人诱导多能干细胞体外多向分化能力的方法验证

 目的 探讨人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)体外多向分化能力的方法。方法 iPSC通过形成拟胚体(embryonic body, EB)的阶段,将其诱导为间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)样细胞,倒置显微镜下观察诱导过程中细胞形态的变化,流式细胞术检测iPSC来源的MSCs(iPS-MSCs)表面标志物的表达,并进一步将iPSC-MSC诱导为成骨、软骨细胞;或直接EB接种,将其诱导成神经细胞。通过上述方法验证iPSC的多向分化能力。结果 诱导后的 iPSC-MSC 逐渐向外生长变为长梭形; CD29、CD105在 iPSC -MSCs 中表达阳性, 而 CD34、CD45则为阴性; 碱性磷酸酶、甲苯氨兰染色结果表明iPSC -MSCs 具有成骨、成软骨的能力;iPSC亦可直接从EB阶段诱导成神经细胞。结论 通过上述方法,可成功诱导iPSC 为成骨、成软骨、成神经细胞,为 iPSC进一步的研究与应用提供了技术基础。     

2008—2017年诱导多能干细胞进展热点可视化分析

目的 通过分析诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)相关文献被国际权威检索工具《科学引文索引》（Science Citation Index,SCI）收录情况,评价近10年来 iPSC领域的发展热点及应用前景。方法 应用文献计量学和数理统计方法对SCI数据库近10年收录iPSC领域科技论文进行统计,并用书目共现分析系统Bicomb、UCINET、gCLUTO进行分析。结果 2008—2017年iPSC领域发文处于高速增长态势,SCI共收录iPSC领域科技论文6 343篇,其中我国发文906篇,美国、日本、中国为核心发文国,基金资助项目也主要集中在这3个国家;发文机构以美国为主,中国仅有中国科学院在榜单之列;期刊分布中载文量大的期刊出版地多为美国等西方国家;高频关键词分析得出近十年来iPSC技术在神经系统疾病、心血管疾病等研究领域的作用也日益突出,iPSC在体外已成功地被分化为神经元细胞、神经胶质细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等,为临床疾病治疗开拓巨大应用前景。结论 随着科技的不断发展,iPSC技术在基础研究和医学领域的优势已日趋显现,iPSC技术将会极大地推动再生医学向前迈进,越来越多的患者也会因此受益。     

放射损伤对创面愈合的影响

放射损伤合并创伤称为“放创复合伤”，主要见于核爆炸、核事故和核恐怖活动。也可见于临床放疗等病例，其中创面或伤口愈合显延缓是一个突出的医学问题。电离辐射延缓创面愈合的机制是“以细胞损害为关键环节的愈合诸因素调控失调”．其中“细胞”同时包括造血细胞和修复细胞，而“损害”则同时包括数量和功能的损害。对放创复合伤创面促愈的一个重要原则是要同时考虑增加创伤局部造血细胞和修复细胞的数量。促进其功能。已经筛选获得了数种对放创复合伤具有促愈作用的药物和生长因子。成体多能干细胞的应用为放创复合伤等严重创伤的救治提供了新的思路和途径     

真皮多能干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究

目的：观察真皮多能干细胞（dMSCs）移植对脊髓损伤大鼠运动功能的修复作用。方法：32只SD大鼠在L4水平制成脊髓全横断损伤模型，并随机分为真皮多能干细胞移植组（A组）及损伤对照组（B组），每组10只大鼠。伤后1w，移植组于伤处移植大鼠真皮多能干细胞（dMSCs），而对照组仅注射等量PBS。分别于移植后1d、1w、8w、12w对两组大鼠进行动物行为学（BBB）评分和脊髓诱发电位（SEP和MEP）检测，并于移植后12w进行损伤脊髓的大体观察和组织学检测。结果：BBB评分4w以后组间比较差异有统计学意义（P〈0．05），移植组明显高于对照组（P〈0．05）；SEP和MEP潜伏期和波幅值在8、12w后组间比较差异有统计学意义（P〈0．05）；移植后12w，移植组损伤脊髓结构的修复明显优于对照组。结论：移植治疗脊髓损伤，能明显改善其运动功能和神经形态，dMSC对脊髓损伤大鼠有治疗作用。     

大鼠骨髓多能成体祖细胞转化为皮肤组织细胞的在体研究

目的 观察大鼠骨髓多能成体祖细胞(mulipotent adult progenitor cells,MAPCs)是否可在体向皮肤组织细胞分化.方法 采用免疫磁性分选技术(MACS)获取MAPCs;通过皮肤受损的C57BL/6小鼠与免疫缺陷性裸鼠的尾静脉注入MAPCs,免疫组织化学技术检测愈合皮肤中大鼠MHC I类抗原的表达.结果 MHC I抗原在C57BL/6小鼠愈合皮肤处的毛囊皮脂腺周围及毛囊外根鞘与皮脂腺交界处均有阳性表达细胞;裸鼠实验组愈合皮肤内出现毛囊样结构,在表皮基底部及部分毛囊样结构中有MHC I抗原阳性表达的细胞.结论 在皮肤组织损伤的条件下,MAPCs可迁移至受损皮肤表面及皮肤附属器毛囊周围,并通过转化为表皮细胞参与受损皮肤的愈合.     

诱导多能干细胞移植对急性心肌梗死小鼠Q-T间期的影响

目的 探讨诱导多能干细胞(iPSc)移植对急性心肌梗死小鼠心脏Q-T间期的影响,并对移植的安全性、有效性进行初步评估.方法 建立小鼠心肌梗死模型并将其随机分为急性心肌梗死组(AMI),急性心肌梗死+生理盐水组(AMI+NS),急性心肌梗死+iPSc组(AMI+iPSc),急性心肌梗死+成纤维细胞组(AMI+Fb),每组...     

成体干细胞研究进展和临床应用前景

成体干细胞多向分化潜能，极大地冲击了传统有关干细胞分化的理论，成体干细胞的研究对揭示生命的本质和内在规律具有重要的意义，本文就成体干细胞概念的演变、多能分化性以及其他特征，临床应用前景和目前存在的问题做一简要概述。并指出应用成体干细胞治疗人类疾病具有广阔的应用前景。     

真皮多能干细胞促进大鼠急性放射损伤造血恢复的研究

目的 观察真皮多能干细胞移植对大鼠急性放射损伤后造血恢复的作用。方法 分离新生大鼠真皮多能干细胞体外培养至第10代用于研究，观察干细胞层体外对正常大鼠骨髓粒-巨噬系祖细胞和红系祖细胞集落生长的影响；进一步将真皮多能干细胞经尾静脉输入5Gyγ射线全身照射的大鼠体内，检测移植后骨髓有核细胞、粒-巨噬系祖细胞集落CFU—GM、红系祖细胞集落CFU—E和外周血白细胞数量、血红蛋白含量等指标的恢复情况，观察4周后动物的存活率。结果 真皮多能干细胞层体外可促进正常大鼠CFU—GM和CFU—E集落的生长；全身输入干细胞促进了5Gyγ射线全身照射动物的外周血白细胞和骨髓有核细胞、CFU-GM和CFU—E集落数的恢复。实验组动物4周后的存活率也明显高于对照组。结论 真皮多能干细胞具有一定支持造血的功能，可促进急性放射损伤大鼠的造血恢复，为造血损伤相关疾病的干细胞治疗提供新的细胞来源途径。     

放射损伤对创面愈合的影响

放射损伤合并创伤称为"放创复合伤",主要见于核爆炸、核事故和核恐怖活动,也可见于临床放疗等病例,其中创面或伤口愈合显著延缓是一个突出的医学问题。电离辐射延缓创面愈合的机制是"以细胞损害为关键环节的愈合诸因素调控失调",其中"细胞"同时包括造血细胞和修复细胞,而"损害"则同时包括数量和功能的损害。对放创复合伤创面促愈的一个重要原则是要同时考虑增加创伤局部造血细胞和修复细胞的数量,促进其功能。已经筛选获得了数种对放创复合伤具有促愈作用的药物和生长因子。成体多能干细胞的应用为放创复合伤等严重创伤的救治提供了新的思路和途径     

CXCR4基因转染促进移植dMSCs向放创复合伤大鼠创面分布的研究

目的 探讨CXCR4腺病毒表达载体(Adv-CXCR4)转染的真皮多能干细胞(dMSCs)移植后可否更多地向放创复合伤大鼠创面分布,并加速创面愈合。方法 ³H-TdR标记Adv-CXCR4转染的dMSCs(A组)、绿色荧光蛋白腺病毒表达载体转染的dMSCs(B组)、未转染病毒载体的dMSCs(C组)后移植到放创复合伤大鼠体内,液闪法测量创面中dMSCs的含量。用生物医学图像分析仪测量伤后创面残留面积。结果 从伤后5 d起,A组创面中dMSCs的含量约占移植细胞总量的1.95%～3.85%,明显高于B组和C组(占移植细胞总量的1.07%～1.86%)。从伤后12 d开始,A组创面残留面积明显小于B组和C组。A组创面愈合时间比B组和C组提前约1.5 d。结论 Adv-CXCR4转染的dMSCs在移植后可更多地分布到放创复合伤大鼠的创面,且能更快地促进创面愈合。     

Ad-hBMP-2基因修饰对兔脂肪干细胞向成骨细胞分化的影响

2001年,Zuk等首次报告从人体脂肪组织提取物(processed lipoaspirate,PLA)中发现有一群具有向多种组织分化潜能的多能干细胞,称之为脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs);并成功地在体外增殖、分化。目前已证实,ADSCs在外来生长因子的诱导下可     

诱导性自体干细胞移植后间质纤维化肾的结构与功能变化

目的观察诱导性自体干细胞经肾动脉移植对肾脏间质纤维化（UUO）模型免肾功能及结构的影响。方法诱导兔成纤维细胞逆向分化为自体多能干细胞，经肾动脉移植到体内，分别于UUO损伤前和UUO损伤后第1、4、8w和移植后第1、4、8w于兔耳缘静脉采血，检测血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN），观察肾功能情况，并于UUO损伤后第16w和移植后第8w随机于模型组和移植组各取1只兔肾做病理切片，观察肾组织病理变化。结果UUO损伤后第4w，两组动物Scr、BUN开始逐渐升高（P〈0．05或0．01）；从诱导性自体干细胞移植后第4W起，移植组Scr、BUN水平逐渐低于模型组（P〈0．05）。模型组可见肾小管数目减少、重度萎缩，萎缩的肾小管基底膜增厚、结构紊乱，肾小球囊腔扩张、囊腔内毛细血管球明显闭塞、呈缺血改变，肾间质弥漫性炎细胞浸润、重度纤维化，呈慢性病改变镜像；移植组可见肾小管中度萎缩，基底膜偏厚，小管多灶性扩张，肾小球囊腔扩张，肾间质散在炎细胞浸润、轻-中度纤维化改变。结论诱导性自体干细胞移植能降低肾脏UUO损伤后血清Scr和BUN水平，在一定程度上促进UUO损伤后的肾结构与功能修复。     

人β防御素2腺病毒表达载体的构建及其在大鼠真皮多能干细胞中的表达

目的 构建和鉴定人β防御素2（HBD2）的重组腺病毒表达载体，并观察其转染大鼠真皮多能干细胞（dMSCs）后的表达。方法反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增HBD2全长cDNA，亚克隆至穿梭质粒（pAdTrack-CMV）中，然后转化含骨架质粒（pAdEasy-1）的大肠杆菌BJ5183，通过同源重组产生腺病毒载体质粒。PacⅠ酶切阳性的重组质粒后转染293细胞，包装出重组病毒载体。用所得重组腺病毒感染dMSCs细胞，并采用RT-PCR和荧光免疫组织化学检测其在dMSCs中的表达情况。结果 经测序、酶切及聚合酶链反应（PCR）鉴定，表明已成功地扩增到HBD2全长cDNA，并将其顺序克隆到穿梭质粒和骨架质粒中，进而组装出腺病毒表达载体。经RT-PCR和免疫组织化学证实构建的病毒载体可感染dMSCs，并有效表达HBD2。结论 本实验成功地构建了含HBD2基因的腺病毒表达载体，并证实其可在dMSCs中表达。     

2016(第八届)干细胞技术与临床转化论坛

干细胞经历最近十年的飞速发展,从胚胎干细胞,到成体干细胞,进一步到诱导型多能干细胞以及这些细胞在动物实验和临床中应用,从小规模的临床研究到部分干细胞产品的上市,无疑给未来的临床应用领域提供巨大想象空间。为了进一步深入了解干细胞临床转化相关政策,探讨干细胞向临床转化过程中面对的科学问题,分析干细胞治疗技术细节障碍,探索干细胞治疗的治病机制,将在北京举办2016(第八届)干细胞技术与临床转化论坛。     

hiPSC多能标志物的表达水平与谱系特异性分化潜能的相关性研究

目的 研究人诱导型多能干细胞(hiPSC)不同多能标志物的相对表达水平与其心肌、神经分化潜能的相关性,为hiPSC作为种子细胞在心脏、神经再生医学研究中的应用提供实验指导.方法 以人类胚胎干细胞(hESC)系h1ESC作为对照,通过实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测2株hiPSC细胞系多能性基因的表达水平;随后,分别利用心肌分化培养基与神经分化培养基对其进行诱导分化.在心肌分化中,通过比较搏动区域数量与面积以及心肌标志物的表达水平,鉴定不同hiPSC的心肌分化潜能;在神经分化中,通过比较早期花结样细胞团的数量与神经标志物的表达水平,鉴定不同hiPSC的神经分化潜能.最后,通过比对hiPSC多能标志物的表达水平高低与谱系分化潜能高低的对应关系,揭示两者的潜在相关性.结果 RT-qPCR结果显示,两株hiPSC相比,hiPSC-0100细胞系中SOX2表达显著较高、NANOG显著较低,hiPSC-WTB细胞系SOX2表达显著较低、NANOG显著较高(P＜0.05).在分化潜能上,形态学与RT-qPCR检测共同显示,hiPSC-0100表现相对较低的心肌分化潜能、较高的神经分化潜能,hiPSC-WTB表现较高的心肌分化潜能、较低的神经分化潜能(P＜0.05).结论 高表达SOX2、低表达NANOG的hiPSC细胞系倾向于具有较高的神经分化潜能;高表达NANOG、低表达SOX2的hiPSC细胞系倾向于具有较高的心肌分化潜能.     

大鼠脂肪干细胞诱导培养成为神经细胞并鉴定的实验研究

目的 探究大鼠脂肪干细胞(r ADSCs)诱导成神经细胞的可行性。方法 第一步,通过酶消化法获取r ADSCs并进行培养,通过CCK-8法检测细胞增殖情况,并应用免疫组化进行鉴定,确定获取的细胞为r ADSCs;第二步以原代培养的r ADSCs为研究对象,传代至第2代后,采用神经诱导培养基,诱导r ADSCs成神经细胞,诱导所得细胞通过形态学及免疫荧光进行鉴定。结果 第一步中细胞培养增殖良好,增殖曲线显示细胞生长活跃,增殖能力强;免疫组化检测相关抗原CD90、CD105为阳性,与造血干细胞相关抗原CD45为阴性,说明所得细胞为r ADSCs。第二步中,诱导培养的细胞神经球免疫荧光染色Nestin阳性,细胞免疫荧光染色MAP-2阳性,结合形态学可确定ADSCs已成功诱导分化成神经细胞。结论 r ADSCs生长活跃,表现出稳定的增长及增殖能力,并可定向诱导分化为神经细胞。     

三种亚型多巴胺受体mRNA在人神经干细胞中的体外诱导表达

目的比较不同培养条件下原代神经球细胞中三种多巴胺受体亚型表达的变化，探讨发育过程中不同亚型多巴胺受体表达调控的机制。方法流产胎儿脑组织经体外培养获得神经干细胞球，再用各种因子进行诱导分化，提取细胞总RNA并用RT-PCR方法检测mRNA转录。结果在神经球细胞中三种多巴胺受体均有表达，中脑与海马来源的神经球细胞无显差异。在无血清培养的条件下，表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及白介素(Ils)诱导均使得D3受体表达下调，而有血清培养时，白介素(Ils)诱导则不能出现下调或关闭的结果。结论因子诱导产生的分化对于D3受体表达起下调或关闭作用。