应用人骨髓间质干细胞与脱细胞猪主动脉瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜

目的:应用动物来源的细胞构建组织工程化心脏瓣膜的研究较多,本实验特征在于观察人骨髓间质干细胞与脱细胞猪主动脉瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜,并探讨其作为种子细胞的可行性。方法:实验于2005-12/2006-10在解放军第二军医大学长海医院全军胸心外科研究所完成,研究方案获伦理委员会批准。①实验材料:取开胸术中切除的肋骨骨髓,术前已经患者知情同意。新鲜猪心脏瓣膜取自上海复新屠宰场。②实验方法:Ficoll密度梯度离心从肋骨骨髓中获取骨髓单个核细胞,体外扩增培养后鉴定。采用去污剂和酶消化法将猪主动脉瓣叶行脱细胞处理,种植人骨髓间质干细胞。③实验评估:采用EnVision二步法染色鉴定人骨髓间质干细胞形态及细胞表型;采用苏木精-伊红染色、维多利亚蓝染色和VanGieson氏染色法观察细胞在脱细胞猪主动脉瓣叶支架上的生长特点;扫描电镜观察静态构建组织工程心脏瓣膜的形态。结果:①人骨髓间质干细胞形态及细胞表型鉴定:人骨髓间质干细胞为梭形,抗平滑肌抗体和波形蛋白染色阳性,CD31及Ⅷ因子染色阴性。②脱细胞猪主动脉瓣膜支架的组织学观察:猪去细胞瓣膜支架去细胞完全,弹力纤维及胶原纤维保持完整,种植的人骨髓间质干细胞在脱细胞瓣叶表面形成完整的细胞层。③构建组织工程心脏瓣膜的形态学观察:扫描电镜示瓣膜表面细胞层完整,细胞呈梭形复层生长。结论:人骨髓间质干细胞体外具有自然分化为肌成纤维细胞的特性,在去细胞猪主动脉瓣膜上生长良好,可作为一种有前途的种子细胞构建组织工程心脏瓣膜。     

骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞构建组织工程瓣膜及其抗血栓作用

目的：分析骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞构建组织工程瓣膜的可行性，评价其抗血栓功能。方法：实验于2005-08／2006—04在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成。①人骨髓来源为中山医院胸外科手术摘除的一段肋骨（患者知情同意）；取健康志愿者静脉血进行血小板黏附观察；新鲜猪心瓣膜取自上海复新屠宰场。②利用胰酶-乙二胺四乙酸、核酸酶处理猪心瓣膜制备脱细胞支架。将摘除的一段肋骨无菌条件下用含肝素的磷酸盐缓冲液充分冲洗骨髓腔，进行骨髓间充质干细胞的分离培养及体外诱导分化。⑧经体外诱导成的内皮细胞后，种植于瓣膜支架，构建组织工程瓣膜。体外培养1周后，取组织工程瓣膜及未种细胞的空支架做血小板黏附试验。以CD31、vWF对细胞进行鉴定，采用苏木精-伊红染色、免疫荧光及扫描电镜对组织工程瓣膜进行评价。结果：①骨髓间充质干细胞定向诱导为内皮细胞及其性质鉴定：骨髓间充质干细胞定向诱导为内皮细胞后，CD31及vWF染色由阴性转为阳性，呈现出“铺路石”样形态。瞧糯膜组织形态观察结果：猪心瓣膜的细胞成分完全去除，胞外基质保存良好，组织工程瓣膜表面形成一连续的内皮细胞单层。⑧血小板黏附情况：扫描电镜显示空支架表面有大量血小板聚集和黏附，而组织工程瓣膜表面无此现象，显示了良好的抗血栓性能。结论：骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞叮以用来构建具有良好的抗血栓性能组织工程瓣膜。     

骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞构建组织工程瓣膜及其抗血栓作用

目的:分析骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞构建组织工程瓣膜的可行性,评价其抗血栓功能。方法:实验于2005-08/2006-04在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成。①人骨髓来源为中山医院胸外科手术摘除的一段肋骨(患者知情同意);取健康志愿者静脉血进行血小板黏附观察;新鲜猪心瓣膜取自上海复新屠宰场。②利用胰酶-乙二胺四乙酸、核酸酶处理猪心瓣膜制备脱细胞支架。将摘除的一段肋骨无菌条件下用含肝素的磷酸盐缓冲液充分冲洗骨髓腔,进行骨髓间充质干细胞的分离培养及体外诱导分化。③经体外诱导成的内皮细胞后,种植于瓣膜支架,构建组织工程瓣膜。体外培养1周后,取组织工程瓣膜及未种细胞的空支架做血小板黏附试验。以CD31、vWF对细胞进行鉴定,采用苏木精-伊红染色、免疫荧光及扫描电镜对组织工程瓣膜进行评价。结果:①骨髓间充质干细胞定向诱导为内皮细胞及其性质鉴定:骨髓间充质干细胞定向诱导为内皮细胞后,CD31及vWF染色由阴性转为阳性,呈现出“铺路石”样形态。②瓣膜组织形态观察结果:猪心瓣膜的细胞成分完全去除,胞外基质保存良好,组织工程瓣膜表面形成一连续的内皮细胞单层。③血小板黏附情况:扫描电镜显示空支架表面有大量血小板聚集和黏附,而组织工程瓣膜表面无此现象,显示了良好的抗血栓性能。结论:骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞可以用来构建具有良好的抗血栓性能组织工程瓣膜。     

心脏瓣膜组织工程中理想种植细胞的来源比较

背景:现有的人工瓣膜,无论是机械瓣膜还是物瓣膜,都存在与取材有关、无法从工艺制作方式改进解决的固有缺陷.组织工程心脏瓣膜概念的提出为解决该难题提供了新的方向.目的:通过比较成熟分化血管内皮细胞和骨髓间充质干细胞骨的获取手段、体外增殖能力以及在脱细胞基质上的生长情况,分析何者更适合作为制备组织工程人工心脏瓣膜的种植细胞.设计、时间及地点:单一样本观察,于2008 06/09在上海市胸科医院动物实验基地完成.材事斗:用胰蛋白酶(胰酶)EDTA、Triton X-100、DNase、RNase消化猪主动脉瓣膜获得脱细胞基质.从1只12 kg 2岁雄性杂交犬大隐静脉、股外侧动脉及肋骨骨髓获取种植细胞.方法:用胰酶消化并收集内皮细胞,收集骨髓细胞,分别进行培养.通过贴壁法获得内皮细胞及骨髓间充质干细胞.利用内皮细胞生长因子诱导骨髓间尤质干细胞向内皮细胞分化,并绘制细胞生长曲线.以抗Ⅷ因子抗体以及抗血管内皮生长因子抗体荧光染色,荧光显微镜观察.将细胞种植于脱细胞瓣膜上培养3 d后进行扫捕电镜观察.主要观察指标:①试验犬伤口愈合情况.②细胞培养、增殖情况.③骨髓来源骨髓间充质干细胞表型分析以及形态学观察.结果:成熟血管内皮细胞体外增殖能力低下,骨髓间充质干细胞则增殖旺盛,生长曲线显示骨髓间充质干细胞的倍增时间约30 h,而成熟内皮细胞生长曲线平直.对骨髓间充质干细胞进行抗Ⅷ因子抗体以及抗VEGF抗体荧光染色.可见荧光染色阳性.扫描电镜见种植骨髓间充质干细胞的脱细胞瓣膜上散在星状细胞贴附.结论:骨髓间充质下细胞体外增殖能力强,在内皮细胞生长因子诱导下可向内皮细胞转化,并可以生长贴附于脱细胞瓣膜,是作为组织上程人工心脏瓣膜制备的理想细胞来源.     

利用人骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的体外实验

背景：目前临床应用的人工瓣膜,无论机械瓣还是生物瓣都存在着诸如易感染、出血和血栓形成并发症,因瓣口狭窄需再手术等自身难以克服的缺陷。理论上具有生物活性的组织工程心脏瓣膜可克服上述缺点,但种子细胞和瓣膜支架的选取尚存在争议。目的：探讨应用人骨髓基质干细胞及脱细胞猪主动脉瓣支架体外构建组织工程瓣膜的可行性。方法：采用去垢剂一核酸酶消化法处理,去除猪主动脉瓣叶细胞成分,获取施行简单先心病修补患者胸骨来源的骨髓基质干细胞,将其种植于脱细胞猪主动脉瓣支架共培养5d。结果与结论：流式细胞技术证实接种的种子细胞的表面抗原符合人骨髓基质干细胞的特征;光镜及电镜检查证实,猪主动脉瓣膜中的细胞成分可完全去除,获得完整无细胞的纤维网状支架;瓣叶去细胞前后的生物力学性能无明显变化;种植的人骨髓基质干细胞可在脱细胞猪主动脉瓣支架表面形成一层连续的细胞层;接种的人骨髓基质干细胞有向成纤维细胞分化的趋势。以上结果提示种植人骨髓基质干细胞于脱细胞猪主动脉瓣支架上,可构建出组织工程心脏瓣膜。     

骨髓间充质干细胞联合可降解支架体外构建组织工程带瓣静脉

背景：临床上治疗慢性静脉功能不全的主要方法是静脉瓣膜修复及带瓣静脉段移植,但这些方法创伤较大,且带瓣静脉来源有限。组织工程学和再生医学在修复病变血管方面取得的进步,而以自体来源的内皮细胞为种子细胞的组织工程带瓣静脉也见于了报道,但存在排出反应。 目的：构建一个有可自我更新、修复、类似天然瓣膜结构并具有功能的带瓣静脉。 方法：麻醉取Beagle犬的骨髓获取骨髓间充质干细胞,采用密度梯度离心和贴壁法获取骨髓间充质干细胞,并进行细胞的传代、冻存复苏、流式细胞仪检测和定向诱导分化。采用热致相分离技术,以聚（乳酸-乙醇酸）共聚物为基材,利用自制带瓣静脉模具制备三维组织工程带瓣静脉支架,制备组织工程带瓣静脉支架,并研究其形态结构。将骨髓间充质干细胞种植在支架上构建可降解的带瓣静脉,在体外培养2周。 结果与结论：扫描电镜观察显示支架孔隙率高。培养的细胞符合骨髓间充质干细胞的形态特征,培养的细胞大部分表达CD29和CD44,不表达CD34和CD45。细胞毒性实验显示支架无毒性,有利于细胞增殖和迁移。将细胞种植在支架表面上培养后可形成单层细胞层。体外实验验证细胞支架复合物的瓣膜有一定的开闭功能。利用三维聚（乳酸-乙醇酸）共聚物支架和骨髓间充质干细胞可成功构建组织工程带瓣静脉,组织工程带瓣静脉将有可能作为静脉瓣膜的的替代物治疗静脉瓣膜疾病。     

骨髓间充质干细胞定向分化为心脏瓣膜构成细胞及鉴定

背景:心脏瓣膜的组成成分中不是只有内皮细胞发挥作用,成纤维细胞、平滑肌细胞等均参与心脏瓣膜基质成分构建.目的:建立可以在体外获得大量内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞的简便方法,并对获得细胞进行形态观察及表面标志鉴定.方法:全髓贴壁法获取大鼠原代骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增,第3代细胞在特定条件下分别向内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞方向诱导分化,每日于倒置显微镜下观察细胞生长情况,并对诱导分化的细胞行免疫细胞化学检测.结果与结论:骨髓间充质干细胞在特定条件下诱导培养后,诱导后的细胞分别具有内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的特点.提示骨髓间充质干细胞在体外可以定向分化为内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞.     

人脐带Wharton胶中间充质干细胞体外无支架组织工程软骨的构建

背景:构建组织工程软骨的方法多为自体种子细胞复合天然或合成物支架,目前多存在种子细胞来源有限、支架安全性和生物相容性、以及细胞在支架中分布不均的问题.目的:探讨人脐带Wharton胶中间充质干细胞向软骨诱导分化并体外构建无支架组织工程软骨的可行性.方法:分离培养人脐带Wharton胶中的间充质干细胞,进行流式细胞学鉴定.对软骨诱导前后的细胞进行组织学和免疫组织化学染色,对其表达的葡萄糖胺聚糖和Ⅱ型胶原进行定量研究,并应用RT-PCR检测软骨诱导前后Ⅱ型胶原和Sox-9mRNA的表达.采用密集诱导培养→离心管培养→生物反应器培养,进行体外构建无支架软骨组织.结果与结论:人脐带Wharton胶富含干细胞,流式细胞仪检测结果显示这些细胞不表达造血干细胞标志,表达CD44,CD105、CD271等间充质干细胞表面标志;HLA-ABC阳性表达,HLA-DPDQDR阴性表达.未进行软骨诱导的细胞弱表达软骨细胞标志,诱导后葡萄糖胺聚糖和Ⅱ型胶原显著增高.RT-PCR结果显示人脐带Wharton胶间充质干细胞诱导前后均表达Sox-9、Ⅱ型胶原mRNA.说明人脐带Wharton胶间充质干细胞具有前软骨细胞的特性.采用密集诱导培养结合生物反应器培养,不用支架,体外可以构建成大块组织工一[程软骨.表明人脐带Wharton胶间充质干细胞是一种良好的构建组织工程软骨的种子细胞.     

兔骨髓间充质干细胞向尿路上皮分化后构建膀胱组织工程化移植物

背景：尿路上皮细胞是泌尿系组织工程领域重要的种子细胞,但是难以体外大量扩增;有研究表明骨髓间充质干细胞可以向尿路上皮细胞分化,但关于分化后细胞在植入动物体内后上皮生成情况,以及分化后细胞在组织工程领域的具体应用研究尚不多。目的：分离、扩增兔骨髓间充质干细胞,诱导骨髓间充质干细胞向尿路上皮细胞分化并与兔膀胱脱细胞基质构建组织工程化移植物,了解分化后细胞作为种子细胞的效果。方法：12只8周龄雄性新西兰大白兔胫骨穿刺,抽取骨髓,密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,第4或5代细胞以条件培养基培养2周,进行分化后细胞的鉴定。随后将分化后细胞种植在膀胱脱细胞基质上构建组织工程化移植物,进行膀胱修补;另12只动物作为对照组以尿路上皮细胞与膀胱脱细胞基质构建复合物行膀胱修补。结果与结论：骨髓间充质干细胞培养成功并在体外扩增,由条件培养基培养诱导分化后,PCR检测提示分化后细胞干细胞标志物CD44表达降低,而上皮细胞标志物UP1a表达升高,行免疫荧光检测发现分化后细胞能表达尿路上皮特异性标志物UP1a,而骨髓间充质干细胞无表达。分化后细胞构建的组织工程化移植物在膀胱修补2周后可形成稳定连续的上皮覆盖,上皮层厚度与尿路上皮细胞构建的组织工程化移植物类似。提示骨髓间充质干细胞向尿路上皮诱导分化后可作为泌尿系组织工程的种子细胞,可能是尿路上皮细胞之外的又一新选择。     

脂肪间充质干细胞的基本生物学特性及其向成骨细胞分化的特征

背景最早研究的是骨髓来源的间充质干细胞.由于脂肪组织与骨髓同为中胚层起源的组织,那么能否从脂肪组织中获得间充质干细胞,而且也具有多分化潜能呢?目的研究脂肪间充质干细胞的基本生物学特性以及在特定培养条件下向成骨细胞分化,探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性.设计以细胞为研究对象的随机对照实验.单位北京大学第三医院骨科.对象实验于2002-10/2004-01在北京大学第三医院骨科完成,实验对象为从Lewis大鼠脂肪组织中提取的间充质干细胞.方法取3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫,消化法获得脂肪间充质干细胞,分别用脂肪诱导培养基和成骨诱导培养基诱导其向脂肪细胞与成骨细胞分化,组织化学染色、免疫细胞化学染色和Western blotting检测细胞分化的情况.主要观察指标脂肪间充质干细胞的形态学和生物学特性,以及成骨诱导后成骨细胞特异性标志.结果从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代.原代脂肪间充质干细胞能自发分化为脂肪细胞,传代细胞在胰岛素和地塞米松的作用下生成脂滴,过氧化物酶体增殖物激活受体?表达增强,向脂肪细胞分化;在地塞米松、抗坏血酸、?-甘油磷酸钠的诱导下,碱性磷酸酶活性检测显示诱导组与对照组差异有显著性意义(P＜0.01),yon Kossa染色出现钙结节,骨桥蛋白免疫细胞化学染色阳性,Western blotting检测到诱导后细胞骨桥蛋白的表达.结论从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞,经诱导后可分化为脂肪细胞和成骨细胞,有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一.     

组织工程心脏瓣膜种子细胞：来源及应用

背景：应用机械瓣和生物瓣行瓣膜置换是治疗终末期瓣膜病的有效手段,然而他们的临床应用受到多个因素的限制。具备生物活性的组织工程心脏瓣膜有潜力克服机械瓣和生物瓣的不足,选择适宜的种子细胞是组织工程心脏瓣膜研究的一个重要方面,许多成熟的体细胞和干细胞已被用于构建组织工程心脏瓣膜,然而尚未获得理想的结果。 目的：以构成瓣膜的细胞成分为基础,对用于构建组织工程心脏瓣膜的种子细胞、体外细胞种植方法的研究进行综述。 方法：由第一作者基于PubMed数据库和万方数据库应用计算机检索2000年1月至2012年12月相关的文章,英文检索词为＂Tissue engineering,Heart valves,Cell＂,中文检索词为＂组织工程,心脏瓣膜,细胞＂,优选文章内容与组织工程心脏瓣膜种子细胞直接相关,具备针对性和权威性,发表在权威杂志的文章共39篇进行综述。 结果与结论：瓣膜的细胞成分主要是内皮细胞和间质细胞,早期人们常用内皮细胞和成纤维细胞构建组织工程瓣膜,随着干细胞研究的深入,应用搏动性生物反应器种植间充质干细胞具有构建的组织工程瓣膜的潜力。     

骨髓基质干细胞-组织工程瓣膜的新细胞来源

目的：比较人骨髓基质干细胞与人瓣膜间质细胞抗原表达和分泌基质的特点，探讨人骨髓基质干细胞用于构建组织工程瓣膜的可行性。方法：体外培养、扩增人骨髓基质干细胞和人瓣膜间质细胞，比较形态学和生长特性，免疫荧光和流式细胞仪检测比较两者的抗原表达，免疫组织化学检测两者的细胞外基质分泌。扫描电镜观察MSC在瓣膜支架上的附着。结果：骨髓基质干细胞具有肌成纤维细胞的形态，细胞型分析显示α平滑肌肌动蛋白和波形蛋白阳性，平均荧光强度比分别为4．9和3．8，表达量与瓣膜间质细胞(2．4和3．1)接近。MSC分泌I型和Ⅲ型胶原蛋白，组织学和扫描电镜可见骨髓基质干细胞在瓣膜表面生长旺盛，具有正常的分泌功能和形态。结论：骨髓基质干细胞易于从体内分离、扩增，具有和瓣膜间质细胞相似的形态、抗原表达和功能，可以在去细胞猪主动脉瓣膜附着和扩增，形成组织，显示MSC是一种有前途的细胞，可以作为瓣膜组织工程的种子细胞来源。     

人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架构建的组织工程心脏瓣膜

背景:去细胞处理的猪主动脉瓣膜植入人体后发生了免疫排斥反应,分析引起免疫排斥反应的原因是由于猪瓣膜的细胞外基质与宿主发生接触引起了免疫激活.目的:试图将人自身的细胞外基质履盖去细胞猪瓣膜表面起到隔离猪瓣膜与宿主血液成分接触的作用.同时应用免疫组化的方法验证人细胞外基质覆盖瓣膜的效果.设计、时间及地点:观察性实验,于2008-08/2009-04在解放军第二军医大学长海医院胸心外科实验室完成.材料:新鲜猪心脏瓣膜取白上海五丰上食肉联厂,采用酶消化法将猪主动脉瓣叶行脱细胞处理.密度梯度离心法从健康志愿者骨髓中获取骨髓基质干细胞.方法:用人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架来构建组织工程瓣膜,再应用前期制备的抗人细胞外基质单克隆抗体,采用免疫组织化学染色鉴定人细胞外基质在体外构建的组织工程瓣膜上的黏附情况.以未构建的去细胞猪瓣叶为对照组.主要观察指标:①组织工程瓣膜上种子细胞的黏附和生长情况.②免疫组织化学法检测人细胞外基质在瓣膜上覆盖的效果.结果:光镜下观察瓣膜表面均形成了细胞层.扫描电镜所见细胞排列欠规则,未完全覆盖去细胞瓣叶表面,可见裸露的瓣膜支架.免疫组织化学方法检测构建的瓣膜表面呈阳性反应证明有人的细胞外基质黏附,而对照组呈阴性证明了检测方法具有特异性.结论:体外构建的组织工程瓣膜上检测到有人的细胞外基质黏附.     

猪去细胞心脏瓣膜的免疫原性

背景:在去细胞猪瓣膜(Synergraft 瓣膜)的临床应用时发现异种的细胞外基质引发了人体一个强烈的炎症反应.早期的炎症反应严重地削弱了瓣膜内壁的基质结构,导致了移植物的结构破坏及衰败.从Synergraft瓣膜的事件中认识到猪去细胞瓣膜仍然具有免疫原性,尤其是在儿童患者中这种免疫反应会更强烈.因此对于细胞外基质蛋白引起的免疫排斥反应仍需要进一步的研究.目的:通过生物信息学的方法找到人与猪细胞外基质蛋白的基因序列差异,并制备抗体验证基质的免疫原性.设计、时间及地点:以Ⅳ型胶原基质为观察对象进行人、猪细胞外基质基因差异性的对比研究.于2008-06/2009-05在解放军第二军医大学长海医院胸心外科实验室完成.材料:新鲜猪瓣膜由上海五丰上食肉联厂提供,去细胞猪瓣膜、杂交瘤细胞和单克隆抗体由长海医院胸心外科实验室制备.方法:通过比较人、猪、鼠基因序列之间的相似区域和保守性位点,寻找有进化关系基因序列之间共同的保守区域、位点和序列差异,探索导致它们产生共同功能的基因序列以及基因序列间的差异片段.应用制备的抗猪Ⅳ型胶原单克隆抗体,采用免疫组化染色鉴定猪去细胞瓣膜上的猪瓣膜自身的细胞外基质存留情况.主要观察指标:Ⅳ型胶原基因序列差异分析结果、自制抗体有效性的免疫组化测试、自制抗体对猪去细胞瓣膜Ⅳ型胶原的检测结果.结果:通过基因比对的方法找到了人与猪Ⅳ型胶原的基因序列差异.通过杂交瘤技术成功制备检测细胞外基质的单克隆抗体;用免疫组化的方法检测到猪去细胞瓣膜上有猪的细胞外基质存留.结论:猪去细胞瓣膜支架上检测到有猪的细胞外基质存留,并且具有免疫原性.     

改性丝素蛋白支架与生长因子基因修饰脂肪间充质干细胞构建组织工程脂肪

背景：构建工程化的脂肪组织,适宜的种子细胞和性能优良的支架材料缺一不可。目的：探讨携带重组人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒载体感染人脂肪间充质干细胞后,与壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料体外构建组织工程脂肪的可行性。方法：选取生长良好的第3代人脂肪间充质干细胞,用携带重组人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒进行感染。将慢病毒感染与未感染的第3代人脂肪间充质干细胞成脂诱导14 d,油红O染色观察细胞的成脂能力;将慢病毒感染和未感染的第3代人脂肪间充质干细胞分别接种于壳聚糖修饰丝素蛋白支架材料上,MTT法检测细胞增殖能力;成脂诱导14 d后进行油红O染色,RT-PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶增殖物活化受体γ2的表达。结果与结论：成脂诱导14 d后,慢病毒感染与未感染的第3代人脂肪间充质干细胞均可见成熟脂肪细胞,组间差异不明显。慢病毒感染和未感染的第3代人脂肪间充质干细胞在改性丝素蛋白支架的生长曲线相近;成脂诱导后,油红O染色及RT-PCR均显示生成大量成熟脂肪细胞。表明携带重组人血管内皮细胞生长因子基因的慢病毒感染人脂肪间充质干细胞后,不影响其生长及成脂能力,与壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料可成功构建组织工程化脂肪。     

预分化脂肪干细胞与纤维蛋白胶和磷酸钙骨水泥自体异位构建血管化移植物

背景：预构骨皮瓣研究启发人们构建预构血管化骨进行游离移植来替代带血管蒂游离自体骨移植修复大段骨缺损的想法。目的：设计一种基于预分化脂肪干细胞、纤维蛋白胶和多孔磷酸钙骨水泥支架复合体的血管化移植物。方法：将体外分离培养的大鼠脂肪干细胞在条件培养基中进行血管内皮细胞定向分化,经鉴定活性后,复合至纤维蛋白胶和多孔磷酸钙骨水泥构建血管化组织工程支架。将血管化组织工程支架、纤维蛋白胶/多孔磷酸钙骨水泥支架及多孔磷酸钙骨水泥支架分别植入SD大鼠股四头肌肌袋内,植入后2,4周进行组织学检测、血管定量分析和Western blot检测。结果与结论：向血管内皮细胞分化的脂肪干细胞与纤维蛋白胶和多孔磷酸钙骨水泥共培养7 d,可见细胞密度适中,与支架组织结合较好。植入实验中,各组支架孔隙中充填有纤维血管组织和脂肪组织,血管化组织工程组支架孔隙中均长入大量血管,并有小动脉长入,不同时间点的血管直径和数量及血管内皮生长因子C的表达量均优于纤维蛋白胶/多孔磷酸钙骨水泥组和多孔磷酸钙骨水泥组（P〈0.01）。表明构建的血管化组织工程支架能够实现可靠迅速血管化。     

间充质干细胞构建组织工程化气管的研究与应用

背景：间充质干细胞诸多特有的良好生物学特性使得其在组织工程化气管研究中成为理想的种子细胞来源。目的：总结间充质干细胞在构建组织工程化气管领域的研究现状、进展、存在的问题及展望。方法：由作者检索PubMed数据库及CNKI数据库1979至2012年,在英文标题和摘要中以＂mesenchymal stem cells,tissue-engineered trachea＂和＂tracheal chondrocytes,tracheal epithelial cells,tracheal vascular endothelial cells＂检索,中文文献检索中以＂间充质干细胞、组织工程化气管、气管软骨细胞、气管上皮细胞和气管血管内皮细胞＂为关键词,选择与组织工程化气管相关的文章,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志的文章,共纳入51篇。结果与结论：组织工程化气管种子细胞研究主要包括软骨细胞、上皮细胞和血管内皮细胞。实验已证实,间充质干细胞可定向分化为软骨细胞,细胞因子在诱导间充质干细胞分化为软骨过程中起着关键作用。目前尚未发现合适的诱导因子能特异性诱导间充质干细胞定向分化气管上皮细胞。有研究发现间充质干细胞具有向上皮细胞分化的潜能。间充质干细胞在体内或体外特殊条件下可诱导分化为血管内皮细胞,为间充质干细胞作为种子细胞分化血管内皮细胞应用于组织工程化气管起到借鉴作用。     

精氨酸甘氨酸天冬氨酸多肽表面修饰促进生物支架材料对骨髓来源种子细胞的黏附

背景:精氨酸甘氨酸天冬氨酸多肽具有较强的黏附性和生物支架材料可接枝结合,且不会改变材料的表面理化性质.目的:观察应用精氨酸甘氨酸天冬氨酸多肽表面修饰猪主动脉瓣去细胞支架材料对骨髓干细胞黏附性的影响.方法:采用胰蛋白酶+TritonX-100 法制备猪主动脉瓣去细胞支架材料,用YGRGDSP多肽(酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸)进行处理,按照精氨酸甘氨酸天冬氨酸多肽的质量浓度(0.5,1.0,1.5,2.0 g/L)、反应时间(4,8,12,24 h)、反应pH值(7.0,7.4,8.0)分为不同实验组.结果与结论:茚三酮显示精氨酸甘氨酸天冬氨酸多肽可很好的交联到猪主动脉瓣去细胞支架材料,最佳反应条件为:室温、1.5 g/L精氨酸甘氨酸天冬氨酸、pH 7.4、持续振荡12 h.提示利用YGRGDSP多肽对猪主动脉瓣去细胞支架材料进行表面修饰可显著改善骨髓来源种子细胞的黏附性.