ISSR-PCR对我国旋毛虫7个地理株的分子鉴定

目的探讨对不同种和地理株旋毛虫进行分子鉴定。方法利用简单重复序列区间-PCR(inter simple sequencerepeat-PCR,ISSR-PCR)标准引物对5种旋毛虫及我国旋毛虫7个地理株基因组DNA进行扩增,并观察影响扩增效果的因素。结果5种旋毛虫均分别扩增出了各自的特异性条带:旋毛虫(T1)2条(950bp和850bp),乡土旋毛虫(T2)1条(850bp),布氏旋毛虫(T3)3条(1 300bp、950bp和700bp),伪旋毛虫(T4)1条(600bp),纳氏旋毛虫(T7)有4条带(1 700bp、1 450bp、1 050bp、900bp)。我国有6个猪源旋毛虫地理株均扩增出了与T1相同的2个特异性条带(950bp、850bp)。此外,T1、河南株、云南株、哈尔滨株、黑龙江同江株还扩增出了另外2条弱带(500bp和400bp);但湖北株和天津株则无这2条弱带,湖北株扩增出了1 350bp的条带,天津株扩增出了1 600bp的条带。非猪源的广西株与T1相比,缺少950bp的条带。对1条旋毛虫肌幼虫,在80%酒精保存24w的肌幼虫,在10%甲醛、0.2%叠氮钠及0.05%柳硫汞溶液保存9 w的肌幼虫,应用ISSR-PCR均可扩增出其特异性条带。结论ISSR-PCR用于旋毛虫种的分子鉴定具有良好的稳定性和敏感性;我国6个猪源旋毛虫地理株均为T1,其中云南株、河南株、哈尔滨株及黑龙江同江株可归为一类,湖北株和天津株可归为另一类,来自果子狸的广西株分类地位待定。     

应用COXⅠ基因PCR-RFLP对我国旋毛虫地理株的鉴定

目的对我国旋毛虫不同地理株进行分子鉴定。方法根据旋毛虫线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ（cytochromec-oxidase subunitⅠ,COXⅠ）基因序列合成1对引物,以旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）、乡土旋毛虫（T.nativa,T2）、布氏旋毛虫（T.britovi,T3）、伪旋毛虫（T.pseudospiralis,T4）、纳氏旋毛虫（T.nelsoni,T7）的国际参考株作为对照,应用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-restrictionfragment length polymorphism,PCR-RFLP）技术对我国7个猪源旋毛虫地理株（河南、湖北、云南、西安、哈尔滨、同江及天津株）进行分子鉴定。结果T1、T2、T3、T4、T7和我国7个猪源旋毛虫地理株的COXⅠ基因均扩增出419 bp的片段,PCR扩增产物Tru1Ⅰ（MseⅠ）酶切后经RFLP分析,T2、T3、T4、T7和天津株均具有独特的酶切带型：T2为22、70和327 bp,T3为92和327 bp,T4为419 bp,T7为62、64、70和223 bp,天津株为92、126和201 bp;其他6个地理株的酶切带型和T1一致,为22、70、126和201 bp。结论我国7个旋毛虫地理株的COXⅠ基因片段（92、70和22 bp）存在种内多态性;河南、湖北、云南、西安、哈尔滨及同江株可归为一类,天津株可归为另一类。     

广西两地旋毛虫分离株5S rDNA序列分析

目的 应用5S rDNA序列分析，鉴定广西德保、南丹两地旋毛虫分离株。 方法 PCR扩增2个分离株5S rDNA片段，并对扩增产物进行测序；用相关软件分析序列的同源性、遗传距离，同时构建系统发生树，并与GenBank中旋毛虫相应基因序列进行比较。 结果 广西德保、南丹2地旋毛虫分离株和GenBank中Trichinella spiralis的5S rDNA碱基序列长度相同，为695 bp；变异位点4个，与T. spiralis的相似度分别为99.0%和99.1%，与GenBank中其他相应基因的相似度低于94.2%，2个分离株之间的相似度为98.8%。2个分离株之间及与T. spiralis间的遗传距离最小，均为0.014；而与其他旋毛虫的遗传距离均大于0.056；用邻接法（N-J法）和最大简约法（MP法）构建的2个系统发生树中，2个分离株与T.spiralis位于同一分支，自引导值分别为96及99。 结论 初步鉴定广西德保和南丹旋毛虫分离株均为T.spiralis。     

多重PCR技术检测恶性疟原虫抗药性相关分子标志的方法研究

目的 建立恶性疟原虫5个主要抗药性相关基因的单管多重PCR扩增方法，用于恶性疟原虫抗药性分子标志检测。 方法 依据各基因参考序列，运用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件，设计5对特异性引物，采用Hot Start Taq DNA聚合酶，设置递增延伸温度，对恶性疟原虫标准株（3D7、Dd2和HB3）、分离株（FCC1/HN、 CMH/YN）、现场标本（来源于海南、 云南和缅甸）、 近缘虫种对照（间日疟原虫、 伯氏疟原虫、 食蟹猴疟原虫、 杜氏利什曼原虫和牛源隐孢子虫）和空白对照（以H2O为模板）进行5个抗药性相关基因（包括恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因Pfcrt、多药抗性基因Pfmdr1、二氢喋酸合成酶基因Pfdhps、二氢叶酸还原酶基因Pfdhfr和三磷酸腺苷酶第6亚基基因PfATPase6）的单管多重PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果，测定扩增产物序列，并与参考序列（3D7株）比对。 结果 经电泳，恶性疟原虫标准株、分离株和现场标本的多重PCR扩增产物均可见5条目标条带。测序结果与参考序列比对，高度同源，最低同源性为98.5%。模板DNA量达0.1 ng即满足扩增要求，近缘虫种对照和空白对照未见扩增产物。 结论 多重PCR技术实现了单管1次反应完成5个抗药性相关基因的扩增，该方法灵敏，特异性好，有助于提高恶性疟原虫抗药性分子标志的检测效率。     

我国旋毛虫地理株的同工酶分析

目的 为旋毛虫属的分类提供依据.方法 应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对我国6个猪源旋毛虫地理株(河南、云南、哈尔滨、黑龙江同江、湖北及天津)肌幼虫的超氧化物歧化酶(SOD)、苹果酸酶(ME)、酯酶(EST)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)进行分析,并以旋毛虫(17tichinella spiralis,T1)、乡土旋毛虫(T. nativa,T2)、布氏旋毛虫(T. britovi,T3)、伪旋毛虫(T. pseudlospiralis,T4)及纳氏旋毛虫(T. nelsoi,T7)的国际参考株作为对照.结果 我国6个猪源旋毛虫地理株的4种同工酶(SOD、ME、EST、GLDH)酶谱均与T1的相同.结论 经4种同T酶分析我国6个猪源旋毛虫地理株均为T1.     

旋毛虫Ts21重组蛋白的免疫诊断价值及免疫保护作用的研究

目的 探讨旋毛虫Ts21重组蛋白的免疫诊断价值及免疫保护作用。 方法 应用旋毛虫Ts21重组蛋白ELISA（Ts21-LISA）与肌幼虫ES抗原ELISA（ES-LISA）对旋毛虫病与其他寄生虫病患者血清及5种旋毛虫（T1、T2、T3、T4和T7）感染小鼠血清进行检测,并观察不同剂量旋毛虫感染小鼠后不同时间的血清抗体水平。将Ts21重组蛋白皮下注射免疫小鼠（20 μg/只,免疫3次,每次间隔10 d）,末次免疫后10 d,每只小鼠用300条旋毛虫肌幼虫经口攻击感染,3.5 d和42 d 后剖杀,观察肠道成虫与肌幼虫数并计算减虫率。 结果 Ts21-LISA检测旋毛虫病、并殖吸虫病、囊尾蚴病及棘球蚴病患者血清的抗体阳性率分别为94.7%（18/19）、15.8%（3/19）、9.1%（1/11）和7.7%（1/13）,与血吸虫病、华支睾吸虫病患者血清及健康人血清无交叉反应;Ts21重组蛋白与ES抗原ELISA检测旋毛虫病患者血清抗体的敏感性与特异性差异均无统计学意义（χ²=0,P＞0.05;χ²=0.358,P＞0.05）。Ts21重组蛋白与ES抗原检测T1感染小鼠血清的敏感性差异无统计学意义（χ²=0.104,P＞0.05）,与T2、T3、T4、T7感染小鼠血清的交叉反应率明显低于ES抗原（χ²=17.069,P＜0.05）。小鼠感染300条旋毛虫后4 周,应用Ts21-LISA检测的血清抗体阳性率为100%（10/10）;小鼠感染5条旋毛虫后6周,血清抗体阳性率为100%（10/10）。Ts21重组蛋白免疫小鼠用旋毛虫攻击感染后3.5 d和42 d,肠道成虫与肌幼虫减虫率分别为42.71%和49.8%。 结论 Ts21重组蛋白可用于旋毛虫病的血清学检测,但不能忽视与并殖吸虫病、囊尾蚴病及棘球蚴病患者血清的交叉反应。     

以重组蛋白为抗原的ELISA法检测旋毛虫抗体

目的 寻求特异性强、敏感性高的旋毛虫病诊断抗原。 方法 以旋毛虫新生幼虫期特异性T668基因在E.coli高效表达的重组蛋白为抗原，分别以兔、猪和健康者血清及旋毛虫病阳性血清为一抗，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG、山羊抗猪IgG和山羊抗人IgG为二抗，建立检测旋毛虫抗体的间接ELISA方法，并以旋毛虫肌幼虫排泄?鄄分泌（ES）抗原作为检测对照。 结果 以T668重组蛋白为抗原，对兔、猪和人旋毛虫病血清进行检测，阳性检出率为100 ％，且敏感性高（0.016 μg / 孔），与ES抗原检测结果完全一致。 结论 T668重组抗原有望替代ES抗原检测旋毛虫抗体。     

哈氏并殖吸虫ITS2基因和CO1基因序列分析

目的 进一步确认浙江宁海哈氏并殖吸虫（Paragonimus harinasutai）分类地位及其遗传变异。 方法 从浙江华溪蟹中分离获得哈氏并殖吸虫囊蚴，单个囊蚴经PCR扩增，进行核糖体DNA第二间区（ITS2）基因和线粒体细胞色素C氧化酶亚单位（CO1）基因序列分析；ITS2-PCR扩增产物经BsaHI、StuI酶切。 结果 ITS2-PCR扩增产物经BsaHI和StuI酶切（PCR-RFLP），琼脂糖凝胶电泳分离图谱基本一致。浙江宁海哈氏并殖吸虫ITS2基因有366碱基对，与泰国种群（AF159609）核酸同源性为95.6％，CO1基因有390碱基对，与泰国种群（AF159600）核酸同源性为89.5％。 结论 本研究从分子生物学角度进一步确认浙江宁海哈氏并殖吸虫分类地位，但与泰国种群（Nakorn-nayok省）相比较，存在较大变异。     

马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、序列分析及编码产物B细胞表位预测

根据GenBank中马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(BmG3PD基因)序列设计引物, 以马来丝虫mRNA为模板, RT-PCR扩增BmG3PD基因, 将其克隆入pGEM-T载体, 转化大肠埃希菌（E. coli）DH5α, 筛选阳性克隆。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及PCR鉴定, 获得阳性重组质粒pGEM-BmG3PD, 经序列分析及同源性比较, 以及对其编码产物进行B细胞表位预测, 结果表明PCR扩增的特异性条带为1 020 bp, 与预期相符, 与GenBank已知基因序列同源性为99%。编码产物B细胞表位预测, 氨基酸区域可能在22～36、242～255、303～318和326～336位。     

肝片吸虫组织蛋白酶L基因的克隆、表达和免疫原性分析

目的 克隆和表达肝片吸虫组织蛋白酶 L 基因（FhCL）,分析其免疫原性。 方法 根据GenBank公布的FhCL基因序列设计引物,以肝片吸虫总RNA为模板,通过RT-PCR扩增FhCL基因编码序列,PCR产物经TA克隆,通过EcoRⅠ、HindⅢ双酶切和测序鉴定获得重组质粒pMD18-T/FhCL,并将其亚克隆入原核表达载体pET30a（+）,经PCR,以及BamHⅠ、HindⅢ双酶切和测序鉴定,构建原核表达质粒pET30a（+）-FhCL,转化大肠埃希菌(E. coli)BL21（DE3）pLysS,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并获得纯化的重组蛋白FhCL,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定,以及蛋白质印迹（Western blotting）分析该重组蛋白对感染肝片吸虫的山羊血清及免疫的SD大鼠血清的免疫反应性。结果 PCR和BamHⅠ、HindⅢ双酶切均可见约1 000 bp的条带,测序结果显示重组质粒pET30a（+）-FhCL构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白相对分子质量约为 Mr 42 000（含6个组氨酸标签）,与目的蛋白相符,以包涵体形式表达。Western blotting分析结果显示,纯化的重组蛋白FhCL可被感染肝片吸虫的山羊血清和免疫的SD大鼠血清识别,在目的条带Mr 42 000处见单一特异性条带,而阴性对照血清则无反应带。 结论 克隆及表达了肝片吸虫组织蛋白酶 L 编码基因,重组蛋白具有良好的免疫原性。     

用多重PCR技术检测小管福寿螺体内广州管圆线虫幼虫

目的建立一种多重PCR方法检测小管福寿螺体内的广州管圆线虫幼虫。方法根据广州管圆线虫核糖体小亚基rDNA基因序列(GenBank登录号为AY295804)设计特异性引物,并与小管福寿螺16srDNA的特异性引物组合,建立多重PCR检测方法。分别以阳性和阴性小管福寿螺DNA为模板进行多重PCR扩增,电泳鉴定并测序。用阴性小管福寿螺DNA倍比稀释200条广州管圆线虫Ⅲ期幼虫DNA模板,使之浓度分别为1200ng/μl、120ng/μl、12ng/μl、1200pg/μl、120pg/μl和12pg/μl,检测该方法的敏感性。野外采集小管福寿螺172只,肺检法检测后,进行多重PCR扩增,计算敏感性和特异性。结果电泳和测序结果证实该多重PCR检测方法能有效扩增出目的片段,小管福寿螺和广州管圆线虫的目的片段分别为550和405bp。该方法可检测出广州管圆线虫Ⅲ期幼虫DNA的最小浓度为120pg/μl。肺检法和多重PCR法检测均为阳性结果的45只,两法均为阴性的100只。肺检法为阴性、多重PCR法为阳性的24只,肺检法为阳性而多重PCR法检测为阴性的3只。多重PCR的敏感性和特异性分别为93.8%(45/48)和80.6%(100/124)。多重PCR法的阳性检出率为40.1%(69/172),肺检法阳性检出率为27.9%(48/172),差异具有统计学意义(χ2=14.8,P0.01)。结论建立了检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的多重PCR方法。     

结膜吸吮线虫实验室感染大绕眼果蝇

在安徽黄山地区捕捉有绕眼习性的果蝇,将结膜吸吮线虫初产蚴混于果汁中,实验室喂饲感染果蝇,常温饲养20 d后,检查果蝇的感染情况。结果显示,大绕眼果蝇（Amiota magna）和冈田绕眼果蝇（A. okadai）的阳性率分别为30%（30/100）和21.6%（55/255）,两者间的差异无统计学意义（χ²=0.058 4, P>0.05）。将采自大绕眼果蝇的结膜吸吮线虫感染期幼虫接种家兔,35 d后在兔结膜囊内检获结膜吸吮线虫成虫及其初产蚴,表明在实验室条件下,结膜吸吮线虫可感染大绕眼果蝇。     

免疫血清对旋毛虫感染性幼虫侵入肠上皮细胞及其发育的影响

目的观察旋毛虫感染性幼虫排泄分泌(ES)抗原与旋毛虫感染性幼虫表面抗原免疫鼠血清对幼虫侵入HCT-8肠上皮细胞及其发育的影响。方法将旋毛虫感染性幼虫接种至半固体培养基(RPMI1640培养基+1.75%琼脂糖)+HCT-8细胞中,37℃5%CO2培养12、24、36、72和96h后镜下观察幼虫发育情况;将幼虫接种至含免疫血清的半固体培养基+HCT-8细胞中,培养15min后镜下观察幼虫形态及其对肠上皮细胞的侵入情况,36h后应用间接荧光抗体试验(IFAT)观察幼虫蜕皮,并计数Ⅰ期和Ⅱ～Ⅳ期幼虫。结果幼虫在半固体培养基培养12h可侵入HCT-8细胞单层,36～72h幼虫可蜕皮1～2次,培养96h可见早期成虫。在含ES抗原免疫血清与感染鼠血清条件下培养15min,幼虫头端可见免疫复合物形成的帽样结构,但在含表面抗原免疫血清、正常鼠血清或不含免疫血清条件下培养的幼虫头端则无帽样结构,头端带有帽样结构的幼虫不能侵入HCT-8细胞单层。在含ES抗原与表面抗原免疫血清条件下发育至Ⅱ～Ⅳ期幼虫的百分比(2.25%、2.2%)均明显低于含正常鼠血清条件下培养的幼虫(24.7%)(P0.05)。结论旋毛虫ES抗原免疫血清可阻止幼虫对肠上皮细胞的侵入,ES抗原及表面抗原免疫血清均可阻止部分幼虫的发育(蜕皮)。     

应用mtDNA-COⅠ基因序列研究我国大劣按蚊A、D群体的遗传差异

目的 应用线粒体DNA细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ（mtDNA-COⅠ）基因序列特征阐明我国大劣按蚊A、D群体的遗传差异和分化水平。 方法 研究样本包括大劣按蚊A海南群体（n=13）,大劣按蚊D云南江城群体（n=17）和勐腊群体（n=17）,所有样本均以rDNA-ITS2序列差异为依据,进行分子鉴别确认;扩增和测定mtDNA-COⅠ基因片段,用MEGA（Version2.1）、TCS（Version1.12）、ARLEQUIN（Version2.0）等软件对基因序列进行生物信息学分析。 结果 分析mtDNA-COⅠ基因中长度为959 bp的片段,显示大劣按蚊A的单倍型共3个,大劣按蚊D的单倍型共6个,均匀分布于3个群体。勐腊群体内错配平均数（7.441 2）明显大于江城群体（1.279 4）和海南群体（1.051 3）,表明勐腊群体内个体间分化程度最大。分步AMOVA的计算结果显示群体间基因交流有限（Fst＝0.799 9）,群体间变异（79.99%）明显大于群体内变异（20.01%）。 结论 我国大劣按蚊A、D群体之间的遗传差异较小,个体间的分化水平较高。     

Study of the 49 kDa excretory-secretory protein gene of <Emphasis Type="Italic">Trichinella nativa</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">Trichinella spiralis</Emphasis>

Summary To study the function of the 49 kDa excretory-secretory (ES) protein gene (P49) of Trichinella, the genes was amplified by RT-PCR from RNA of Trichinella spiralis and Trichinella nativa and several Chinese Trichinella isolates of domestic animals, and sequenced after being cloned. The amplified products of these parasites produced bands of about 950 bp. The 97.2 % to 100 % nucleotides identity and 94.3 % to 100 % identity of deduced amino acids among P49 gene of these Trichinella strains showed the close relationship of these parasites. The P49 gene of T. nativa was cloned into the BamHI site of the prokaryotic expression vector pET-30a, and the recombinant vector was expressed. The expressed product was 40.8 kDa in size. In Western blot analysis, the expressed product was reactive to sera of mice infected with T. nativa, T. spiralis and their Chinese geographical strains.     

妊娠对小鼠旋毛虫感染免疫应答的影响

目的 研究妊娠对小鼠旋毛虫感染免疫应答的影响。 方法 6只孕鼠分别经口感染300条旋毛虫肌幼虫,ELISA检测感染后不同时间血清抗体水平。感染后6周剖杀,消化全身肌肉计算每克肌肉虫荷（lpg）。测定孕鼠感染后1～4周血清介导的抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）对成囊前期幼虫（PEL）的杀伤作用。观察孕鼠感染旋毛虫后第6、8和12天的肠道虫荷及雌虫体外生殖力指数。对6只处女鼠肌肉注射孕酮,观察其感染旋毛虫后6周的血清抗体水平与肌肉虫荷。 结果 孕鼠感染旋毛虫后2周的血清抗体水平（A492=0.113）显著高于未孕鼠（A492=0.078）（F=21.390,P＜0.05）。孕鼠感染后6周的每克肌肉虫荷（1 251±450）明显低于未孕鼠（2 310±1 123）（t=2.419,P＜0.05）。孕鼠感染后2周血清介导的ADCC导致成囊前期幼虫的死亡率（42.6%）显著高于未孕鼠（26.9%）（F=1.195,P＜0.05）。孕鼠感染后第6、8和12天的肠道虫荷与未孕鼠相比差异均无统计学意义（Z6=-1.185,Z8=-0.149,Z12=-0.0289,P＞0.05）,感染后第6和8天孕鼠与未孕鼠的雌虫生殖力指数间的差异亦无统计学意义（Z6=-0.149,Z8=-1.043,P＞0.05）。孕酮注射处女鼠感染旋毛虫后6周的血清抗体水平（A492=0.299）显著高于对照组（A492=0.191）（t=2.955,P＜0.05）,但其每克肌肉虫荷（1 457±551）与对照组（1 235±439）相比差异无统计学意义（t=0.726,P＞0.05）。 结论 妊娠在小鼠抗旋毛虫感染的免疫应答中具有协同作用,其机制可能与孕鼠感染旋毛虫后早期血清抗体水平升高及其介导的ADCC对成囊前期幼虫的杀伤作用增强等有关。     

日本血吸虫线粒体nad4基因部分序列的多态性研究

采用PCR技术及DNA序列分析技术对采自湖南省4个不同地区的日本血吸虫的线粒体NADH脱氢酶基因亚基Ⅳ（nad4）部分片段（pnad4）进行克隆及序列分析,获得480 bp的pnad4序列。与GenBank上的日本血吸虫相应基因序列进行比对,发现pnad4序列有一定的种内差异（0.4％～1.3％）。     

亚洲带绦虫烯醇化酶基因的原核表达、鉴定与组织定位

目的 表达亚洲带绦虫（Taenia asiatica,Ta）成虫烯醇化酶（enolase,ENO）基因,并对其进行组织定位和免疫反应性分析。 方法 通过大规模测序从亚洲带绦虫cDNA文库中确定ENO基因,PCR扩增目的片段,将其克隆至表达质粒pET-30a（+）,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）观察重组蛋白的表达情况,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱纯化重组蛋白,蛋白质印迹（Western blotting）分析该重组蛋白的免疫反应性。将重组蛋白免疫SD大鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体水平,间接免疫荧光检测确定ENO在亚洲带绦虫成虫组织中的定位。 结果 PCR、双酶切和DNA测序结果均表明,重组质粒pET-30a（+）-TaENO构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白TaENO的相对分子质量（Mr）为47 000。经亲和层析获高纯度的蛋白,蛋白浓度为0.37 mg/ml。重组蛋白TaENO能被SD大鼠抗血清、感染亚洲带绦虫的猪血清和患者血清识别。间接免疫荧光检测结果显示,TaENO主要定位于成虫的表膜。 结论 纯化后的亚洲带绦虫成虫烯醇化酶重组蛋白具有较强的免疫反应性,烯醇化酶主要定位于成虫表膜。