靶向人PDE5A3基因的shRNA对人阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP的影响

目的:观察腺病毒载体介导特异性短发夹RNA(shRNA)对人阴茎海绵体平滑肌细胞环磷酸鸟苷(cGMP)的影响,为应用RNA干扰(RNAi)技术治疗阴茎勃起功能障碍(ED)提供实验依据。方法:成功构建携带3条针对人PDE5A3基因位点特异性shRNA的重组腺病毒(rAd5-shRNA-PDE5A3),并设立阴性对照病毒组和空白对照组,分别转染人阴茎海绵体平滑肌细胞。以放射免疫法分别检测转染重组腺病毒24、48、72h后细胞内cGMP浓度变化,观察rAd5-shRNA-PDE5A3对海绵体平滑肌细胞内cGMP的影响。结果:实验组rAd5-shRNA-PDE5A3转染人阴茎海绵体平滑肌细胞后胞内cGMP水平显著高于阴性对照组和空白对照组,在转染后72h最为显著。结论:3条特异性针对人PDE5A3mRNA靶位点的shRNA可有效地增加海绵体平滑肌细胞内cGMP的水平,增强对PDE5基因的阻抑效果。     

腺病毒介导的激活大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞中NO／cGMP通路的实验研究

目的：探讨靶向大鼠iNOS基因的shRNA重组腺病毒载体对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞iN0s基因的激活作用,为阴茎勃起功能障碍（ED）的基因治疗提供实验依据。方法：将前期构建的重组腺病毒AdS—iN—OSrshRNA-EGFP（AdU6／shiNOS）和对照病毒AdU6／shControl,分别转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,分别在不同病毒MOI（25,50,75）值下72小时后采样检测。采用realtimeRT-PCR半定量检测AdU6／shiNOS对细胞iNOS基因mRNA表达影响;Western—blot法检测海绵体平滑肌细胞iNOS蛋白表达变化。然后培养基中加L—Arg（10mmol／L）,用酶联免疫法检测病毒转染72小时后海绵体平滑肌细胞内cGMP的浓度变化,记录AdU6／shiNOS对平滑肌细胞内cGMP的影响。结果：AdU6／shiNOS转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞72小时后,和空白对照组、阴性对照组相比iN0s基因在mRNA和蛋白表达水平均显著上调（P〈O．05）,呈剂量依赖性,MOI一75时RNAa效果最好。而且转染72小时后,实验组原代平滑肌细胞内cGMP水平显著高于对照组及空白组（Pd0．05）。结论：利用腺病毒介导的RNAa技术,提高海绵体平滑肌细胞iN0s基因表达获得成功,可以增加阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP水平,激活了NO／cGMP通路,这为勃起功能障碍的基因治疗研究开辟了新的方向。     

PDE5基因siRNA对人阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP的影响

目的:观察PDE5基因小干扰RNA(siRNA)对人阴茎海绵体平滑肌细胞环磷酸鸟苷(cGMP)的影响,为阴茎勃起功能障碍(ED)的基因治疗提供实验依据。方法:使用美国Amb ion公司提供的设计软件设计并合成人PDE5基因的siRNA序列,合成3对PDE5 siRNA和1对阴性对照siRNA,转染人阴茎海绵体平滑肌细胞,同时设定空白转染组为对照组。以酶联免疫法分别检测转染后不同时间(24、48、72、96 h)点海绵体平滑肌细胞内cGMP浓度变化,观察PDE5 siRNA对海绵体平滑肌细胞内cGMP的影响。结果:siRNA1、siRNA2和siRNA3转染后人阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP水平显著高于阴性对照siRNA组和空白对照组(P<0.05),在转染后72 h最为显著,siRNA1、siRNA2、siRNA3、阴性对照siRNA和空白对照组cGMP测定值分别为:5.89±0.19、3.52±0.16、2.88±0.08、0.72±0.12、0.60±0.16 pmol/m l,siRNA1组明显高于siRNA2、siRNA3组(P<0.05)。结论:体外化学合成的PDE5 siRNA能有效地增加海绵体平滑肌细胞内cGMP的水平,不同序列siRNA增加cGMP水平的能力不同,为ED的基因治疗提供了新思路。     

短发夹RNA对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞磷酸二酯酶5型基因表达的抑制作用

目的 观察短发夹RNA(shRNA)对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞磷酸二酯酶5型(PDE5)基因表达的抑制作用,探讨运用RNA干扰(RNAi)技术治疗勃起功能障碍(ED)的可行性.方法 构建靶向大鼠PDE5基因的shRNA重组腺病毒rAd-rPDE5-shRNA,将其转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞48 h后,通过荧光标签进行显微计数确定转染效率,并以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测PDE5基因的表达水平.结果 rAd-rPDE5-shRNA构建成功,转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞效率达95%以上,并使PDE5基因表达在mRNA水平抑制(80.78±2.30)%,在蛋白水平抑制(67.39±3.33)%.结论 以腺病毒为载体表达的shRNA能稳定、有效地抑制大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5基因的表达.     

PDE5基因反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞cNMP的影响

目的 :观察PDE5基因反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞内cAMP和cGMP的影响 ,为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验依据。　方法 :将PDE5基因反义寡脱氧核苷酸 (含第 1外显子部分序列 )与脂质转染试剂DOTAP共同转染人阴茎海绵体平滑肌原代细胞 ,以酶联免疫法分别检测转染后不同时间 (1～ 4 8h)海绵体平滑肌细胞内cAMP和cGMP的浓度变化 ,观察反义寡脱氧核苷酸对平滑肌细胞内cNMP的影响。　结果 :转染后 ,反义实验组平滑肌原代细胞内cGMP水平 (1～ 6h)显著高于对照组 (P <0 .0 1)。　结论 :PDE5基因反义寡脱氧核苷酸可以增加人阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP水平 ,本研究有助于了解PDE5基因与cNMP在阴茎勃起中的作用 ,并为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验基础。     

腺病毒载体介导PDE5-shRNAs对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞游离钙的影响

目的:观察腺病毒载体介导的PDE5-shRNAs对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞游离钙的影响,探讨利用RNAi技术治疗勃起功能障碍(ED)的可行性。方法:利用构建的携带2条靶向PDE5 mRNA靶位点的shRNAs重组腺病毒转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,同时设立阴性对照组和空白对照组,于转染后24、48、72 h用钙离子荧光探针Fluo-3/AM进行染色,然后在激光扫描共聚焦显微镜下动态检测细胞内钙离子荧光强度,以平均荧光指数(FI)反映细胞内游离钙的相对水平。结果:实验组在转染PDE5-shRNAs重组腺病毒24、48、72 h后钙离子荧光指数分别为829.3±7.8、801.5±9.5、856.3±8.7,均明显低于阴性对照组的1106.3±10.8、1121.3±10.2、1058.5±12.1和空白对照组的1076.6±9.7、1133.4±11.2、1104.3±10.5,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:腺病毒介导的靶向PDE5基因的shRNAs能够明显降低大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞内游离钙水平。     

腺病毒载体介导shRNA抑制大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5基因表达的研究

磷酸二酯酶5型(PDE5)作为基因治疗勃起功能障碍(ED)的分子靶点目前已逐渐成为研究热点.我们构建了以大鼠PDE5(rPDE5)为靶基因的重组腺病毒表达载体,将重组腺病毒转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞后,通过细胞内转录产生的短发夹RNA(shRNA)来诱导针对rPDE5基因的RNA干扰(RNAi),并分别从mRNA和蛋白水平检测其对rPDE基因表达的抑制情况.现报告如下.     

反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5的抑制作用

目的　观察反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞 5型磷酸二酯酶 (PDE5 )的抑制作用 ,为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验依据。　方法　将PDE5基因反义寡脱氧核苷酸与DOTAP转染人阴茎海绵体平滑肌原代细胞 ,Western印迹法检测转染后不同时间 (1～ 4 8h)海绵体平滑肌细胞内PDE5的浓度变化 ,观察反义寡脱氧核苷酸对平滑肌细胞内PDE5的作用。　结果　转染后 1～ 6h ,反义组人阴茎海绵体平滑肌原代细胞内PDE5表达量较对照组显著降低 (P=0 .0 0 0～ 0 .0 14 ) ;转染后 12～ 4 8h ,三组细胞内PDE5的表达比较 ,差别无显著性意义 (P =0 .189～0 .96 2 )。　结论　PDE5基因反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5有抑制作用。     

应用RNA干扰技术抑制PDE5A3基因在人阴茎海绵体平滑肌细胞表达

目的应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5A3基因的表达,探讨应用该技术治疗勃起功能障碍(ED)的可行性.方法构建6个靶向人PDE5A3基因的短发夹RNA(shRNA)重组质粒,转染人阴茎海绵体平滑肌细胞48 h后,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测PDE5A3基因的表达抑制效果.结果抑制率最高的1、2、4号重组质粒使PDE5A3基因表达在mRNA水平分别抑制(66.26±4.02)%,(54.90±3.06)%,(23.83±3.61)%;在蛋白质水平分别抑制(64.14±3.32)%,(49.21±2.96)%,(29.85±4.91)%.结论RNAi能明显抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5A3基因的表达,且抑制率具有序列相关性,是潜在的ED基因治疗新方法.     

siRNA对人阴茎海绵体平滑肌细胞5型磷酸二酯酶表达的抑制作用

目的观察小干扰RNA(siRNA)对人阴茎海绵体平滑肌细胞5型磷酸二酯酶(PDE5)表达的抑制作用,为阴茎勃起功能障碍(ED)的基因治疗提供实验依据。方法使用美国Ambion公司提供的设计软件设计人PDE5基因的siRNA序列,并合成3对PDE5siRNA和1对阴性对照siR-NA,转染人阴茎海绵体平滑肌细胞。RT-PCR法半定量检测siRNA对PDE5mRNA表达的抑制作用;Westernblot法检测海绵体平滑肌细胞PDE5蛋白表达水平。结果siRNA1、siRNA2和siRNA3转染后人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5mRNA表达分别下降58.2%、14.9%和11.9%;PDE5蛋白表达量下降约70.5%、19.8%和17.3%;阴性对照siRNA组未引起PDE5mRNA和蛋白表达的变化。结论体外化学合成的PDE5siRNA能特异有效地下调PDE5基因表达,不同序列特异性的siRNA下调PDE5基因表达的能力不同,为ED的基因治疗提供了新思路。     

携带ROCK2基因siRNA有效片段的慢病毒载体的筛选

目的:筛选能够显著抑制自发性高血压大鼠(SHR)阴茎海绵体平滑肌细胞内ROCK2基因表达的携带ROCK2基因siRNA的慢病毒载体。方法:设计并合成4个靶向ROCK2的siRNA片段,构建并包装成慢病毒载体。随机将5只SHR阴茎海绵体平滑肌细胞分为6组,每组每个样本3×104个细胞,每组5个样本,分别为:A组(未转染对照组)、B组(携带慢病毒转染组)、C~F组(分别携带靶向ROCK2基因siRNA 1~4号靶点的慢病毒转染组),以感染复(MOI)=80转染SHR阴茎海绵体平滑肌细胞,转染后48 h荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况,并用RT-PCR检测各组被转染细胞ROCK2 mRNA的表达。结果:荧光显微镜下观察各组细胞转染效率均50%。与A组相比,B组ROCK2 mRNA的表达无明显改变(P﹥0.05);C、D、F组SHR阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK2基因mRNA的表达较A组极显著下降(P0.01),抑制效率分别达到(43.91±8.19)%、(47.15±6.64)%、(25.7±6.03)%;E组SHR阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK2基因mRNA的表达较A组显著下降(P0.05),抑制效率为(16.81±5.94)%。结论:本研究构建的4种携带ROCK2基因的siRNA慢病毒载体均能够显著抑制SHR阴茎海绵体平滑肌细胞内ROCK2基因的表达,其中有1种慢病毒载体抑制作用最强。     

Mechanisms of action of PDE5 inhibition in erectile dysfunction

A spinal reflex and the L-arginine-nitric oxide-guanylyl cyclase-cyclic guanosine monophosphate (cGMP) pathway mediate smooth muscle relaxation that results in penile erection. Nerves and endothelial cells directly release nitric oxide in the penis, where it stimulates guanylyl cyclase to produce cGMP and lowers intracellular calcium levels. This triggers relaxation of arterial and trabecular smooth muscle, leading to arterial dilatation, venous constriction, and erection. Phosphodiesterase 5 (PDE5) is the predominant phosphodiesterase in the corpus cavernosum. The catalytic site of PDE5 normally degrades cGMP, and PDE5 inhibitors such as sildenafil potentiate endogenous increases in cGMP by inhibiting its breakdown at the catalytic site. Phosphorylation of PDE5 increases its enzymatic activity as well as the affinity of its allosteric (noncatalytic/GAF domains) sites for cGMP. Binding of cGMP to the allosteric site further stimulates enzymatic activity. Thus phosphorylation of PDE5 and binding of cGMP to the noncatalytic sites mediate negative feedback regulation of the cGMP pathway.     

他达拉非治疗ED的概述

勃起功能障碍(ED)是男科常见病、多发病,PDE5抑制剂能竞争性抑制PDE5而抑制cGMP的水解,提高阴茎海绵体平滑肌细胞内cGMP浓度,达到治疗ED的效果。他达拉非可使阴茎海绵体内cGMP水平提高,从而导致勃起。他达拉非可有效改善各种病因和各种程度ED患者的勃起功能;其具有以下特点:有效时间长,安全性高,易于被患者及性伴侣接受,增强性自信、性自尊,性体验更加自然。使患者从生理、心理上最大程度的得到治疗,有效提高性生活质量。因此他达拉非在ED患者的治疗中值得推广。     

Nitric oxide-cyclic GMP pathway with some emphasis on cavernosal contractility

Nitric oxide (NO) is formed from the conversion of L-arginine by nitric oxide synthase (NOS), which exists in three isoforms: neuronal (nNOS), endothelial (eNOS), and inducible (iNOS). nNOS is expressed in penile neurons innervating the corpus cavernosum, and eNOS protein expression has been identified primarily in both cavernosal smooth muscle and endothelium. NO is released from nerve endings and endothelial cells and stimulates the activity of soluble guanylate cyclase (sGC), leading to an increase in cyclic guanosine-3',5'-monophosphate (cGMP) and, finally, to calcium depletion from the cytosolic space and cavernous smooth muscle relaxation. The effects of cGMP are mediated by cGMP dependent protein kinases, cGMP-gated ion channels, and cGMP-regulated phosphodiesterases (PDE). Thus, cGMP effect depends on the expression of a cell-specific cGMP-receptor protein in a given cell type. Numerous systemic vasculature diseases that cause erectile dysfunction (ED) are highly associated with endothelial dysfunction, which has been shown to contribute to decreased erectile function in men and a number of animal models of penile erection. Based on the increasing knowledge of intracellular signal propagation in cavernous smooth muscle tone regulation, selective PDE inhibitors have recently been introduced in the treatment of ED. Phosphodiesterase 5 (PDE5) inactivates cGMP, which terminates NO-cGMP-mediated smooth muscle relaxation. Inhibition of PDE5 is expected to enhance penile erection by preventing cGMP degradation. Development of pharmacologic agents with this effect has closely paralleled the emerging science.     

阴蒂海绵体中磷酸二酯酶5表达及淫羊藿甙对cGMP浓度的影响

目的　探讨阴蒂海绵体中磷酸二酯酶 5表达及淫羊藿甙对cGMP浓度的影响。　方法　通过反转录聚合酶链反应技术 (RT PCR)检测兔阴蒂海绵体中PDE5mRNA的表达 ;12 5I放射免疫法测定不同浓度淫羊藿甙对阴蒂海绵体内PDE5酶底物cGMP浓度的影响 ,西地那非作为阳性对照 ,分别计算EC50 。　结果　阴蒂海绵体组织中有PDE5的表达 ,淫羊藿甙可明显提高阴蒂海绵体内的cGMP浓度 ,具有显著的浓度依赖性。　结论　淫羊藿甙对阴蒂海绵体平滑肌细胞内cGMP水平的影响可能是通过PDE5发挥作用 ,与NO cGMP信号通路有关。