戊糖多硫酸钠通过抑制P38MAPK通路的激活干预高糖刺激下肾小管上皮细胞的增殖

目的观察戊糖多硫酸钠是否通过调控P38MAPK干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞的损伤。方法利用不同浓度(10 mmol/L~50 mmol/L)葡萄糖刺激人近端肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular epithelial cells,HK-2)48 h,应用CCK-8比色法检测肾小管上皮细胞增殖的改变。利用不同时间段(0~48 h)葡萄糖刺激细胞,用Western blot法检测P38MAPK蛋白的表达水平,分为正常对照组(CON组)、高糖组(high glucose,HG组,葡萄糖30 mmol/L)、戊糖多硫酸钠(pentosan polysuflate,PPS)组(PPS 200μg/ml)、高糖+戊糖多硫酸钠组(HG+PPS组),P38抑制剂组(SB 202190,20μmol/L),p38抑制剂+高糖组(SB+HG组)、p38抑制剂+戊糖多硫酸钠组(SB+PPS),刺激48 h后检测HK-2细胞增殖的改变,刺激6 h后检测HK-2细胞P38MAPK蛋白的表达水平。结果高糖刺激下HK-2细胞增殖在30 mmol/L的浓度最高。与HG组相比,加用戊糖多硫酸钠干预能明显抑制HK-2的增殖,差异有统计学意义(P均0.01);与正常对照组相比,高糖刺激HK-2细胞6 h后磷酸化(p)p38MAPK蛋白表达水平明显增加(P均0.01);与HG组相比,HG加戊糖多硫酸钠干预6 h后HK-2细胞p-p38MAPK蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P均0.05)。应用p38MAPK抑制剂SB202190(20μmol/L)处理细胞,与HG组相比,HG加用SB202190干预能明显抑制p-p38MAPK蛋白表达及HK-2细胞的增殖(P均0.05);与PPS组相比,PPS加SB202190干预后p-p38MAPK蛋白表达降低及HK-2细胞数目减少(P均0.05)。结论戊糖多硫酸钠可能通过抑制p38MAPK的表达,减少肾小管上皮细胞的增殖而对糖尿病肾病起保护作用。     

bcl-2高表达提高肾小管上皮细胞抗凋亡能力的研究

目的 观察凋亡相关基因bcl-2高表达抑制过氧化氢诱导肾小管上皮细胞凋亡的作用.方法 构建含有人bcl-2 cDNA的逆转录病毒真核表达载体PLXSN,脂质体法将重组质粒转染PA317细胞,G418筛选阳性克隆,鉴定后浓缩收集病毒上清,浓缩病毒液,感染人肾小管上皮细胞株HK-2,Western blot检测bcl-2 mRNA表达.5 mmol/L过氧化氢(HO2)诱导细胞凋亡后,流式细胞仪检测细胞凋亡发生变化.结果 流式细胞仪分析显示5 mmol/L H2O2:成功诱导肾小管上皮细胞凋亡,bel-2逆转录病毒感染肾小管上皮细胞后,bcl-2蛋白水平呈高表达,HK bcl-2组细胞凋亡数量(12.41±3.46)较HK-2组(19.62±4.20)显著减少(P<0.05).而转染空载体的对照组无明显变化(19.62±4.20,P<0.05).结论 bel-2蛋白高表达显著抑制氧化剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡.     

KB-R7943对造影剂诱导NRK52E细胞凋亡及p38MAPK信号通路的影响

目的 探讨经钠钙离子交换体介导的细胞内钙超载及p38MAPK信号通路是否参与了造影剂诱导的肾小管上皮细胞损伤及反向模式钠钙离子交换体抑制剂KB-R7943对造影剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡及p38MAPK信号通路的影响.方法 鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)被分成6组:A正常对照组;B造影剂组;C甘露醇组;D CCB(1×10-5mol/L);E KB-R7943(1×10-5mol/L);F KB-R7943(1×10-6mol/L).造影剂作用1 h后,细胞损伤采用LDH检测,细胞形态变化及细胞凋亡分别由倒置显微镜和流式细胞仪检测;细胞内钙通过Fluo-4染色共聚焦微镜测定;钠钙离子交换体mRNA表达采用RT-PCR测定;p38蛋白的表达采用Western blot测定.结果 造影剂作用1 h后,细胞损伤、细胞凋亡、细胞内钙明显增加,显著高于相同渗透压甘露醇组;p-p38表达30min时增加、60 min时下降.KB-R7943显著降低细胞损伤、细胞凋亡、细胞内钙水平、抑制p-p38的高表达述并显示出剂量效应;钠钙离子交换体mRNA表达没有变化.结论 经反向模式钠钙离子交换体导致的细胞内钙超载诱导了造影剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡及p-p38蛋白的高表达;KB-R7943以呈剂量方式降低造影剂诱导的.肾小管上皮细胞凋亡及p-p38蛋白的表达.     

丹酚酸B对马兜铃酸诱导的HK-2细胞TGF-β1与p38MAPK表达的影响

目的：观察丹酚酸B对马兜铃酸（AA）诱导的肾小管上皮细胞（HK-2）TGF-β1与p38 MAPK表达的影响。方法：HK-2细胞传代培养并同步后,培养液中加入不同药物,分为AA诱导组：AA20μg/ml;丹酚酸B干预组：以AA20μg/ml诱导,并分别加入不同浓度丹酚酸B（5、10、20、40μg/ml）;对照组（不加任何药物）。培养24 h、48 h、72 h后,实时荧光定量PCR检测细胞TGF-β1mRNA表达,ELISA检测TGF-β1蛋白合成,免疫印迹检测MKK、p38 MAPK蛋白表达。结果：AA诱导24 h、48 h后,细胞TGF-β1 mRNA及蛋白表达增加,MKK、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）蛋白合成增加。丹酚酸B干预后,可降低TGF-β1 mRNA及蛋白的过表达,MKK、p-p38 MAPK蛋白的合成有下降趋势,在干预48 h后,对TGF-β1的抑制作用随丹酚酸B剂量增加而作用明显。结论：丹酚酸B可能通过下调TGF-β1的表达,部分抑制了p-p38 MAPK的过表达,从而可能减轻马兜铃酸诱导的HK-2细胞凋亡、转分化及炎细胞浸润等病变。     

自噬在脂质诱导的肾小管上皮细胞损伤中脂质聚集中的作用

目的初步探讨自噬在脂质诱导的肾小管上皮细胞损伤中脂质聚集中的作用。方法将HK-2细胞培养后,分为4组:0μg/ml组(A组)、20μg/ml组(B组)、50μg/ml组(C组)、100μg/ml组(D组)。分别用0μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)刺激肾小管上皮细胞24 h,用油红O法检测细胞内中性脂质,通过透射电子显微镜下观察自噬体形成,荧光显微镜下观察LC3-GFP融合蛋白示踪自噬形成,Wester blotting检测LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白。结果①油红O显示在0~100μg/ml浓度范围内LDL随浓度增高刺激细胞内脂质增多;②电镜显示正常HK-2细胞内可见少许自噬泡,在0~50μg/ml浓度范围内随LDL刺激浓度增加,细胞内自噬泡逐渐增多,但达到一定浓度(即100μg/ml)后自噬泡急剧减少;③正常HK-2细胞内可见少许LC3-GFP染色阳性,在0~50μg/ml浓度范围内随LDL刺激浓度增加,细胞内LC3-GFP染色阳性逐渐增多,但达到一定浓度即100μg/ml后LC3-GFP染色阳性急剧减少;④正常HK-2细胞内存在少量的LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ,但以LC3-Ⅰ为主,在0~50μg/ml浓度范围内随LDL刺激浓度增加,LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ均增加,但LC3-Ⅱ增加更明显,50μg/ml LDL组LC3-Ⅰ是0μg/ml LDL组的2倍,LC3-Ⅱ表达是0μg/ml的3倍,差异有统计学意义(均P0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐渐增高,分别为0.41,0.82,1.23,差异有统计学意义(均P0.05),但LDL达到100μg/ml后LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ均急剧减少,100μg/ml LDL组LC3-Ⅰ降至与0μg/ml组LDL相同(P0.05),LC3-Ⅱ表达降至为0μg/ml LDL组的1.5倍,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也急剧下降至0.52,差异有统计学意义(均P0.05)。结论肾小管上皮细胞内自噬与脂质有一定关系,自噬可能参与脂质诱导的肾小管上皮细胞内脂质聚集。     

丙泊酚对脂多糖刺激人单核细胞丝裂原活化蛋白激酶信号通路的影响

目的 研究丙泊酚对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激人单核细胞(human mononuclear macrophage cell,THP-1)丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路的影响.方法 将体外培养的THP-1细胞按完全随机方法分为4组:对照组(C组):给予脂肪乳20 mg/L;LPS刺激组(L组):给予LPS10mg/L;丙泊酚处理组(P组):给予丙泊酚20 mg/L;丙泊酚处理合并LPS刺激组(P+L组):给予丙泊酚20mg/L及LPS10 mg/L.在刺激后0.5、1、2、6h4个时间点通过免疫蛋白印迹分析(Western blot)法检测磷酸化p38MAPK (p-p38MAPK),磷酸化细胞外信号调节激酶(P-extracellular-signal regulated protein kinase,p-ERK)1/2及磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-c-Jun amino-terminal kinase,p-JNK)1/2含量的变化.结果 给予LPS刺激THP-1细胞0.5 h时,L组p-p38MAPK、p-ERK1/2及p-JNK1/2的相对灰度值分别为14.67±0.82、1.34±0.05、4.49±0.51,与C组比较表达均显著增加(P＜0.05).给予刺激1h时,L组p-p38MAPK、p-ERK1/2及p-JNK1/2的相对灰度值分别为11.78±0.75、0.58±0.05、3.31±0.55,与C组比较表达均显著增加(P＜0.05);P+L组p-ERK1/2的相对灰度值为0.14±0.02,与L组比较磷酸化水平显著降低(P＜0.05).给予刺激2h时,L组p-p38MAPK和p-JNK1/2的相对灰度值分别为15.60±0.96、8.33±0.70,与C组比较表达均显著增加(P＜0.05);P+L组p-p38MAPK和p-JNK1/2的相对灰度值分别为4.52±0.23、1.80±0.70,与L组比较磷酸化水平显著降低(P＜0.05).给予刺激6h时,L组p-p38MAPK及p-JNK1/2的相对灰度值分别为18.89±1.22、2.58±0.50,与C组比较表达均显著增加(P＜0.05);P+L组p-p38MAPK的相对灰度值为3.91±0.30,与L组比较磷酸化水平显著降低(P＜0.05).结论 丙泊酚抑制由LPS刺激THP-1细胞引起的p-p38MAPK、p-ERK1/2及p-JNK1/2表达增加,这可能是其抗炎的重要作用机制之一.     

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白对大鼠肾脏缺血再灌注损伤肾小管上皮细胞的保护作用

目的 探讨中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)对大鼠缺血再灌注损伤肾脏肾小管上皮细胞凋亡的保护作用及机制.方法 建立大鼠肾脏缺血再灌注模型,雄性SD大鼠随机分为对照组、缺血再灌注模型组、NGAL组 ;HE染色观察3组大鼠肾组织病理变化 ;TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡 ;实时定量PCR、Western印迹法检测凋亡蛋白fas、bcl-2的表达变化.结果 与缺血再灌注模型组比较,NGAL组肾小管上皮细胞凋亡数量显著减少[(8.6±3.4)/HP比(20.8±3.7)/HP,P＜0.05] ;NGAL组肾组织fas mRNA(2.34±0.51比6.84±2.34,P＜0.05)、fas蛋白(0.65±0.05比0.95±0.08,P＜0.05)表达显著下调,bcl-2蛋白(0.33±0.05比0.24±0.03,P＜0.05)表达显著上调,但bcl-2 mRNA表达无明显改变.结论 NGAL对大鼠缺血再灌注损伤肾小管上皮细胞有保护作用,其作用可能与减少细胞凋亡、改变凋亡蛋白的表达有关.     

表皮生长因子对人小细胞肺癌细胞Survivin表达的影响及其机制

目的 探讨表皮生长因子(EGF)对人小细胞肺癌NIC-H446细胞中凋亡抑制因子Survivin表达的影响及其调控Survivin的机制.方法 噻唑蓝(MTT)法测定EGF对细胞增殖率的作用.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)方法测定EGF对NIC -H446细胞Survivin表达的影响.Western blot方法测定EGF对NIC-H446细胞p38丝裂原活化激酶(p38MAPK)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)、磷酸化JNK (p-JNK)、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)信号通路蛋白的表达影响.结果 EGF可促进NIC-H446细胞增殖,具有浓度-时间依赖性.与对照组(0.36±0.06、0.57 ±0.15)比较,EGF组Survivin mRNA(0.69±0.12)和蛋白(0.89±0.19)表达明显升高(P＜0.01).与对照组(0.29±0.08)比较,EGF组p-p38MAPK蛋白表达水平(0.68±0.27)明显上升(P＜0.01),其他蛋白表达均无明显变化.EGF+ SB203580组Survivin蛋白表达(0.56±0.17)、p-p38MAPK蛋白表达(0.41±0.11)显著低于EGF组(0.92 ±0.21、0.72 ±0.19,P＜0.01),与对照组比较差异无统计学意义.结论 EGF通过活化p38MAPK信号通路上调小细胞肺癌细胞中Survivin的表达,促进细胞增殖,这可能是小细胞肺癌发展的重要机制.     

p38丝裂原活化蛋白激酶在罗哌卡因致SH-SY5Y细胞凋亡中的作用

目的 评价p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)在罗哌卡因致SH-SY5Y细胞凋亡中的作用,以探讨罗哌卡因诱发神经毒性的机制.方法 采用随机数字表法,将SH-SY5Y细胞随机分为4组(n=18):正常对照组(C组)、10 μmol/L p38MAPK特异性抑制剂SB203580组(SB组)、3 mmol/L罗哌卡因组(R组)、10 μmol/L SB203580+3 mmol/L罗哌卡因组(SB+R组).C组在细胞培养液中继续培养；SB组在含10 μmol/L SB203580培养液中孵育；R组在含3 mmol/L罗哌卡因的培养液中孵育；SB+R组在含10 μmol/L SB203580的培养液中孵育30 min后,用含3mmol/L罗哌卡因的培养液继续孵育.各组细胞培养或罗哌卡因孵育4 h后采用流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平和细胞凋亡率,采用Western blot法检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)的表达,采用MTT法检测细胞活力.结果 与C组比较,R组和SB+R组ROS水平升高,p-p38MAPK表达上调,细胞活力降低,细胞凋亡率升高(P＜0.01),SB组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05)；与R组比较,SB组p-p38MAPK表达下调,细胞活力升高,细胞凋亡率降低(P＜0.01).四组p38MAPK表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 罗哌卡因致SH-SY5Y细胞凋亡作用的机制部分与p38MAPK的激活有关.     

氧化苦参碱对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响及其机制

目的 观察氧化苦参碱(OXY)对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响并探讨其机制.方法 噻唑蓝(MTT)法测定OXY对A549人肺癌细胞活力的作用.流式细胞术测定A549细胞凋亡率.荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和Westem blot方法测定OXY对A549细胞B淋巴细胞/白血病-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax) mRNA和蛋白表达的影响.Western blot方法测定OXY对A549细胞的细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)、p38丝裂原活化激酶(p38MAPK)、磷酸化ERK(p-ERK)、p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表达的影响.结果 OXY可抑制A549细胞增殖.与对照组[(5.63±0.76)％]比较,OXY组细胞凋亡率[(13.26±2.15)％]上升(P＜0.01);与对照组(1.02±0.27、0.23±0.04)比较,OXY组bax mRNA(1.61±0.19)和蛋白(0.71±0.10)表达上升(P＜0.05,P＜0.01);与对照组比较(0.94 ±0.14、0.64±0.09),OXY组bcl-2mRNA(0.42±0.05)和蛋白(0.21±0.04)表达下降(P＜0.01).与对照组(0.29±0.03)比较,OXY组p-JNK表达水平(0.66 ±0.06)明显升高(P＜0.01),其他蛋白表达均无明显变化.与OXY组(0.66±0.07、0.28±0.03、0.65±0.08)比较,同时给予OXY和p-JNK抑制剂SP600125组bax蛋白表达(0.39±0.05)下降,bcl-2表达(0.50±0.08)上升,p-JNK蛋白(0.26 ±0.04)表达下降(P＜0.01).结论 OXY碱可诱导A549细胞凋亡,可能与升高p-JNK水平有关.     

血管内皮生长因子C减轻顺铂所致的肾小管上皮细胞毒性损伤

目的观察血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)在顺铂诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)毒性损伤模型中mRNA的表达变化,探究VEGF-C对顺铂诱导人肾小管上皮细胞毒性损伤的作用和介导其作用的相关分子机制。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞系,用不同浓度的顺铂刺激HK-2细胞24 h后,利用实时荧光定量RT-PCR法检测HK-2细胞VEGF-C mRNA的表达变化,CCK8法检测不同浓度的顺铂对HK-2细胞存活率的影响。分别用0、50、100、200 ng/rr的人重组VEGF-C因子预培养HK-2细胞4 h后,再加入50μmol/L的顺铂和一定浓度的VEGF-C继续培养HK-2细胞24 h,利用CCK8法检测细胞存活率的变化,明确VEGF-C对顺铂诱导的肾小管上皮细胞毒性损伤的作用。用不同浓度的VEGF-C刺激HK-2细胞30 min后,Western blot方法检测细胞p-Akt、Akt、p-Erk、Erk、p-p38及p38蛋白水平的变化。结果不同浓度的顺铂刺激HK-2细胞后细胞VEGF-C mRNA水平的表达呈现先上升后下降的趋势。顺铂能引起HK-2细胞存活率减低,并呈现浓度依赖性。而外源性加入VEGF-C能减轻顺铂所导致的HK-2细胞毒性损伤,提高细胞的存活率,并且VEGF-C浓度为200 ng/ml时对HK-2细胞的保护作用最明显。不同浓度的VEGF-C刺激HK-2细胞30 min,随着VEGF-C浓度的增加,HK-2细胞p-Akt、pErk的表达也逐渐增加,而Akt、Erk、p-p38及p38表达不变。结论 VEGF-C能减轻顺铂诱导的肾小管上皮细胞毒性损伤,提高细胞的存活率,其作用机制可能与激活细胞内PI3K/Akt及MAPK/Erk信号通路有关。     

高糖加重造影剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡

目的探讨高糖对造影剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响及其分子机制。方法将NRK52E细胞分成6组：正常对照组（A组）;造影剂组（B组）;葡萄糖（5mmol／L）＋造影剂组（C组）;葡萄糖（15retool／L）＋造影剂组（D组）;葡萄糖（30mmol／L）＋造影剂组（E组）;8]3203580＋葡萄糖（30mmol／L）＋造影剂组（F组）。F组SB203580（20μmol／L）在造影剂加入30min前加入。结果C组细胞葡萄糖作用6、12、24h及D、E组细胞葡萄糖作用6h,未见造影剂诱导的肾损伤和肾小管上皮细胞凋亡加重。D、E组细胞葡萄糖作用12h,造影剂肾损伤和肾小管上皮细胞凋亡重于B组,葡萄糖作用24h,肾损伤和肾小管上皮细胞凋亡重于葡萄糖作用12h,且E组重于D组（P〈0．05）。高糖显著增加造影剂诱导的肾小管上皮细胞ROS水平及p-p38和caspase3蛋白表达,SB203580抑制1〉p38和caspase3蛋白表达。ROS与p-p38、caspase3及p-p38与caspase3呈显著正相关（r分别为0．70、0．68和0．65,P〈0．05）。结论高糖以时间和剂量依赖方式加重造影剂诱导的肾小管上皮细胞损伤,其分子机制与高糖显著增加细胞内ROS水平及上调p-p38、caspase3表达有关。     

一水草酸钙晶体对肾小管上皮细胞毒性作用的体外研究

目的:研究一水草酸钙(COM)晶体对肾小管上皮细胞的毒性作用。方法:以永生化的肾小管上皮HK-2细胞作为研究对象,用不同浓度的COM处理细胞,再以DAPI染色并细胞计数研究COM对HK-2细胞增殖的作用;检测细胞培养上清中的LDH含量,说明COM对HK-2的毒性;应用MTS法绘制HK-2细胞增殖曲线;使用流式细胞术检测COM对HK-2细胞的凋亡和坏死的作用。结果:DAPI染色后并细胞计数后HK-2细胞增殖能力经0.1mmol/L的COM处理后便受到抑制,并与对照组比较,差异有显著统计学意义,并随COM浓度的升高,抑制作用更加显著。1mmol/L的COM可使HK-2上清中的LDH显著升高,并在5mmol/L更加明显。1mmol/L的COM处理HK-2细胞后,细胞增殖曲线显著低于对照组,5mmol/L的COM在处理HK-2细胞的第6天几乎全部死亡。0.1mmol/L的COM可使HK-2细胞凋亡显著增加,1mmol/L的COM可使HK-2细胞坏死显著增加,并随浓度的升高而增加。结论:0.1mmol/L的COM刺激HK-2细胞即可使细胞出现生长抑制,浓度达到1mmol/L后,则可出现细胞死亡。     

牛磺酸对草酸和草酸钙晶体诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用

目的 探讨牛磺酸在体外细胞培养中对草酸和草酸钙晶体诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用及机制.方法 将体外培养的人远端肾小管上皮细胞(HK-2)随机分为5组:第1组,单纯HK-2细胞;第2组,HK-2细胞中加入草酸和一水草酸钙(COM);第3组,HK-2细胞中加入草酸、COM和牛磺酸;第4组,HK-2细胞中加入草酸、COM和夹竹桃麻素;第5组,HK-2细胞中加入草酸、COM和过氧化氢酶.培养6h后收集各组细胞上清液检测乳酸脱氢酶(LDH)、过氧化氢(H2O2)、8-异前列腺素(8-IP)含量及单核细胞趋化蛋白质-1(MCP-1)蛋白水平,RT-PCR法检测细胞内MCP-1 mRNA、P47 phox mRNA表达水平;MTT法测定培养24 h后的细胞存活率.结果 培养24 h后MTT法检测第1组细胞的吸光度A值为0.996±0.044,第2组为0.626±0.011,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).培养6h后第1组细胞上清液H2O2、8-IP、LDH含量分别为(18.68±0.70) mmol/L、(12.72±1.69) ng/ml、(194.05±7.91) U/L,第2组分别为(53.27±1.88) mmol/L、(57.53±3.11)ng/ml、(484.34±29.44) U/L,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).第1组MCP-1蛋白水平为(17.32±2.32) pg/ml,第2组为(69.21±3.39) pg/ml,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).第1组与第2组细胞的MCP-1 mRNA、P47phox mRNA表达水平倍增比值分别为1/3.51和1/1.38,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).MTT法检测第3、4、5组细胞的吸光度A值分别为0.748±0.033、0.825±0.078、0.815 ±0.037,与第2组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).第3、4、5组细胞上清液H2O2、8-IP、LDH含量均明显少于第2组.第3、4、5组细胞上清液MCP-1蛋白水平分别为(60.13±1.83)、(28.53±1.41)、(56.44±1.13) pg/ml,与第2组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).第3、4、5组细胞MCP-1 mRNA表达水平相对第1组的倍增比值分别为1/2.55、1/1.58、1/2.37,与第2组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).第3、5组细胞P47phox mRNA表达水平相对第1组的倍增比值分别为1/1.25、1/1.35,与第2组比较差异均无统计学意义(P＞0.05);第4组的倍增比值为1/0.61,与第2组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 草酸、COM可诱导HK-2细胞氧化应激损伤,细胞的P47phox mRNA和MCP-1 mRNA表达增加.牛磺酸可以减轻细胞的损伤,但机制可能不是通过抑制P47 phox表达的途径进行.     

高压氧治疗对阿尔茨海默病大鼠海马内神经元凋亡及p38丝裂原蛋白激酶表达的影响

目的 评价高压氧治疗对阿尔茨海默病(alzheimer's disease,AD)大鼠海马内神经元凋亡及p38丝裂原蛋白激酶(p38 mitogenactivated protein kinases,p38MAPK)表达的影响. 方法 18只雄性SD大鼠,体重260 g～290 g,采用随机数字表法分为3组(每组6只):生理盐水组(NS组),海马区注射生理盐水;阿尔茨海默病组(AD组),海马区注射Aβ1-40;高压氧组(HBO组),海马区注射Aβ1-40,并于术后1 d～7d行每天1次的高压氧治疗.应用脑立体定位仪于大鼠海马区注射Aβ1-40制备AD模型.于术前1d和术后1、7、14、21 d行水迷宫行为学测试.于术后21 d水迷宫行为学测试结束后处死大鼠,采用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin,HE)方法染色海马组织病理结构,TUNEL法标记检测凋亡细胞,免疫印迹法(Western bolt)法测定海马内p38MAPK蛋白磷酸化水平. 结果 术后21 d时,与NS组比较,AD组大鼠上台前路程和逃避潜伏期增加[(379±41)、(1 978±120) cm,(16.0±2.8)、(78.4±10.8)s](P＜0.05);与AD组比较,HBO组大鼠上台前路程和逃避潜伏期减少[(1978±120)、(1 246±96) cm,(78.4±10.8)、(51.7±6.2)s](P＜0.05).与NS组比较,AD组和HBO组大鼠海马组织细胞凋亡率[(6.3±13)％,(45.2±5.1)％]及p38MAPK蛋白磷酸化表达升高(0.16±0.06),(0.54±0.10)(P＜0.05);与AD组比较,HBO组海马组织细胞凋亡率[(45.2±5.1)％,(22.5±3.7)％]及p38 MAPK蛋白磷酸化表达下降[(0.54±0.10),(0.31±0.08)](P＜0.05).结论 高压氧治疗可有效缓解AD大鼠认知功能障碍,且能够抑制海马内神经元凋亡,其机制与降低p38MAPK的磷酸化水平有关.     

HO-1对醋酸铅诱导肾小管上皮细胞氧化应激的保护机制

目的:探讨血红素氧合酶-1(HO-1)对醋酸铅(LA)诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护机制,为铅性肾病的治疗提供一定的理论依据。方法:采用醋酸铅孵育人肾小管上皮细胞48 h建立细胞损伤模型,原卟啉氯化钴(Co PP)诱导HO-1表达,自噬抑制剂(3-MA)抑制自噬,CCK-8方法检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡率; Western blot检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62及氧化应激相关蛋白超氧化物歧化酶(SOD2)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)含量。结果:醋酸铅处理48 h后细胞活性、HO-1及自噬水平较Control组均明显下降,在补充Copp激活HO-1后细胞自噬水平上升,细胞活性明显恢复; Copp可明显改善细胞抗氧化酶CAT、SOD2表达,降低MDA,降低细胞凋亡率; 3-MA抑制自噬导致细胞CAT、SOD2表达进一步降低,MDA含量增加,细胞凋亡率升高,并且补充Copp后细胞CAT和MDA水平仅部分改善,SOD2表达未见明显恢复,提示抑制自噬减弱了HO-1的抗氧化作用。结论:HO-1可通过上调自噬减轻醋酸铅诱导的肾小管上皮细胞氧化应激损伤,减少细胞凋亡,HO-1可能可以作为治疗铅性肾病的一个干预靶点。     

蓝萼乙素对三阴性乳腺癌 MDA-MB-231细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的:探讨蓝萼乙素对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其作用机制。方法:体外培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231,加入不同浓度(0、2、4、8μmol/L)蓝萼乙素干预处理,采用MTT法检测细胞增殖能力;划痕实验考察细胞迁移能力;Transwell小室法考察细胞侵袭能力;Western blotting法检测细胞内p38MAPK、p-p38MAPK、FOXO3a及上皮-间质转化(EMT)相关标志物(E-cadherin、Vimentin及N-cadherin)的表达水平。结果:蓝萼乙素浓度为2、4、8μmol/L时,细胞增殖率分别为(83.2±6.90)%、(70.72±6.53)%、(45.43±7.51)%,较空白对照组[(100.00±7.84)%]降低;细胞侵袭数量分别为(300.54±24.91)、(255.44±23.59)、(208.66±36.18),较空白对照组(368.44±28.32)降低;细胞迁移距离分别为(487.11±53.00)μm、(394.93±61.91)μm、(312.88±35.42)μm,较空白对照组[(559.37±75.77)μm]降低;p-p38MAPK表达量分别为(1.38±0.11)、(1.69±0.13)、(2.23±0.19),较空白对照组(1.00±0.09)增加;FOXO3α表达量分别为(1.40±0.16)、(1.97±0.31)、(2.44±0.26),较空白对照组(1.00±0.18)增加;E-cadherin表达量分别为(1.15±0.11)、(1.77±0.22)、(1.86±0.15),较空白对照组(1.00±0.11)增加;Vimentin表达量分别为(0.86±0.04)、(0.49±0.05)、(0.54±0.04),较空白对照组(1.00±0.04)减少;N-cadherin表达量分别为(0.66±0.07)、(0.58±0.08)、(0.42±0.04),较空白对照组(1.00±0.12)减少,差异均有统计学意义(P 0.05)。结论:蓝萼乙素可通过介导p38MAPK/FOXO3a信号传导有效干扰肿瘤细胞EMT进程,发挥其抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用。     

低渗非离子造影剂对肾小管上皮细胞凋亡的作用及其机制

目的 探讨低渗非离子型造影剂碘必乐诱导体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）凋亡的作用及机制。 方法 体外培养的HK-2细胞,分为阴性对照组、不同剂量（1.16、4.63、18.5、74、296 gI/L）的碘必乐作用组（作用时间为6 h）。通过流式细胞仪、Hoechst 33258染色观察细胞凋亡的比例和形态学变化;Western印迹方法检测凋亡蛋白天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）的表达水平,并选取作用最强的剂量（296 gI/L）刺激2、4、6、12 h,观察caspase-3表达变化。选取不同剂量碘必乐作用1 h,与阴性对照组比较,观察细胞外信号调节激酶（ERK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路磷酸化水平的变化,并观察不同剂量p38MAPK抑制剂SB203580对碘必乐诱导的caspase-3和Bcl-2表达的影响。 结果 流式细胞仪检测结果示74、296 gI/L碘必乐作用下细胞凋亡率较阴性对照显著升高（均P < 0.05）。Hoechst 33258染色结果示296 gI/L碘必乐可致明显的细胞凋亡形态学改变,凋亡细胞核呈致密浓染或核碎裂。Western印迹检测方法表明,碘必乐以剂量和时间依赖方式诱导细胞内caspase-3表达,以296 gI/L作用12 h表达最强;各剂量碘必乐作用下细胞内ERK1/2磷酸化水平与阴性对照组的差异均无统计学意义（均P > 0.05）,而一定剂量的碘必乐处理组细胞内p38MAPK磷酸化水平较阴性对照组显著升高（均P < 0.05）。应用p38MAPK特异性抑制剂（30 μmol/L）预处理2 h可以阻断细胞内p38MAPK信号通路的磷酸化,抑制碘必乐诱导的细胞内caspase-3表达并部分上调Bcl-2表达,与碘必乐阳性对照组的差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 低渗非离子型造影剂碘必乐以剂量和时间依赖方式诱导体外培养的HK-2细胞凋亡,其机制可能与上调caspase-3和下调抗凋亡蛋白Bcl-2有关,而p38MAPK信号通路的激活可能参与了该过程的调控。     

炎性痛大鼠背根神经节中p38丝裂原活化蛋白激酶激活调节嘌呤2X3受体对痛觉过敏的影响

目的 研究完全弗氏佐剂(complete freund's adjuvant,CFA)导致的炎性痛大鼠的背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)中,磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(phospho-p38 mitogen-activated protein kinase,p-p38MAPK)与嘌呤2X3(purine 2X3,P2X3)受体的相互关系,及其对于痛觉过敏的影响. 方法 选择雄性SD大鼠72只,体重200 g～250 g.采用随机数字表法分为6组,每组12只:Sham+二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO) (Sham+DMSO)组、CFA+DMSO组、Sham+P2X3抑制剂A-317491 (Sham+A)组、CFA+A-317491(CFA+A)组、Sham+p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)抑制剂SB203580(Sham+SB)组和CFA+SB203580(CFA+SB)组,6组大鼠每组又分为两个亚组,每组6只,即行为学组和Western blot组.行为学组在造模前及造模后1、2、4d检测热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL),观察各组大鼠行为学变化.Western blot组在造模后2d处死,取DRG检测p-p38MAPK及P2X3的表达. 结果 与造模前及Sham+DMSO组比较,CFA+DMSO组、CFA+A组、CFA+SB组大鼠TWL均明显降低[造模后2 dTWL分别为(16.3±1.1)、(5.0±0.7)、(12.6±1.5)、(10.7±1.6)s](P＜0.05),而CFA+A组及CFA+SB组大鼠TWL均较CFA+DMSO组升高(P＜0.05).CFA致炎2d后p-p38MAPK以及P2X3表达均显著增加(P＜0.05);鞘内注射SB203580后,p-p38MAPK与P2X3的表达水平都有明显降低(P＜0.05);鞘内注射A-317491后,P2X3的表达水平显著降低(P＜0.05),而p-p38MAPK表达并未有明显变化(P＞0.05). 结论 炎性痛时p38MAPK的激活可介导P2X3受体的上调.