静压力下兔髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化

目的 研究兔髁突软骨细胞对静压力的分子生物学响应。方法：体外分离培养4周龄健康雌性新西兰大白兔髁突软骨细胞,使用形态学观察,COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色方法对P2代髁突软骨细胞进行鉴定;100kPa静压力条件下,分别对P2代髁突软骨细胞进行0、1、2、3和4 h的加压处理;采用CCK-8检测压力加载后各组细胞活性的变化;通过Western免疫印迹分析髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果：兔髁突软骨细胞呈多角形,“铺路石”样排列,细胞爬片COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色鉴定结果为阳性。100kPa静压力加载1 h时,细胞活性显著降低（P=0.04）,但在2~4 h后,细胞活性恢复并与对照组无显著差异。Western印迹结果显示,压力加载3 h和4 h时,COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达显著升高。其中,在压力加载4 h组ALP的表达量比3 h组低。结论：兔髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有一定的适应能力,100kPa静压力加载4 h不会对髁突软骨细胞活性产生不可逆损伤。适宜的压力加载对髁突软骨细胞的成软骨和成骨能力有促进作用。髁突软骨细胞压力微环境的改变,可能影响颞下颌关节适应性改建和颞下颌关节紊乱病的病理过程。     

生长期兔颞下颌关节盘前移位对髁突软骨内Ihh和PTHrP表达的影响

目的：研究颞下颌关节盘前移位对生长期兔髁突软骨印度豪猪蛋白（Ihh）和甲状旁腺相关蛋白（PTHrP）表达的影响,探讨关节盘前移位与下颌骨髁突生长发育之间的关系。方法：取3个月龄日本大耳白兔21只．建立颞下颌关节盘前移位动物模型,分别于建模后4、8、12周处死取材,观察髁突软骨组织学变化,并通过免疫组织化学方法检测Ihh、PTHrP在髁突软骨中的表达与定位。结果：关节盘移位后4周,髁突软骨结构轻度紊乱;8周时,髁突前部软骨形态结构发生显著改变;12周时．软骨正常结构丧失进一步加剧。关节盘移位后4周,可见Ihh、PTHrP在增殖带深层细胞内明显表达,8周、12周时在髁突深层软骨细胞内表达。结论：颞下颌关节盘前移位导致髁突软骨结构进行性病理性损害．Ihh和PTHrP在盘移位后髁突软骨病理性改变的过程中发挥重要作用．提示关节盘前移位可能通过Ihh-PTHrP负反馈信号通路对生长期髁突软骨内成骨过程产生影响。     

不同静压力下髁突软骨细胞MMP-13的表达变化研究

目的:探讨在不同强度及不同时间的静压力作用下,髁突软骨细胞中MMP-13表达的变化及意义。方法 :体外分离培养SD大鼠髁突软骨细胞,用甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行鉴定;分别用0、50、100、150、200 k Pa静压力进行2 h的加压处理。另外在200 k Pa静压力下,分别对髁突软骨细胞进行0、1、2、4、8和12 h的加压,采用Western blot免疫印迹及实时荧光定量PCR,分析髁突软骨细胞在不同强度及不同时间的静压力加载后,MMP-13的m RNA和蛋白表达变化。结果 :在50~200 k Pa的静压力范围内,随着压力的增大,MMP-13蛋白及m RNA表达水平均呈下降趋势,实验组表达水平均降至对照组(0 k Pa组)以下,且差异有统计学意义(P<0.05)。在200 k Pa的静压力下,随着加压时间的延长,MMP-13表达呈先上升后下降的趋势,且4 h实验组达最高水平(P<0.05)。结论:髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有较好的适应能力,压力的改变可能影响颞下颌关节的适应性改建。     

Ihh-PTHrP负反馈信号通路对髁突软骨内成骨作用的研究现状

临床研究发现,颌面部发育畸形的患者,尤其是Ⅱ类错患者,常同时伴有颞下颌关节盘前移位,而青少年期颞下颌关节盘前移位与颌面部发育畸形存在密切关系。其原因可能与关节盘移位导致髁突表面的应力分布发生改变有关,但具体机制尚不明确。印度豪猪蛋白(Ihh)-甲状旁腺相关蛋白(PTHrP)信号通路是调节骨骺生长板软骨细胞增殖、分化、肥大和矿化的重要负反馈轴,在软骨内成骨中发挥着关键的作用。同时,Ihh是机械应力信号向生物信号转导的重要媒介,介导机械应力信号向刺激软骨生长的生物信号转化。本文对Ihh-PTHrP负反馈信号通路对下颌骨髁突软骨内成骨作用的研究现状作一综述。     

甲状旁腺相关蛋白及其受体PTH1R及Ihh信号在鼠胚髁突软骨中的分布特征

目的探讨甲状旁腺相关蛋白(PTHrP)及其受体PTH1R及Ihh信号在髁突软骨发育过程中的分布特征及意义。方法取E14~18 d鼠胚,以免疫组化及原位杂交染色方法,检测PTH1R抗体及PTHrPI、hh mRNA在下颌髁突软骨发生过程中的分布特征。结果在鼠胚下颌髁突软骨发育过程中,PTHrP、PTH1R主要表达于软骨膜间质细胞、软骨细胞及大部分肥大软骨细胞中,Ihh主要位于肥大软骨细胞上层及其与扁平细胞层交界处,PTHrP及Ihh信号可能通过自分泌和(或)旁分泌作用调控髁突软骨细胞的增殖和分化。结论鼠胚下颌髁突软骨发育过程中,PTHrP、PTH1RI、hh的分布特征与其在生长板分布不同,提示PTHrP可能对髁突全层软骨细胞均具有增殖促进作用。     

不同静压力对大鼠髁突软骨细胞生物学特性的影响

目的探讨不同静压力对髁突软骨细胞生物学特性的影响。方法对培养到第3代的新生SD大鼠髁突软骨细胞加载12、24、36 kPa的静压力，1 h后立即收集样本，同时设不加载力的对照组，用免疫组织化学技术对样本细胞进行染色，用病理图像分析仪分析细胞胞浆中胶原表达强度的变化。结果对于对照组、12、24 kPa组，随着压力的增加，髁突软骨细胞表达Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原及蛋白多糖（ PG）增加。与24 kPa组相比，36 kPa组髁突软骨细胞表达Ⅰ型胶原及PG减弱，而Ⅱ、Ⅲ型胶原表达则增加。结论适当的压力刺激可能会使髁突软骨细胞分化更加成熟，但是过大的应力则可能导致髁突软骨细胞生物学特性减弱，从而表现出去分化的某些特征。     

静张应力对大鼠髁突软骨细胞增殖效应调节研究

目的　探讨静张应力环境对髁突软骨细胞增殖效应的影响。方法　将第4代大鼠下颌髁突软骨细胞在细胞膜式张应力施加装置上培养,检测不同血清浓度及持续不同的静张应力(5 kPa、10 kPa)在0~12 h内对髁突软骨细胞增殖活性的影响。结果　低血清培养基中,随培养时间的延长,硅胶膜上髁突软骨细胞的增殖活性受到抑制;短期(2h)的静张应力(5 kPa、10 kPa)对髁突软骨细胞细胞周期的调控影响不大;0~10 h内5 kPa静张应力组软骨细胞增殖指数随着张应力作用时间的延长不断上升,增殖指数峰值位于10 h处;0~8 h内10 kPa静张应力组软骨细胞增殖指数随着张应力作用时间的延长不断上升,增殖指数峰值位于8 h处;5 kPa静张应力组较10 kPa静张应力组对髁突软骨细胞具有更大的促增殖作用。结论　静张应力可以调节髁突软骨细胞的增殖活性。     

静压力对髁突软骨超微结构的影响

目的:观察静压力对髁突软骨组织超微结构的影响。方法:取24只6日龄乳鼠双侧髁突软骨,体外培养3d后随机分为对照组、100 kPa加压4 h组、300 kPa加压4 h组和300 kPa加压12 h组,施加相应静压力,利用透射电镜观察加压后髁突软骨组织的变化。结果:与100 kPa加压4 h组相比,300 kPa加压4h和12 h后,下列变化依次更加明显:髁突软骨细胞内粗面内质网发达,核仁明显,胞周基质结构清晰,胶原纤维和蛋白多糖颗粒增加。结论:300 kPa以下、12 h作用时间内的静压力能够增强髁突软骨细胞基质合成能力。     

静压力对髁突软骨转化生长因子β1表达影响的体外研究

目的:观察静压力对体外培养髁突软骨细胞表达TGF-β1的影响。方法:解剖、培养SD大鼠髁突软骨,应用静压力加载装置对实验组软骨加载强度为10kPa的持续静压力1h。对照组除软骨不加力外,其它培养条件与实验组相同,加力完成后2组同时收集样本。用免疫组化技术检测2-实验组和对照组髁突软骨TGF-β1的含量和分布,用彩色病理图像分析仪检测髁突软骨各层TGF-β1表达的强度。结果:实验组的髁突软骨各层细胞TGF-β1表达均增强,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。其中成软骨细胞层改变最明显(P<0.01)。结论:静压力促进髁突软骨各层细胞TGF-β1表达增强,其中成软骨细胞层表达增强最为明显。     

压力对髁突软骨细胞增殖及TGF-β_lmRNA表达影响的体外研究

目的 :观察体外单层培养的髁突软骨细胞加载机械压力后增殖活性和转化生长因子βlmRNA(TGF βlmRNA)表达在不同时点的变化 ;对压力刺激导致的TGF βlmRNA表达与软骨细胞增殖之间的关系进行初步探讨。材料和方法 :选用新生SD大鼠的髁突软骨作为原代培养的组织来源 ,建立髁突软骨细胞有限细胞系 ;应用自行设计的静压力加载装置对培养细胞加载强度为 12 0 g/cm2的持续压力 1h。分别于加力后 0、6、12、18、2 4h收集样本 ,用流式细胞仪分析各样本中细胞的DNA含量和细胞周期并计算增殖指数 ;用原位杂交技术检测压力作用后细胞TGF βlmRNA的表达 ,以彩色病理图象分析仪检测各样本表达的阳性率。对照组细胞除不加力外 ,其它培养条件和检测方法与实验组相同。结果 :加力后 0h体外培养的髁突软骨细胞增殖活性和S期细胞百分比在加力结束时都较对照组增大 (P <0 .0 5 ) ,但在加力后 12h恢复 ,12～ 2 4h内实验组细胞增殖指数和S期细胞比例与对照组保持相同的变化趋势和相似的水平 ;实验组TGF βlmRNA表达在停止加力后 0h也较对照组明显增强 (P <0 .0 5 ) ,但 6h左右即恢复到与对照组相似的水平 ,之后 6～ 2 4h内的变化与对照组比较无明显差别。结论 :(1)本研究所设计的压力加载装置以气体为介质对细胞施加稳定、     

体外培养的兔下颌骨髁突对机械压力的反应和变化

目的: 探索体外培养的下颌骨髁突组织块对机械压力的反应和变化。方法: 兔下颌骨髁突组织块分别在0（对照）、15和75 kPa机械压力下体外培养3 d,观察髁突的大体形态、组织切片,进行micro-CT扫描,分别采用RT-PCR和Western免疫印迹检测Ⅱ型胶原蛋白(COL2)、X型胶原蛋白 (COL10)、SOX9和MMP13的mRNA及蛋白表达。采用SPSS 16.0 软件包对数据进行统计学分析。结果: 15 kPa组,髁突关节面光滑,软骨呈白色,关节面中心受压后变平,但软骨仍完整。75 kPa组,髁突关节面变粗糙,颜色变黄、暗淡,关节面中央受压变平的面积更大,中心区域软骨破裂。镜下可见,15 kPa组的软骨层变薄,软骨细胞排列比对照组更紧密。75 kPa 组中,整个软骨层被破坏并与中心区域的软骨下骨分离。COL2和SOX9的表达在15 kPa压力下显著增加（P<0.01）,在75 kPa压力下显著下降。COL10和MMP13的表达在75 kPa压力下显著增加（P<0.01）。Micro-CT扫描结果显示,压力组的骨密度（BMD）、骨体积/总体积比值（BV/TV）和 骨小梁厚度（Tb.Th）显著增加（P<0.01）。结论: 体外培养的髁突组织块在15 kPa机械压力下保持完整性和功能,并发生适应性改建。75 kPa的压力对软骨产生破坏,软骨层受损、破裂并从软骨下骨处剥离,可能进一步导致骨关节炎的发生。     

Study on the effects of gradient mechanical pressures on the proliferation,apoptosis, chondrogenesis and hypertrophy of mandibular condylar chondrocytes in vitro

ObjectiveTo investigate the effects of gradient mechanical pressure on chondrocyte proliferation, apoptosis, and the expression of markers of chondrogenesis and chondrocyte hypertrophy.MethodsMandibular condylar chondrocytes from 5 rabbits were cultured in vitro, and pressed with static pressures of 50 kPa, 100 kPa, 150 kPa and 200 kPa for 3 h, respectively. The chondrocytes cultured without pressure (0 kPa) were used as control. Cell proliferation, apoptosis, and the expression of aggrecan (AGG), collagen II (COL2), collagen X (COL10), alkaline phosphatase (ALP) were investigated. Ultrastructures of the pressurized chondrocytes under transmission electron microscopy (TEM) were observed.ResultsChondrocyte proliferation increased at 100 kPa and decreased at 200 kPa. Chondrocyte apoptosis increased with peak pressure at 200 kPa in a dose-dependent manner. Chondrocyte necrosis increased at 200 kPa. The expression of AGG increased at 200 kPa. The expression of COL2 decreased at 50 kPa and increased at 150 kPa. The expression of COL10 and ALP increased at 150 kPa. Ultrastructure of the pressurized chondrocytes under TEM showed: at 100 kPa, cells were enlarged with less cellular microvillus and a bigger nucleus; at 200 kPa, cells shrank with the sign of apoptosis, and apoptosis cells were found.ConclusionsThe mechanical loading of 150 kPa is the moderate pressure for chondrocyte: cell proliferation and apoptosis is balanced, necrosis is reduced, and chondrogenesis and chondrocyte hypertrophy are promoted. When the pressure is lower, chondrogenesis and chondrocyte hypertrophy are inhibited. At 200 kPa, degeneration of cartilage is implied.     

牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖及相关因子表达的影响

目的:观察牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖、炎性因子及Hedgehog通路基因的表达影响,探讨牵张力对软骨细胞的调控。方法:体外培养软骨细胞并鉴定。用Flexcell 4000TM加力板对细胞施加0.5 Hz,0%、3%和15%的牵张应变,作用4 h后检测细胞增殖情况,对比PCNA、Caspase-3、COL II、IL-1β、TNF-α及Hedgehog通路基因Ihh、Ptc和Smo的表达变化。结果:与对照组相比,3%组细胞增殖速度增加,PCNA、COLII、Ihh、Ptc和Smo的mRNA表达增加,15%组Caspase-3、IL-1β和TNF-α表达增加,而PCNA、Smo表达降低。与3%组相比,15%组细胞增殖速度降低,PCNA、COL II、Ihh和Smo表达降低,而Caspase-3、IL-1β表达增高。结论:不同强度牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖活性及炎性因子表达作用不同。Hedgehog通路对牵张力敏感,可能参与了力学刺激对软骨细胞的调控。     

Involvement of PI3K/Akt pathway in rat condylar chondrocytes regulated by PTHrP treatment

Objective

The aim of this study was to explore the mutual communication of the parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) and phosphatidylinositol 3-kinase/threonine protein kinase (PI3K/Akt) pathway on the proliferation and differentiation of condylar chondrocytes from Sprague-Dawley (SD) rats.

Methods

Condylar chondrocytes from the condylar cartilage were cultured and an organ culture system of mandibular condyles was employed. The distribution of PI3K, phospho-Akt (p-Akt), and PTHrP in condylar cartilage was detected by either immunohistochemistry or immunofluorescence. The second passage chondrocytes and condyle specimens in the organ culture system were treated with PTHrP, LY294002, PTHrP and LY294002 in combination, or dimethyl sulfoxide (DMSO), separately. The mRNA and protein levels of type II (Col II) and type X collagen (Col X) were investigated by real-time polymerase chain reaction (PCR) and Western blot analysis. The condyle growth in organ culture system was analysed by haematoxylin–eosin staining.

Results

PTHrP, PI3K, and p-Akt were mainly located in the proliferative and hypertrophic zones. PTHrP promoted the proliferation of condylar chondrocytes, while LY294002 limited this effect. The mRNA and protein levels of Col II and Col X in these cells were reduced by PTHrP and enhanced by LY294002. Organ culture showed a significant enhancement of condyle elongation with PTHrP treatment or a combination of PTHrP and LY294002 treatment. After treatment with LY294002, the length of condyles was reduced compared with the samples treated with DMSO.

Conclusions

We conclude that the PI3K/Akt pathway plays an essential role in the proliferation and differentiation of condylar chondrocytes and is a potential target for PTHrP in regulating chondrocyte differentiation at condylar cartilage.