猪卵母细胞体外成熟与体外受精的超微结构研究

取猪卵巢，从２～６ｍｍ有腔卵泡中抽取未成熟的卵丘卵母细胞复合体。分组处理后，各取１０枚按常规方法制片，光镜和电镜下观察测量。结果表明，对照组的卵丘细胞呈多层包围卵母细胞，其胞质突起与卵母细胞微绒毛交叉伸入透明带中，卵周隙尚未出现。高尔基复合体在卵皮质区成团分布。皮质颗粒位置分散。线粒体多成群存在于卵皮质区，嵴少，基质密度高。脂滴遍布胞质，由间断的滑面内质网包统。培养成熟后，卵丘细胞扩展松散，其突起和卵母细胞微绒毛，均自透明带中缩回，卵周隙出现。皮质颗粒成排贴于质膜下。高尔基复合体未见或仅残留少量囊泡。线粒体中出现空泡。脂滴内絮状物增多。卵母细胞生发泡破裂，第一极体分出，核处于第２次成熟分裂中期。受精后皮质颗粒内容物外倾或颗粒完整外排，线粒体多呈圆形。雌、雄原核形成，致密核仁出现。结果说明，体外受精与体内受精过程基本相同，仅有某些环节不完整或不规则。     

小鼠卵母细胞体外成熟的形态变化

生发泡期小鼠卵母细胞与卵细胞间以及卵丘细胞之间存在细胞连接，卵丘细胞的突起伸入卵母细胞内，细胞突起存在类似于鞭毛的９＋２结构，这使卵母细胞和卵丘细胞成为结构和功能上的整体。生发泡破裂后卵细胞出现吞噬现象，其意义不清。排出极体处的细胞膜微绒毛消失，其下方是中期纺锤体，此区域可能为第二极体的释放部位。     

体外培养的人卵母细胞的超微结构

目的探讨体外培养的人卵母细胞的超微结构。方法用光镜观察体外培养前生发泡期（GV期）、培养后生发泡破裂但仍处于MⅠ期的未成熟卵母细胞和达到MⅡ期的成熟卵母细胞的形态，并将成熟卵母细胞分为优质与非优质；用透射电镜观察卵母细胞的超微结构。结果GV期卵母细胞微绒毛短小稀少；核偏一侧，核仁致密。培养后卵母细胞微绒毛粗大增多，细胞器丰富，高尔基体周围有许多分泌小泡；线粒体和脂滴伴行；卵丘细胞的胞质突起与卵母细胞的微绒毛问形成缝隙连接，卵丘细胞之间形成较多桥粒。成熟的卵母细胞粗面内质网、高尔基体减少，滑面内质网发达，线粒体幼稚化，脂滴融合，皮质颗粒沿质膜下呈线性排列，细胞连接减少，第一极体含多种细胞器。非优质卵母细胞线粒体大量存在膜和嵴模糊、膨大的现象，有的极体碎裂，透明带形态不正常，其周围卵丘细胞的凋亡率较高。结论揭示了体外培养的不同时期、不同质量的人卵母细胞的超微结构。     

卵丘细胞凋亡对体外培养卵母细胞发育潜能的影响

目的 研究体外培养中卵丘细胞凋亡对卵母细胞结构的影响,探讨体外受精中可用卵丘细胞凋亡率预测卵母细胞发育潜能的原因.方法 对GV期人卵丘-卵母细胞复合体进行体外成熟培养,用HE染色、DAPI染色和原位末端标记(TUNEL)法标记3种方法对单卵卵丘细胞凋亡率进行检测.分为凋亡率高和低的2组,用光镜和透射电镜观察卵母细胞的结构.对MⅡ期卵母细胞进行体外受精,培养2d后在光镜下评价胚胎质量.结果 卵丘细胞凋亡率低的卵母细胞结构和发育潜能良好;卵丘细胞凋亡率高的卵母细胞发育潜能差,存在各种结构异常,包括围卵周隙不均,对应不同部位的细胞质发育不同步;细胞质中出现堆积不均的细胞器团、次级溶酶体、及可能由溶酶体降解造成的大量空隙;线粒体外膜和嵴模糊、膨大,呈现凋亡迹象;第一极体碎裂;透明带异常增厚或变薄.相应的卵丘细胞微绒毛和细胞连接减少.结论 揭示了卵丘细胞凋亡对卵母细胞结构的影响,揭示了卵丘细胞凋亡率影响卵母细胞发育潜能的原因.     

卵丘细胞在卵母细胞成熟和受精中的作用

卵泡是人类生殖的基本功能单位，卵丘细胞在卵母细胞发育、成熟和受精过程中有极其重要的作用，主要表现在参与卵母细胞减数分裂的调节、支持卵母细胞细胞质的成熟、促进精卵的结合，并且其形态和扩展程度影响卵母细胞成熟与质量。本文对卵丘细胞在卵母细胞成熟和受精中的作用进行系统的阐述，有助于进一步揭示卵母细胞成熟的机制。     

肥胖引起的线粒体功能及抗氧化异常促进小鼠卵母细胞排卵后老化

目的: 探讨肥胖对小鼠卵母细胞体内老化、体外受精和胚胎发育的影响及其机制。方法: 分别获取人绒毛膜促性腺激素(HCG)注射后14 h、18 h和22 h的卵母细胞-卵丘颗粒细胞复合体,进行体外受精胚胎培养,采用Hoechst 33342和碘化丙啶双染检测卵丘颗粒细胞的凋亡率,JC-1和DCFH-DA分别检测卵母细胞中线粒体膜电位(MMP)和活性氧类(ROS)水平,并检测卵母细胞中ATP和谷胱甘肽(GSH)水平。结果: 刚排卵时肥胖小鼠卵母细胞GSH低于对照组(P<0.05),囊胚形成率、ATP、ROS和卵丘颗粒细胞凋亡率两组无显著差别(P>0.05);HCG注射后18 h,肥胖小鼠卵母细胞中ATP含量及囊胚细胞数目开始明显减少并低于对照组(P<0.05),而卵母细胞中ROS水平和卵丘颗粒细胞凋亡率则开始升高并高于对照组(P<0.05);HCG注射后22 h,肥胖小鼠卵母细胞MMP和体外受精囊胚形成率显著下降(P<0.05),并且低于对照组(P<0.05)。结论: 肥胖促进排卵后卵母细胞的老化,氧自由基对卵母细胞的损伤可能是引起母源老化不孕的重要原因。     

山羊卵母细胞发育的超微结构研究

本研究用光镜和电镜观察山羊卵巢内发育不同时期卵母细胞的核及胞质成分,并发现其某些变化规律。作者认为,随着卵母细胞发育,高尔基体、线粒体、滑面内质网、皮质颗粒等细胞器不断丰富和增多,并逐渐移向皮质区。在直径1.5～3mm卵泡卵母细胞中,线粒体全都变为带帽状;核仁内出现的纤维中心最多,但尚未发生致密化。到直径3.5～5mm卵泡,颗粒细胞突起开始退化,卵母细胞微绒毛自透明带中退缩,此期卵母细胞可用于体外培养成熟。当卵母细胞成熟时,高尔基体和粗面内质网消失,皮质颗粒整齐排列在质膜下,线粒体分散在胞质中央,为受精作好了准备。     

受精失败的卵母细胞超微结构的改变

目的 研究受精失败卵母细胞的超微结构,探讨其受精失败的原因。方法 将收集的体外受精（IVF）或单精子胞质内注射(ICSI)受精失败的及正常的卵母细胞进行固定、脱水、包埋、超薄切片和染色,透射电子显微镜下观察其超微结构。结果IVF组透明带厚度（14.7±2.4）μm明显高于正常组（10.1±2.1）μm (P<0.05)。IVF组皮质颗粒广泛分布于皮质区,部分呈线状排列于质膜下;ICSI组和对照组皮质颗粒线状排列于质膜下。IVF组异常线粒体所占比例为41.2%,明显高于其余两组 (P<0.05)。IVF组可见成熟及未成熟的高尔基复合体,还可见正在形成皮质颗粒的高尔基复合体。结论 受精失败的卵母细胞胞质中细胞器异常分布与出现,导致胞质不成熟,卵母细胞的透明带增厚、变硬导致精子穿透障碍,从而致使受精失败。     

细胞内微电极技术在体外受精研究中的应用

应用细胞内微电极技术，分析测试了猪卵母细胞周围卵丘细胞数量与膜电位的关系、体外成熟能力与膜电位的关系和体外受精发育能力与膜电位的关系。结果表明，应用细胞内微电极技术测定的膜电位能力有效地反映不同数量卵丘细胞包围的卵母细胞的代谢水平、体外成熟卵母细胞的成熟能力和体外受精发育能力。     

Peroxiredoxin Ⅱ mRNA在小鼠卵泡发育中定位的研究

目的观察PeroxiredoxinⅡmRNA在小鼠卵巢各级卵泡和MII卵中的分布，为了解PeroxiredoxinⅡ在卵母细胞发育及成熟过程中的功能意义提供形态学依据。方法原位杂交方法。结果在小鼠卵巢内，原始卵泡的初级卵母细胞未检到PeroxiredoxinⅡmRNA的杂交信号，初级卵泡的初级卵母细胞可检到杂交信号，次级卵泡和近成熟卵泡中卵母细胞的信号明显增强。离开卵巢的GV卵也能检到较强的杂交信号，排到输卵管的次级卵母细胞(MII卵)杂交信号与GV卵相比明显减弱。从原始卵泡到近成熟卵泡周围的卵泡细胞均可检到杂交信号，其信号强度在卵泡发育成熟过程中未见有明显变化。卵母细胞和卵泡细胞的PeroxiredoxinⅡmRNA杂交信号均分布在胞质。结论提示PeroxiredoxinⅡ可能参与了卵母细胞生长发育和卵母细胞成熟过程的调节。     

衰老大鼠禁水时视上核加压素能神经元超微结构变化

电镜观察不同禁水时间衰老大鼠下丘脑视上核加压素能神经元的超微结构变化。结果发现：禁水６、１２ｈ后，视上核加压素能神经元胞体增大，胞质中粗面内质网排列紧密且增多，高尔基复合体成熟面未成熟分泌颗粒及神经分泌颗粒增多；轴突中神经分泌颗粒增多不明显。而禁水２４ｈ后，神经元胞质内的神经分泌颗粒减少，轴突中的神经分泌颗粒聚集成膨大区域。禁水后，神经胶质细胞减少，突起回缩，使相邻的两神经元直接接触，突触结构重建增多。上述研究结果提示，衰老大鼠下丘脑视上核加压素能神经元在禁水时，其功能活动是增强的，胶质细胞突起回缩，有利于神经元之间的突触结构重建。     

溶酶体4次穿膜蛋白β在小鼠卵母细胞及早期胚卵中的表达

目的 观察溶酶体4次穿膜蛋白β(LAPTM4β)在小鼠卵母细胞及早期胚卵中的表达,分析新基因LAPTM4β在植入前胚卵发育中的作用,为研究植入前胚卵发育的基因调控提供实验依据.方法 从50只小鼠的子宫或输卵管中收集小鼠卵母细胞及从原核期到胚泡的早期胚卵共50枚.采用激光扫描共焦显微镜技术与免疫组织化学ABC法,观察小鼠卵母细胞及早期胚卵中LAPTM4β的表达;表达结果用Maticam2206图像分析系统进行半定量分析.结果激光扫描共焦显微镜下显示,小鼠卵母细胞和原核期胚卵细胞质的绿色荧光呈不均匀分布,近细胞膜处荧光信号强;2细胞期、4细胞期、8细胞期和桑椹胚卵裂球胞质中绿色荧光均呈局灶性分布,且靠近细胞膜处胞质中绿色荧光均较强,2细胞期中所见极体内也有绿色荧光信号;小鼠胚泡滋养层细胞及内细胞团中均可见中等强度的绿色荧光.免疫组织化学显示,在小鼠卵母细胞中可见LAPTM4β阳性反应颗粒呈浅棕色;原核期、2细胞期、4细胞期、8细胞期胚及桑椹胚,可见深棕色颗粒,且在卵裂球胞质中呈不均匀分布;胚泡的内细胞团及滋养层细胞中均可见棕色阳性反应颗粒.图像分析结果显示,卵母细胞与原核期胚相比,8细胞期与桑椹胚相比,桑椹胚与胚泡相比,LAPTM4β的表达量有显著差异(P<0.05).结论 LAPTM4β在正常小鼠卵母细胞及植入前各期胚卵中均有表达,且具有规律性;不同阶段早期胚卵中LAPTM4β的表达量均高于卵母细胞,推测IAPTM4β与小鼠早期胚卵的细胞分裂、增殖、分化及胚胎发育相关.     

脑源性神经营养因子及其受体在人卵巢的表达与卵泡发育的关系

目的：研究脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体——酪氨酸蛋白激酶受体B(TrkB)在人卵巢中的表达。初步探讨其与卵泡发育的关系。方法：取排卵前期人卵巢组织和来自体外受精．胚胎移植(IVF-ET)周期的取卵日卵泡液、人卵巢黄素化壁层颗粒细胞(hMGLCs)、人卵巢黄素化卵丘颗粒细胞(hCGLCs)、未受精卵母细胞或未成熟卵母细胞。用免疫组织化学SABC法研究BDNF在人卵巢组织中不同发育阶段卵泡的表达，酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测BDNF在人卵泡液，hMGLCs和hCGLCs无血清培养上清液中的表达。用免疫组织化学SABC法研究TrkB在人卵巢组织不同发育阶段卵泡的表达，免疫细胞化学SABC法研究TrkB在hMGLCs，hCGLCs和未受精或未成熟卵母细胞的表达，Western blotting方法检测TrkB在hMGLCs和hCGLCs的表达及其差异。结果：人卵泡液中存在BDNF，BDNF表达于初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞及窦状卵泡的卵丘颗粒细胞。TrkB表达于初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞、窦状细胞的卵丘颗粒细胞、壁层颗粒细胞及卵母细胞，壁层颗粒细胞表达量高于卵丘颗粒细胞。结论：在人卵巢BDNF及其受体TrkB可能(通过旁分泌和自分泌的方式)参与颗粒细胞功能的完成和卵母细胞发育的调控。     

卵丘细胞STAG3基因表达的年龄相关改变及与胚胎发育的关系

目的分析卵丘细胞STAG3表达与年龄、卵母细胞受精率、卵裂率的关系，探讨卵丘细胞粘连素表达的年龄相关变化及与胚胎发育的关系，探讨卵丘细胞粘连素检测作为无创、可定量的方法用于早期胚胎筛选的可行性，进一步阐明卵母细胞非整倍体发生的机制。方法应用荧光定量RT—PCR技术检测40个IVF—ET周期卵丘细胞粘连素STAG3mR—NA表达水平，分析其与母体年龄以及受精率、卵裂率、优胚形成率的关系。结果根据母体年龄分为三组：≤30岁；〉30，且≤38岁；〉38岁，三组卵丘细胞STAG3mRNA相对含量分别为：0．70±0．55；1．90±1．08；0．49±0．28，P〈0．001。STAG3表达与受精率负相关（r=-0．465，P=0．002），与卵裂率、优胚率无显著相关。结论年长妇女卵丘粘连素STAG3表达下降，并与受精率负相关。卵丘细胞STAG3检测作为无创、可以定量的方法可能用于早期胚胎筛选。     

Peroxiredoxin II mRNA在小鼠卵泡发育中定位的研究

目的　观察PeroxiredoxinIImRNA在小鼠卵巢各级卵泡和MII卵中的分布 ,为了解PeroxiredoxinII在卵母细胞发育及成熟过程中的功能意义提供形态学依据。　方法　原位杂交方法。　结果　在小鼠卵巢内 ,原始卵泡的初级卵母细胞未检到PeroxiredoxinIImRNA的杂交信号 ,初级卵泡的初级卵母细胞可检到杂交信号 ,次级卵泡和近成熟卵泡中卵母细胞的信号明显增强。离开卵巢的GV卵也能检到较强的杂交信号 ,排到输卵管的次级卵母细胞 (MII卵 )杂交信号与GV卵相比明显减弱。从原始卵泡到近成熟卵泡周围的卵泡细胞均可检到杂交信号 ,其信号强度在卵泡发育成熟过程中未见有明显变化。卵母细胞和卵泡细胞的PeroxiredoxinIImRNA杂交信号均分布在胞质。　结论　提示PeroxiredoxinII可能参与了卵母细胞生长发育和卵母细胞成熟过程的调节。     

IP3R在LH-EGFR诱导小鼠卵母细胞第一次减数分裂恢复中的作用

目的:探究1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R)在促黄体素-表皮生长因子受体(LH-EGFR)信号诱导卵母细胞第一次减数分裂恢复中的作用及机制。方法:构建小鼠卵丘-卵母细胞复合物(COCs)体外培养模型以及卵泡培养模型,研究IP3R特异性抑制剂2-氨乙基二苯基硼酸脂(2-APB)及heparin对LH/EGF诱导减数分裂恢复以及EGF诱导卵丘扩展的影响,利用real-time PCR技术检测卵丘扩展因子的表达,钙离子荧光探针Fluo 3-AM检测胞内钙离子水平变化,酶联免疫法检测胞内cGMP水平变化。结果:IP3R抑制剂2-APB和heparin能够有效抑制EGF诱导的减数分裂恢复(P<0.05),同时显著降低了COCs内cGMP的含量(P<0.05);2-APB和Heparin还能够抑制EGF诱导的卵丘扩展,同时显著降低卵丘扩展因子的mRNA表达水平(P<0.05);激活IP3R可升高细胞内钙离子水平,而2-APB及heparin能够有效降低EGF升高的卵丘细胞内钙离子水平(P<0.05);利用卵泡培养模型进一步的研究表明,2-APB及heparin同样显著抑制了LH诱导的卵母细胞减数分裂恢复(P<0.05)。结论:LH-EGFR信号通路通过IP3R升高卵丘细胞内钙离子水平,诱导卵母细胞第一次减数分裂的恢复。     

PeroxiredoxinⅡ小鼠卵巢中卵泡、GV卵、MII卵和植入前胚的表达和定位

目的观察PeroxiredoxinⅡ在小鼠卵巢中卵泡和植入前胚的表达与定位，为探讨PeroxiredoxinⅡ在小鼠卵母细胞发育成熟和早期胚发育的作用提供依据。方法根据小鼠PeroxiredoxinⅡmRNA序列(Accession No：BC002034)设计引物，对小鼠生发泡完整卵细胞(GV卵)中的PeroxiredoxinⅡ可能编码区进行扩增。同时，取生后3d和2月小鼠的卵巢，免疫细胞化学染色显示PeroxiredoxinⅡ蛋白在卵泡中的分布。此外，运用RT-PCR和免疫细胞化学染色方法观察PeroxiredoxinⅡ在植入前胚的表达。结果从GV卵中扩增所得684bp的cDNA序列，与小鼠PeroxiredoxinⅡ具有99％同源性；其推导的编码氨基酸序列与小鼠PeroxlredoxinⅡ氨基酸序列完全相同。免疫细胞化学染色显示：生后3d小鼠卵巢内未见PeroxiredoxinⅡ阳性反应；2月小鼠卵巢内阳性反应见于初级卵泡、次级卵泡和近成熟卵泡中卵母细胞的胞质。卵泡细胞未见PeroxiredoxinⅡ阳性反应。RT-PCR结果表明：PeroxiredoxinⅡmRNA在GV卵中处高水平，从MII卵开始略有下降，在4-细胞胚和早期囊胚期间未检到。免疫细胞化学染色显示：GV卵、MII卵、1-细胞胚、2-细胞胚、4-细胞胚、8-细胞胚、桑椹胚和早期囊胚均呈PeroxiredoxinⅡ阳性反应。结论PeroxiredoxinⅡmRNA和蛋白在小鼠植入前胚的表达存在时程差别，PeroxiredoxinⅡ蛋白是母源性蛋白，它可能参与小鼠卵巢中卵母细胞和早期胚发育过程的调节。     

小鼠类巨噬细胞系超微结构的观察

本文报道了小鼠类巨噬细胞系(MMC-1)的超微结构。在透射电镜下,可见暗细胞、亮细胞及空细胞。这三种细胞有一定的比例。在其他培养细胞中也见到了类似的三种细胞。暗细胞电子致密度最高,呈圆形、椭圆形或梭形。表面有许多突起,有的呈丘状。胞质可分内、外两部分。外胞质无细胞器;内胞质中有丰富的线粒体、粗面内质网和聚核蛋白体。溶酶体易见,高尔基复合器发达,有成堆的微纤维。胞核不规则,多呈肾形,位于细胞的一侧。核膜清楚,常染色质较多。有的胞核中可见核仁。亮细胞突起少,线粒体肿胀,溶酶体与脂滴易见,核肿胀。空细胞的突起更少,内质网明显减少或消失,溶酶体多,次级溶酶体易见胞核大,染色质稀疏。本文根据此细胞的超微结构特点,证实其为巨噬细胞,并根据其来源称之为类巨噬细胞。     

PeroxiredoxinII在小鼠卵巢中卵泡、GV卵、MII卵和植入前胚的表达和定位

目的　观察PeroxiredoxinII在小鼠卵巢中卵泡和植入前胚的表达与定位 ,为探讨PeroxiredoxinII在小鼠卵母细胞发育成熟和早期胚发育的作用提供依据。　方法　根据小鼠PeroxiredoxinIImRNA序列 (AccessionNo :BC0 0 2 0 34)设计引物 ,对小鼠生发泡完整卵细胞 (GV卵 )中的PeroxiredoxinII可能编码区进行扩增。同时 ,取生后 3d和 2月小鼠的卵巢 ,免疫细胞化学染色显示PeroxiredoxinII蛋白在卵泡中的分布。此外 ,运用RT PCR和免疫细胞化学染色方法观察PeroxiredoxinII在植入前胚的表达。　结果　从GV卵中扩增所得 6 84bp的cDNA序列 ,与小鼠PeroxiredoxinII具有 99%同源性 ;其推导的编码氨基酸序列与小鼠PeroxiredoxinII氨基酸序列完全相同。免疫细胞化学染色显示 :生后 3d小鼠卵巢内未见PeroxiredoxinII阳性反应 ;2月小鼠卵巢内阳性反应见于初级卵泡、次级卵泡和近成熟卵泡中卵母细胞的胞质。卵泡细胞未见PeroxiredoxinII阳性反应。RT PCR结果表明 :PeroxiredoxinIImRNA在GV卵中处高水平 ,从MII卵开始略有下降 ,在 4 细胞胚和早期囊胚期间未检到。免疫细胞化学染色显示 :GV卵、MII卵、1 细胞胚、2 细胞胚、4 细胞胚、8 细胞胚、桑椹胚和早期囊胚均呈PeroxiredoxinII阳性反应。　结论　PeroxiredoxinIImRN     

人卵丘颗粒细胞和壁层颗粒细胞体外培养方法比较

目的:建立有效分离、提纯及培养人卵丘颗粒细胞的方法,并与人壁层颗粒细胞的体外培养相比较。方法:收集卵胞浆内单精子显微注射取卵时的卵泡液和直接机械分离卵母细胞所得的卵丘颗粒细胞复合物,直接将卵丘颗粒细胞复合物接种于培养皿中培养。用密度梯度离心法分离卵泡液中的人壁层颗粒细胞。用免疫荧光法检测卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)的表达;用CCK-8法检测细胞生长曲线;用ELISA检测这2种颗粒细胞分泌雌激素的能力。结果:直接法所得人卵丘颗粒细胞培养24 h后可贴壁,体外培养生长状态与人壁层颗粒细胞相似;免疫荧光检测显示两者均表达FSHR;CCK-8实验结果表明,两者体外培养生长曲线相似;ELISA结果显示两者分泌雌激素能力相当。结论:利用机械切割获得人卵子周围卵丘颗粒细胞复合物直接培养的方法操作简单,获得的人卵丘颗粒细胞具有与人壁层颗粒细胞相似的生长状态、生长曲线以及雌激素分泌能力,可作为人颗粒细胞亚群体外培养方法的补充。