艾灸组凋亡指数、LC 3Ⅱ及Beclin 1蛋白表达水平、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ均明显降低(P0.01),LC 3Ⅰ蛋白表达明显升高(P0.05,P0.01);电针组凋亡指数、LC 3Ⅱ及Beclin 1蛋白表达水平、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ明显低于IP组及艾灸组(P0.05),而LC 3Ⅰ蛋白表达水平则显著高于IP组及艾灸组(P0.01)。结论:IP、电针或艾灸"内关"穴预处理对MIRI大鼠均具有保护作用,可对MIRI大鼠心肌的自噬产生调节作用,尤以电针最佳,而这种适度调节MIRI过程中的自噬水平可能与下调LC 3Ⅱ、Beclin 1蛋白的表达有关。     

不同时间电针对心肌缺血再灌注大鼠的保护效应及对自噬和凋亡的影响

目的:观察再灌注期不同时间电针对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的保护效应,并分别检测凋亡相关因子Bax、细胞凋亡抑制因子Bcl-2、自噬相关因子(Lc 3Ⅱ、Lc 3Ⅰ)的表达,探讨该保护效应与自噬和凋亡的相关性。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、R 0min组、R 30min组、R 60min组、R 120min组,假手术组6只,其余每组12只。采用左前降支冠状动脉结扎术,缺血30min再灌注4h制备大鼠MIRI模型,假手术组仅穿线不结扎。各电针组选取双侧"内关"穴,分别于再灌注即刻、30min、60min、120min开始电针干预,电针20min。采用Evans Blue-TTC双染法观察各组心肌损伤面积及风险区面积,ELISA法检测血清肌钙蛋白cTn-Ⅰ含量,Western blot法检测心肌组织Bax、Bcl-2、Lc 3Ⅱ、Lc 3Ⅰ蛋白表达水平。结果:与模型组比较,R 30min组、R 60min组、R 120min组心肌梗死面积明显减小(P0.05),各电针组风险面积明显减小(P0.01);与R 0min组比较,R 30min组、R 60min组及R 120min组梗死面积明显减小(P0.05),R 30min组、R 60min组风险面积明显减小(P0.05);与R 30min组比较,R 60min组、R 120min组心肌梗死面积和风险面积均明显升高(P0.05,P0.01)。与假手术组相比,模型组再灌注期血清cTn-Ⅰ、心肌Bax/Bcl-2、Lc 3Ⅱ/Ⅰ均有显著升高(P0.01);与模型组相比,R 0min组、R 30min组、R 60min组、R 120min组再灌注期的cTn-Ⅰ、Bax/Bcl-2、Lc 3Ⅱ/Ⅰ均下降(P0.01,P0.05);与R 0min组相比,R 30min组cTn-Ⅰ降低、Bcl-2表达水平升高(P0.05),R 120min组cTn-Ⅰ升高(P0.05);各电针组间比较,Bax/Bcl-2、Lc 3Ⅱ/Ⅰ表达差异无统计学意义(P0.05)。结论:电针处理可能通过减少再灌注期的凋亡和自噬水平,降低心肌梗死面积,实现对MIRI保护效应,其中以再灌注30min时进行干预最佳。该心肌保护效应与降低自噬和凋亡相关,但相应的效应差异与Bax/Bcl-2、Lc 3Ⅱ/Ⅰ表达非依赖性。     

益心泰对心肌缺血再灌注损伤大鼠JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响

目的观察益心泰对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响,探讨其保护心肌的作用机制。方法采用结扎冠状动脉前降支法建立MIRI大鼠模型。实验大鼠随机分为假手术组、模型组和益心泰低、中、高剂量组。TTC染色检测心肌梗死面积,TUNEL法检测细胞凋亡,ELISA检测白细胞介素(IL)-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,Western blot检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、LC3、Beclin1、p62、JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白Ⅰ(c TnⅠ)表达明显升高(P0.01);心肌梗死面积显著增加(P0.01);TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高(P0.01);LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin 1蛋白表达明显升高(P0.01),p62蛋白表达明显降低(P0.01);Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白表达升高,细胞凋亡率明显上升(P0.01);p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT显著降低(P0.01)。与模型组比较,益心泰各剂量组大鼠CK-MB及c TnⅠ表达明显降低(P0.01);心肌梗死面积显著减少(P0.01);TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低(P0.01);LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin 1蛋白表达明显降低(P0.01),p62蛋白表达明显升高(P0.01);Bax/Bcl-2比值和Caspase-3蛋白表达降低,细胞凋亡率明显降低(P0.01);p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT显著升高(P0.01)。JAK2特异性抑制剂AG490可逆转益心泰对MIRI大鼠JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达、心肌损伤标记物、细胞凋亡、自噬及炎症反应的影响。结论益心泰可通过激活JAK2/STAT3信号通路减轻MIRI大鼠炎症反应、抑制细胞凋亡及过度自噬,从而保护心脏。     

温阳化饮、益气活血法对慢性心力衰竭大鼠自噬-凋亡机制的影响

目的:探讨温阳化饮、益气活血法组方强心胶囊对大鼠心肌细胞自噬相关蛋白表达的影响及其与凋亡之间的关系。方法:90只SD大鼠随机均分为假手术组、模型组、西药组、强心胶囊高、中、低剂量组,各组大鼠成模后给予相应剂量药物灌胃给药,每日1次,连续28 d。超声心动图评价大鼠心脏功能。Western blotting法检测心肌组织自噬相关蛋白5(Atg5)、Bcl-2、Beclin 1、LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ及TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡。结果:与假手术组比较,模型组大鼠左心室收缩末期与舒张末期直径明显增大,左心室射血分数与缩短分数降低,心肌组织中Bcl-2、Beclin 1与Atg5蛋白表达降低,LC3BⅡ/Ⅰ比值降低,细胞凋亡数量增加(P0.05或P0.01)。与模型组比较,各药物干预组大鼠心脏收缩功能均表现为明显改善,心肌组织中Bcl-2、Beclin 1与Atg5蛋白表达增加,LC3B I/LC3B II转换增加,细胞凋亡数量减少(P0.05或P0.01)。与西药组比较,强心胶囊高剂量组心肌组织中Bcl-2、Beclin 1及Atg5蛋白表达增加,LC3B I/LC3B II转换增加,细胞凋亡数量减少更为明显(P0.05或P0.01)。结论:强心胶囊通过上调慢性心力衰竭大鼠心肌细胞自噬,抑制细胞凋亡,发挥改善心脏功能的作用。     

电针预处理对急性心肌梗死再灌注无复流大鼠黏附分子及内皮细胞功能的影响

目的观察电针预处理对急性心肌梗死再灌注无复流大鼠细胞黏附分子及内皮细胞功能的影响。方法将40只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针预处理组、替罗非班组,除假手术组外,其余组大鼠均采用结扎左冠状动脉45 min后再灌注120 min的方法复制急性心肌缺血再灌注无复流模型。实验结束后观察各组大鼠心肌梗死及无复流的范围,采用酶联免疫吸附法检测心肌组织中肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平,并通过蛋白质印迹法检测心肌组织中黏附分子[整合素β_1(Integrinβ_1)、P选择素(P-selectin)、E选择素(E-selectin)]和内皮细胞功能[血管内皮生长因子(VEGF)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、一氧化氮(NO)]相关蛋白表达水平。结果电针预处理组心肌无复流率和梗死率均明显低于模型组(P均0.05);心肌组织中cTnI、CK、CK-MB水平和VEGF、eNOS、NO蛋白表达水平均明显低于模型组(P均0.05), Integrinβ_1、E-selectin和P-selectin蛋白表达水平均明显高于模型组(P均0.05)。结论电针内关、心俞、膻中能够通过调控心肌组织中细胞黏附分子和内皮细胞功能因子的表达,从而减少再灌注无复流现象,缩小心肌梗死面积,起到保护心脏的作用。     

电针、艾灸预处理对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡和自噬的影响

目的:观察针灸预处理对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡指数和自噬相关蛋白LC3表达的影响,探讨针灸预处理对心肌缺血大鼠心肌细胞自噬能力的预保护作用。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、缺血预适应(IP)组、电针组、艾灸组,每组8只。电针组及艾灸组造模前分别电针或艾灸"内关"穴,每天1次,每次20min,连续7d。采用冠状动脉结扎术复制心肌缺血模型。电镜观察左心室缺血区组织病理形态学及心肌细胞自噬体的变化,TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况及凋亡指数,Western blot法检测LC3蛋白在心肌组织中的表达情况。结果:假手术组心肌细胞形态完整,排列整齐,线粒体较完整,可见少量自噬空泡;与假手术组相比,模型组心肌细胞形态不完整,排列紊乱,肌纤维溶解,线粒体肿大,胞核边聚化,自噬空泡较多;与模型组相比,IP组、电针组、艾灸组心肌细胞损伤较轻,少量肌纤维溶解,线粒体丰富,自噬空泡及溶酶体数量增多。与假手术组比较,模型组凋亡指数升高(P0.05);与模型组相比,IP组、电针组、艾灸组凋亡指数均降低(P0.05);与IP组、艾灸组比较,电针组凋亡指数降低(P0.05)。与假手术组比较,模型组心肌组织LC3-Ⅱ表达水平、LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均升高(P0.05);与模型组比较,IP组、电针组及艾灸组心肌组织LC3-Ⅱ表达水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均降低(P0.05);与IP组、艾灸组比较,电针组LC3-Ⅱ的表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值上调(P0.05)。结论:针灸预处理能产生与缺血预适应相似的心脏保护作用,适度提高细胞自噬能力,减少细胞凋亡。     

再灌注期不同时间电针对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中Bcl-2、Beclin1表达的影响

目的:比较再灌注期不同时间电针心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠心肌组织中自噬相关蛋白Beclin1及其抑制凋亡因子Bcl-2的表达量,探讨电针保护缺血再灌注损伤心肌的自噬相关机制。方法:将72只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、即时电针干预组(RA组)、0.5 h电针干预组(RB组)、1 h电针干预组(RC组)和2 h电针干预组(RD组),每组12只。除假手术组外,其余各组大鼠均采用结扎冠状动脉左前降支30 min后松开进行再灌注制备MIRI模型。假手术组不结扎,仅开胸用线穿过冠状动脉左前降支;模型组仅造模,不予其他处理;不同时间电针干预组选取双侧"内关"穴,分别于再灌注即时、0.5 h、1 h、2 h开始电针,各20 min。采用EvansBlue-TTC双染法观察各组大鼠心肌梗死面积,ELISA法检测大鼠血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量,Westernblot法检测心肌组织Bcl-2、Beclin1蛋白表达。结果:与模型组相比,RB、RC、RD组心肌梗死面积百分比均减少(均P0.05),其中RB组较RC、RD组更为显著(均P0.05);与假手术组比较,模型组再灌注期的CK-MB含量与Beclin1表达均有显著升高,Bcl-2表达明显降低(均P0.01);与模型组相比,RA、RB、RC、RD组再灌注期的CK-MB含量与Beclin1表达均下降(P0.05,P0.01),Bcl-2的表达均有升高(均P0.01);与RA组比较,RB、RC组的CK-MB出现下降(均P0.05),Bcl-2上升(均P0.01),而与RD组比较差异无统计学意义(P0.05),其中RB组较RC组Bcl-2蛋白表达显著(P0.05);各电针组Beclin1比较,仅RB组较RA组出现下降(P0.05),其余各组间差异均无统计学意义(均P0.05)。结论:再灌注期不同时间电针均可减少MIRI大鼠心肌梗死面积,其中以再灌注0.5h进行电针干预效果最为显著;该心肌保护效应可能是通过提高Bcl-2表达、降低Beclin1表达以抑制再灌注期的过度自噬而实现的。     

牡荆素抑制自噬和凋亡途径介导大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用

目的:探讨牡荆素在大鼠离体心脏缺血再灌注模型中对心脏的保护作用及潜在机制。方法:SD大鼠随机分为6组:正常对照组、缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)组、牡荆素0. 43、1. 30、4. 32和12. 97μg/ml组,采用Langendorff法建立大鼠离体心脏I/R模型。利用生物机能实验系统检测各组大鼠离体心脏的血流动力学指标,如心率(HR)、冠脉流量(CF)、左室舒张末压(LVEDP)、左室收缩压(LVSP)、左室收缩压最大上升速率(+d P/dt_(max))、左室舒张压最大下降速率(-d P/dt_(min))以及心脏收缩张力,TTC染色法观察大鼠离体心脏的梗死面积,HE染色法观察各组大鼠心肌组织病理学变化。免疫印迹法检测P62、Beclin1、LC3BⅡ/Ⅰ、Cleaved caspase-3(CC-3)和Cleaved caspase-9(CC-9)的表达情况。结果:与对照组相比,I/R组大鼠离体心脏的CF、LVSP、+dP/dt_(max)、-dP/dt_(min)以及心脏收缩张力均显著降低,其HR、LVEDP值显著升高,心肌梗死面积增加,心肌组织病理性损伤显著,心肌组织中自噬相关蛋白LC3BⅡ/Ⅰ比值和Beclin 1的表达上调,P62蛋白下调;凋亡相关蛋白CC-3和CC-9的表达上调。与I/R组比较,牡荆素干预组可显著改善大鼠离体心脏血流动力学指标,减少心肌梗死面积,减轻心肌病理性损伤。Western Blot检测结果显示牡荆素干预各组显著下调自噬相关蛋白LC3BⅡ/Ⅰ和Beclin 1的表达,上调P62蛋白的表达,并显著抑制凋亡蛋白CC-3和CC-9的表达。结论:牡荆素可通过抑制缺血心肌的自噬和凋亡,对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤起到保护作用。     

蒙药额尔敦乌日勒预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织自噬相关蛋白表达的影响

目的探讨蒙药额尔敦-乌日勒预处理抗心肌缺血再灌注损伤的可能作用机制。方法将60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、复方丹参滴丸组和蒙药高、中、低剂量组,每组10只。蒙药高、中、低剂量组分别给予蒙药混悬液每次1. 2、0. 6、0. 3 g/kg灌胃,复方丹参滴丸组给予复方丹参滴丸溶液每次0. 5 g/kg灌胃,假手术组和模型组给予等体积蒸馏水,均每日2次,连续给药2周。末次给药12 h后,除假手术组只穿线不结扎外,其余各组均采用左冠状动脉前降支结扎法制备心肌缺血再灌注损伤模型。造模成功后HE染色观察各组大鼠心肌组织病理学变化,免疫组化检测心肌组织中自噬相关蛋白Beclin1和微管相关蛋白轻链3蛋白Ⅱ(LC3-Ⅱ)蛋白表达,Western blot法检测心肌组织中Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白及PI3K-Aktm TOR信号通路相关蛋白的表达。结果与模型组比较,各给药组能够不同程度改善大鼠心肌组织的病理形态;蒙药中、高剂量组大鼠心肌组织中LC3-Ⅱ及Beclin1蛋白表达均较模型组下降(P 0. 05);蒙药中、高剂量组大鼠心肌组织中PI3K-Akt-mTOR信号通路相关蛋白相对表达量较模型组均升高(P 0. 05)。结论蒙药额尔敦-乌日勒可减轻心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织损伤程度,可能与其下调自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1的表达,从而激活PI3K-Akt-mTOR信号通路有关。     

黄芪多糖抑制缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞凋亡与自噬机制研究

目的:探讨黄芪多糖(APS)对缺氧/复氧(H/R)所致乳鼠心肌细胞凋亡与自噬抑制作用的相关机制。方法:分离并体外培养乳鼠心肌细胞3 d后制备H/R损伤细胞模型,设正常对照组、H/R组、APS低、中、高剂量(20、40、80 μmol/ml)组,各组于造模前30 min给药处理。复氧2 h后,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡水平,Western blot法检测p-Akt、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、p-mTOR、Beclin1、LC3、P62蛋白表达。结果:与H/R组比较,APS中、高剂量细胞增殖抑制率和凋亡率显著降低(P<0.01),p-Akt、p-mTOR、Bcl-2表达量显著升高而Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62表达量显著降低(P<0.05),Bcl-2/Bax比值显著升高、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低(P<0.01)。结论:APS可能通过激活Akt/mTOR通路调控凋亡和自噬相关蛋白表达,对H/R所致乳鼠心肌细胞凋亡与自噬起到抑制作用。     

麦粒灸预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤不同时期保护效应及Beclin 1表达的影响

目的:观察麦粒灸预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)不同时期保护效应差异,探讨该影响与自噬相关蛋白Beclin 1表达的相关性。方法:SD大鼠随机分为模型组、麦粒灸1d组、麦粒灸2d组、麦粒灸3d组、麦粒灸4d组、麦粒灸5d组、麦粒灸7d组,每组6只。选择大鼠双侧"内关"穴进行麦粒灸预处理后,结扎心脏冠状动脉左前降支制备心肌缺血再灌注模型,进行心电图监测并于再灌注4h后取心脏,采用TTC染色评价不同时间预处理的效应差异。在明确麦粒灸预处理最佳干预时间后,增设假手术组、模型组、麦粒灸组、自噬抑制剂组,每组各12只,分别于缺血30min和再灌注240min各6只,ELISA法检测血清中肌钙蛋白(cTnT)含量,HE染色观察心肌病理学变化,Western blot法检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2同源的水溶性相关蛋白(Bax)、Beclin 1的表达水平。结果:与模型组比较,麦粒灸4、5、7d组大鼠心肌梗死面积百分比明显减少(P0.05)。与假手术组相比,模型组心肌纤维断裂、排列紊乱,且有炎性细胞浸润,缺血期与再灌注期cTnT、Bax/Bcl-2、Beclin 1均升高(P0.01)。与模型组相比,麦粒灸组与自噬抑制剂组心肌纤维断裂、排列紊乱程度较轻,间质水肿,少量炎性细胞浸润,缺血期与再灌注期cTnT、Bax/Bcl-2、Beclin 1含量均显著下降(P0.01)。与自噬抑制剂组比较,麦粒灸组缺血期与再灌注期cTnT、Bax/Bcl-2、Beclin 1均升高(P0.05)。各组再灌注期与缺血期相比,cTnT、Bax/Bcl-2、Beclin 1差异无统计学意义(P0.05)。结论:麦粒灸"内关"穴能有效降低心肌梗死面积,该保护效应与自噬相关,其作用机制可能为促进缺血期自噬发生,抑制再灌注期自噬过表达,从而减轻MIRI。     

黄芪多糖对脊髓损伤大鼠脊髓运动神经元组织形态及自噬相关蛋白表达水平的影响

目的:探讨黄芪多糖对脊髓损伤大鼠脊髓运动神经元组织形态及自噬相关蛋白表达水平的影响。方法:选取30只6周龄SPF级SD大鼠,体质量200±30g,采用Allen打击装置处理大鼠T10脊髓,制成脊髓损伤模型,并分为黄芪多糖治疗组、模型组和正常对照组。配置1mg/ml的黄芪多糖注射液,按照10mg/kg的注射量,每天注射1次。术后使用HE染色在7天、14天、28天测量大鼠的运动神经元组织形态;使用Westen Bolt和RT-PCR在0天(6小时)、7天、14天、28天定性、定量检测大鼠Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3蛋白表达情况。结果:染色观察发现,模型组大鼠脊髓内部有大量空洞,出现自噬小体,在黄芪多糖治疗组中有少量的自噬小体,脊髓内部空洞较少。相比模型组,黄芪多糖治疗组抗凋亡蛋白Bcl-2显著升高,(P0.01),Bax显著降低(P0.01),Bcl-2/Bax在7天时显著低于模型组(P0.01),7～28天时Bcl-2/Bax显著高于模型组(P0.01)。Beclin1的表达量在0(6小时)、7天时,黄芪多糖治疗组显著高于模型组(P0.01),7、28天时,黄芪多糖治疗组Beclin1的表达量则低于模型组(P0.05);0(6小时)、7天时,黄芪多糖治疗组LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ的比值显著高于模型组(P0.01),7～28天时,黄芪多糖治疗组则显著低于模型组(P0.01)。结论:黄芪多糖通过调节大鼠自噬相关蛋白Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3的表达水平,使神经元组织自噬先增强后减弱,达到促进脊髓损伤的康复的效果。     

冬凌草甲素联合免疫因子TRAF4对非小细胞肺癌细胞自噬和凋亡的影响及机制研究

[目的] 探讨冬凌草甲素联合免疫因子肿瘤坏死因子受体相关因子4（TRAF4）对非小细胞肺癌细胞自噬和凋亡的影响及机制研究。[方法] 选择不同浓度的冬凌草甲素处理A549细胞，然后采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞的活力。体外培养A549细胞，将细胞分为对照组、冬凌草甲素组、si-NC组（转染si-NC）、si-TRAF4组（转染si-TRAF4）、冬凌草甲素+pcDNA组（转染pcDNA后，选择冬凌草甲素浓度为20 μmol/L处理）、冬凌草甲素+TRAF4组（转染TRAF4后，选择冬凌草甲素浓度为20 μmol/L处理）。采用流式细胞术检测细胞凋亡；蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、微管相关蛋白1的轻链3（LC3）、Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1、自噬相关蛋白7（ATG7）和TRAF4蛋白表达；实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测TRAF4 mRNA表达量。[结果] 不同浓度冬凌草甲素明显抑制细胞活力。冬凌草甲素组细胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG7蛋白表达明显高于对照组；TRAF4 mRNA和蛋白表达、Bcl-2蛋白表达明显低于对照组。si-TRAF4组TRAF4 mRNA和蛋白表达、Bcl-2蛋白表达明显低于si-NC组；细胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和ATG7蛋白表达明显高于si-NC组。冬凌草甲素+TRAF4组TRAF4 mRNA和蛋白表达、Bcl-2蛋白表达明显高于冬凌草甲素+pcDNA组；细胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和ATG7蛋白表达明显低于冬凌草甲素+pcDNA组。[结论] 冬凌草甲素通过下调TRAF4的表达抑制非小细胞肺癌细胞的凋亡和自噬。     

紫檀芪通过调控细胞自噬对抗大鼠心肌缺血/再灌注损伤

目的:观察紫檀芪对大鼠心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)的影响,探讨其保护机制是否与调控心肌自噬有关。方法:72只SD大鼠随机分为六组(n=12),分别为假手术组、MI/RI组、阿司匹林组、紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组和紫檀芪高剂量组,干预14 d后,构建MI/RI模型,观察心肌组织病理改变、测定心肌梗死面积及心肌组织中细胞自噬信号相关蛋白Atg5、Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ和p62蛋白表达水平,测定血清心肌损伤指标乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB),氧化应激指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量。结果:心肌组织病理学检查提示,与假手术组比较,MI/RI组心肌纤维明显断裂,部分坏死,部分细胞结构模糊; 与MI/RI组比较,各治疗组心肌纤维断裂明显减少,细胞结构较清晰(P<0.05)。与假手术组比较,MI/RI组心肌梗死面积、LDH、CK-MB及MDA显著升高(P<0.05),SOD、CAT及GSH-Px显著降低(P<0.05),Atg5、Beclin1及LC3 Ⅰ/Ⅱ蛋白明显升高(P<0.05),p62蛋白显著降低(P<0.05); 与模型组比较,各治疗组心肌梗死面积、LDH、CK-MB和MDA显著降低(P<0.05),SOD、CAT、GSH-Px明显升高(P<0.05),Atg5、Beclin1及LC3 Ⅰ/Ⅱ 蛋白表达降低(P<0.05),p62蛋白表达升高(P<0.05)。结论:紫檀芪预处理能减轻大鼠MI/RI,其机制可能与调控心肌细胞自噬、提高抗氧化能力,从而减轻心肌细胞损伤有关。     

葛根素对脑缺血再灌注大鼠海马组织中Bcl-2、Beclin1及LC3蛋白表达的影响

目的观察葛根素对脑缺血再灌注大鼠海马组织中Bcl-2、Beclin1及LC3表达的影响。方法 28只雄性SD(250~300g)大鼠随机分为假手术组、模型组、葛根素低剂量(50mg/kg)组和葛根素高剂量(100mg/kg)组。连续给药7 d,末次给药1 h后,建立大脑中动脉闭塞模型,缺血90 min后,再灌注24 h,评估神经功能,采用TTC染色观察脑梗死面积,Western Blotting法检测缺血侧海马组织中Bcl-2、Beclin1及LC3蛋白表达的变化。结果与假手术组比较,模型组的大鼠神经功能损伤显著增强,脑梗死面积增加,Bcl-2蛋白表达显著下调,Beclin1蛋白表达显著上调,LC3-II/LC3-I的比值显著上升;与模型组比较,葛根素低、高剂量组随着剂量的增加,大鼠的神经功能损伤逐渐改善,脑梗死面积逐渐减小,Bcl-2的表达逐渐上调,Beclin1的表达逐渐下调,LC3-II/LC3-I的比值逐渐下降,呈剂量依赖性。结论葛根素可通过调控脑缺血/再灌注后凋亡基因Bcl-2的表达,下调自噬相关蛋白Beclin1及LC3蛋白表达,抑制过度自噬,继而达到保护缺血性中风损伤的目的。     

PI3K/Akt/mTOR介导的细胞自噬在电针预处理抗大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用研究

目的 探讨电针预处理通过磷酸酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路对心肌缺血再灌注损伤大鼠的保护机制。方法 将30只雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组、LY294002组、LY294002+电针组,每组6只。在造模前,电针组电针内关穴,LY294002组腹腔注射PI3K/Akt抑制剂LY294002,LY294002+电针组电针内关穴和腹腔注射LY294002,假手术组和模型组腹腔注射等量生理盐水,均1次/d,连续7 d。第8天,除假手术组外,其余组大鼠采用冠脉结扎法进行心肌缺血再灌注造模。再灌注1 h后,HE染色观察心肌细胞病理学形态,Western blot法检测心肌组织中p-PI3K、p-Akt、Bcl-2相互作用蛋白1(Beclin1)、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型(LC3Ⅱ)表达情况。结果 模型组大鼠心肌细胞肿胀、排列紊乱,心肌纤维浊肿,肌原纤维不清,细胞间质有出血及水肿;电针组大鼠轻微心肌损伤,心肌细胞结构依旧清晰;LY294002组大鼠心肌损伤严重,心肌细胞肿胀,肌纤维间隙明显增宽,排列紊乱,线粒体肿胀,自噬泡存在,细胞...     

南葶苈子提取液对心肌缺血/再灌注大鼠心肌自噬及MAPK/ERK1/2通路的影响

目的观察南葶苈子提取液对心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)大鼠心肌自噬的影响并探讨其可能的作用机制。方法大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组、南葶苈子提取液低剂量组、南葶苈子提取液中剂量组、南葶苈子提取液高剂量组。采用结扎大鼠冠脉左前降支缺血30 min、再灌注120 min建立MI/RI模型。检测大鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)水平以及心肌组织丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平,HE染色观察大鼠心肌组织病理学变化,透射电镜观察自噬小体变化,Western blotting测定心肌组织Beclin-1、LC3Ⅱ、B淋巴细胞瘤(Bcl-2)、蛋白激酶p38(p38)和p-ERK1/2蛋白水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠心电图ST段抬高,血清LDH、CK-MB和cTnⅠ均升高,心肌组织MDA含量、Beclin-1、p38蛋白以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高,SOD活力、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白表达降低(P 0.05)。与模型组比较,阳性对照组及南葶苈子提取液中、高剂量组大鼠心电图ST段、血清LDH、CK-MB和cTnⅠ、心肌组织MDA含量、Beclin-1、p38蛋白以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低,SOD活力、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白表达升高(P 0.05)。与阳性对照组比较,南葶苈子提取液低、中剂量组大鼠心电图ST段、血清LDH、CK-MB和cTnⅠ、心肌组织MDA含量均升高,心肌组织SOD活力、p-ERK1/2降低,且南葶苈子提取液高剂量组大鼠血清CK-MB降低,低剂量南葶苈子提取液Beclin-1、p38及不同剂量南葶苈子提取液LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高,南葶苈子提取液低剂量组Bcl-2降低(P 0.05)。心电图ST段、血清LDH、CK-MB和cTnⅠ、心肌组织MDA含量、Beclin-1、p38蛋白以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值随南葶苈子提取液剂量增加呈下降趋势,心肌组织SOD活力、p-ERK1/2蛋白表达随剂量增加呈上升趋势。结论南葶苈子提取液处理可通过降低MI/RI大鼠心肌自噬保护心肌损伤,其保护机制可能与MAPK/ERK1/2通路有关。     

电针“足三里”对功能性消化不良模型大鼠胃窦Cajal间质细胞自噬的影响

目的探讨电针"足三里"治疗功能性消化不良的可能机制。方法将32只SD大鼠随机分为空白组、模型组、电针组、假电针组,每组8只。除空白组外,其余大鼠均采用多因素应激干预法建立功能性消化不良大鼠模型。电针组采用毫针直刺双侧"足三里"15～20 mm,后接韩式穴位神经刺激仪。假电针组采用安慰针灸针针刺双侧"足三里"后不连接电针仪。以上两组均每次干预20 min,每日1次,连续7天。空白组不施加干预措施,模型组仅抓取固定。干预结束后检测各组大鼠胃内残留率和小肠推进率,检测胃窦组织酪氨酸激酶受体(c-kit)、微管相关蛋白1轻链3 (LC3)及自噬基因Beclin1蛋白及mRNA表达。结果与空白组比较,模型组大鼠胃内残留率升高,小肠推进率降低,胃窦组织c-kit蛋白及mRNA表达下调,微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/微管相关蛋白1轻链3Ⅰ(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)及LC3 mRNA、Beclin1蛋白及mRNA表达增高(P 0. 01);与模型组比较,电针组胃内残留率降低,小肠推进率升高,胃窦组织c-kit蛋白及mRNA表达上调,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及LC3 mRNA、Beclin1蛋白及mRNA表达下降(P 0. 05或P 0. 01);模型组与假电针组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、LC3 mRNA指标组间比较差异有统计学意义(P 0. 05),其余指标组间比较差异均无统计学意义(P 0. 05)。结论电针"足三里"能够改善功能性消化不良模型大鼠胃肠动力障碍,其作用机制可能是通过抑制胃窦Cajal间质细胞过度自噬从而恢复细胞数量发挥作用的。     

电针预处理通过调控皮层区自噬改善大鼠脑缺血再灌注损伤

目的:观察电针"百会""曲池""足三里"对脑缺血再灌注损伤大鼠大脑皮层区自噬的影响,探讨电针预处理改善大鼠脑缺血再灌注损伤的机制。方法:SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组,每组11只。电针组电针"曲池""百会""足三里",每次30 min,每天1次,连续5 d。模型组和电针组大鼠末次电针结束30 min后,采用线栓法制备大脑中动脉栓塞模型,使大鼠脑缺血1. 5 h,拔栓再灌注24 h后进行神经功能缺损评分,2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色法检测脑梗死体积,高尔基染色法检测神经元树突棘密度,电镜观察大脑皮层缺血区神经元结构及自噬小体形成情况,Western blot法检测大脑皮层缺血区中微管相关蛋白1轻链3(LC3)和选择性自噬接头蛋白sequestosome-1(SQSTM1/p62)的表达水平。结果:与假手术组相比,模型组大鼠神经功能缺损评分明显升高(P<0. 01),脑梗死体积显著增大(P<0. 01),自噬小体增多,皮层缺血区LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著增加(P<0. 01),p62的表达显著下调(P<0. 01)。与模型组相比,电针组大鼠神经功能缺损评分明显降低(P<0. 01),脑梗死体积显著减小(P<0. 01),自噬小体减少,皮层缺血区LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著降低(P<0. 01),p62的表达显著上调(P<0. 01)。结论:电针预处理可能通过抑制自噬改善脑缺血再灌注损伤。     

电针“足三里”对功能性消化不良大鼠胃排空及自噬信号通路的影响

目的:观察电针"足三里"对功能性消化不良(FD)大鼠胃排空、自噬标记物微管相关蛋白1轻链3(LC3)及自噬信号通路分子腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的影响,探讨电针改善FD胃肠动力障碍的机制。方法:SD大鼠随机分为空白组、模型组、电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组,每组8只。采用多因素应激干预法建立FD模型。电针组电针双侧"足三里"穴,每日1次,连续7d;抑制剂组大鼠予以Compound C腹腔注射(20mg/kg),每日1次,连续7d;电针+抑制剂组大鼠予以Compound C腹腔注射和电针干预。检测各组大鼠胃内残留率、小肠推进率;Western blot法检测胃窦组织酪氨酸激酶受体(c-kit)、LC3-Ⅱ/Ⅰ、自噬基因Beclin 1、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、磷酸化自噬相关蛋白1(p-ULK1)的表达。结果:与空白组比较,模型组大鼠胃内残留率升高,小肠推进率降低(P<0.01),胃窦中的c-kit表达明显降低,LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1、p-AMPK、p-ULK1表达明显升高(P<0.01);与模型组比较,电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组大鼠胃内残留率降低,小肠推进率升高(P<0.05,P<0.01),胃窦中的c-kit表达明显升高,LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1、p-AMPK、p-ULK1表达明显降低(P<0.01);与抑制剂组比较,电针组、电针+抑制剂组大鼠胃窦中的c-kit表达均明显升高(P<0.05,P<0.01),LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1表达明显降低(P<0.05),p-AMPK、p-ULK1蛋白表达明显降低(P<0.01)。结论:电针"足三里"能够改善FD大鼠胃肠动力障碍,其作用机制可能是通过调控AMPK/ULK1信号通路进而抑制Cajal间质细胞过度自噬水平。