瘦素预处理对心肌缺血-再灌注损伤小鼠血清MPO MDA SOD水平变化的影响

目的 监测小鼠心肌缺血-再灌注损伤(MIRI)过程中血清髓过氧化物酶(MPO)、血清丙二醛(MDA)、心肌超氧化物歧化酶(SOD)水平的变化,以及瘦素(Leptin)预处理对它们的影响.方法 20只雄性C57BL/6小鼠,随机分为四组:假手术组(sham 组);MIRI组;MIRI瘦素预处理组(Leptin+MIRI组):小鼠于MIRI手术前30 min予腹腔注射重组瘦素(recombinant mouse leptin);MIRI术后瘦素处理组(MIRI+Leptin组):小鼠于MIRI手术后30 min予腹腔注射重组瘦素.在MIRI手术后6 h,分别从四组小鼠收获标本,测定小鼠血清MPO、MDA及心肌SOD水平.结果 与假手术组比较,MIRI瘦素预处理组血清MPO水平显著升高(P<0.01);与MIRI组比较,MIRI瘦素预处理组血清MPO水平显著降低(P<0.01).与假手术组比较,MIRI瘦素预处理组血清MDA水平显著升高(P<0.01),心肌SOD水平显著降低(P<0.01);与MIRI组比较,MIRI瘦素预处理组血清MDA水平显著降低(P<0.01),心肌SOD水平显著升高(P<0.01).结论 瘦素预处理能够减轻脂质过氧化和自由基损伤,减少炎性细胞因子的表达,进而达到减轻心肌损伤的作用.     

小鼠皮肤心脏联合移植模型的建立及移植物功能监测

目的探讨小鼠皮肤心脏联合移植模型的建立及移植物功能的监测。方法以BALB/C小鼠、C57BL/6小鼠做为供、受者,单纯皮肤移植组采用尾-背法行皮肤移植,单纯心脏移植组采用腹腔异位心脏移植法行心脏移植,皮肤心脏联合移植组序贯采用尾-背皮肤移植及腹腔异位心脏移植模型。术后采用腹部触诊的方法,监测心脏移植物功能,通过观察残存移植皮片大小,监测皮肤移植物功能。结果皮肤心脏联合移植组皮肤移植物存活时间较单纯皮肤移植组略有延长(皮肤心脏联合移植物v.s.单纯皮肤移植组,8天v.s.7天),但两组皮肤移植物存活时间比较没有显著差别(P=0.1290)。单纯心脏移植组心脏移植物和皮肤心脏联合移植组心脏移植物平均存活时间均为9天(MST=9天),两组心脏移植物存活时间无显著差别(P=0.6077)。结论小鼠皮肤心脏联合移植模型稳定,移植物功能监测简单方便,适用于移植免疫学方面的研究。     

瘦素预处理减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤的实验探讨

目的 监测小鼠心肌缺血/再灌注损伤(MIRI)过程中,血清炎性细胞因子TNF-α、IL-6水平, 中性粒细胞活性及氧自由基含量的变化,以及瘦素(leptin)预处理对其影响, 探讨瘦素预处理在小鼠MIRI过程中的作用及其机制.方法 24只雄性C57BL/6小鼠随机分为四组:①假手术组;②心肌缺血/再灌注模型组(MIRI组);③MIRI瘦素预处理组(leptin+MIRI组);④MIRI术后瘦素处理组(MIRI+leptin组).在MIRI手术后6 h,四组小鼠分别取标本, 测定小鼠血清炎性细胞因子水平(TNF-α、IL-6)、髓过氧化物酶活性(MPO)水平、血清丙二醛(MDA)活性以及超氧化物歧化酶(SOD)含量.结果瘦素预处理可降低细胞因子TNF-α、IL-6的水平,降低小鼠MPO活性,减少MDA含量并升高SOD活性.结论 瘦素预处理可减少中性粒细胞的聚集与浸润, 减轻脂质过氧化和自由基损伤, 对MIRI有保护作用.     

瘦素预处理和缺血预处理在小鼠心肌缺血/再灌注损伤中的心肌保护机制

目的 观察瘦素预处理和缺血预处理(IPC)对心肌缺血/再灌注损伤(MIRI)模型小鼠的心肌保护作用,探讨瘦素参与的机制.方法 将36只C57BL/6小鼠按随机数字表法分为5组:①假手术组(12只);②短暂缺血/再灌注(I/R)组(6只):缺血3 min后再灌注5 min,进行3个短暂的循环;⑨标准I/R组(6只):缺血30 min后再灌注120 min,④IPC组(6只):行3个短暂I/R循环后再进行标准I/R操作;⑤瘦素预处理组(6只):缺血前30min腹腔注射50μg/kg小鼠重组瘦素.假手术组和短暂I/R组分别于再灌注后0(RP刻)、5、30、120 min取血,动态监测血清瘦素水平;其余各组于再灌注后120 min处死小鼠,观察心肌梗死面积、心肌瘦素水平、髓过氧化物酶(MPO)活性,以及血清瘦素、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平.结果 短暂I/R处理后5 min血清瘦素水平即较假手术组同期显著升高[(6.24±2.34)μg/L比(1.35±0.45)μg/L],30 min达峰值[(12.36±1.33)μg/L],之后逐渐下降,与假手术组水平同期比较差异无统计学意义[(1.96±1.33)μg/L比(1.16±0.25)μg/L,P＞0.05].与标准I/R组比较,瘦素预处理组与IPC组均可显著缩小梗死面积[(11.50±2.86)%、(9.00±1.90)%比(37.00±2.53)%],降低心肌瘦素[(8.36±3.42)μg/g、(6.71±2.03)μg/g比(15.51±3.92)μg/g]、MPO((17.10±3.95)μg/g、(13.33±2.88)μg/g比(30.83±4.06)μg/g]以及血清瘦素[(15.03±1.87)μ/L、(11.85±0.72)μg/L比(29.55±2.31)μg/L]、TNF-α[(35.10±10.12)ng/L、(27.04±5.18)ng/L比(81.34±14.20)ng/L]、IL-6[(167.39±72.83)ng/L、(149.13±37.69)ng/L比(477.30±29.09)ng/L]水平(均P＜0.01).结论 低剂量瘦素预处理可模仿经典的IPC以减轻MIRI,瘦素参与IPC的心肌保护机制可能与减轻炎症反应有关.     

巨细胞病毒对小鼠心脏移植术后急性排斥反应的影响

目的观察巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）感染对同种异基因小鼠腹腔异位移植心脏急性排斥反应的影响。方法 BALB/c小鼠80只,C57BL/6小鼠40只,按供、受鼠基因不同分为3组（每组20对）：同质移植组（A组,BALB/c→BALB/c）、环胞素A组（B组,C57BL/6→BALB/c）和小鼠巨细胞病毒联合环胞素A组（C组,C57BL/6→BALB/c）,施行小鼠腹腔异位心脏移植术。A组无药物干预,B组术后腹腔注射CsA 20mg/kg.d,C组除腹腔注射CsA 20mg/kg.d外,术后第1d腹腔接种104PFU小鼠巨细胞病毒（MCMV）0.2ml。术后观察移植鼠心脏跳动情况、移植心脏存活时间、移植心脏的病理组织学以及MCMV病毒滴度测定。结果术后10d,A组移植心脏几乎无排斥反应;B组移植心脏搏动有力,显微镜下观察移植心脏心肌间质内有局灶性炎症细胞浸润,心肌有变性;C组移植心脏搏动微弱,体积增大,重量增加,显微镜下见心内、外膜下及心肌间质有弥漫性淋巴细胞及单核细胞浸润;心肌细胞可发生变性、坏死。C组（12.4±1.3d）移植心脏存活时间明显低于B组（16.7±1.9d）（P〈0.01）,而A组移植心脏长期存活（观察60d）。结论巨细胞病毒感染加速小鼠腹腔异位移植心脏急性排斥反应。     

NKT细胞通过IL-10参与诱导小鼠心脏移植免疫耐受

目的探讨NKT细胞在诱导小鼠心脏移植免疫耐受中的作用机制。方法 BALB/c小鼠作为供体,C57BL/6小鼠作为受体,建立小鼠腹部异位心脏移植模型。排斥组:单纯行心脏移植,无其他处理;耐受组:受鼠于术前7天接受BALB/c来源脾细胞(1×107个/只)尾静脉注射,并分别于术前7天、5天、3天,接受抗CD40L抗体腹腔注射(250μg/只/次)。术后通过腹部移植心触诊,观察移植心存活情况;分别取排斥组术后10天及耐受组术后50天的受鼠脾脏,分离NKT细胞,通过混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction,MLR)检测NKT细胞的免疫抑制功能;通过ELISA法检测NKT细胞的细胞因子分泌情况。结果 NKT细胞可以抑制供体抗原特异性淋巴细胞增殖,并可通过IL-10参与诱导免疫耐受。结论 NKT在诱导小鼠心脏移植免疫耐受过程中起重要作用。     

建立小鼠腹腔心脏移植模型的方法改进

背景:小鼠心脏移植模型目前有颈部移植和腹腔移植.由于颈部空间狭窄,颈总动脉相对细小,移植心脏易于周围组织粘连,限制移植心脏搏动,不利于移植物长期观察.腹主动脉相对较粗,易于吻合,且长期血管通常率高,能够对移植心脏长期观察进行慢性移植物血管病变研究.目的:对小鼠腹部心脏移植的技术方法进行改进,为进行移植免疫学研究提供动物模型.方法:采用供心主动脉与受体腹主动脉、供心肺动脉与受体下腔静脉端侧吻合方法对小鼠进行腹部心脏移植,按随机数字表法将小鼠分为3组,同系移植组为同种同基因C57→C57,同种移植组为同种异基因Babl/c→C57,抗CD45RB mAb组为抗CD45RB mAb200 μg腹腔注射Babl/c→C57.以供心搏动有力,且小鼠存活72h以上视为移植成功.设移植后40d为观察终点.结果与结论:共实施手术36例次,受体存活30只,成功率为83.3%.其中受体准备时间为(15±2)min,供心摘取时间为(8±1)min,血管吻合时间为(33±2)min.抗CD45RB mAb腹腔注射组小鼠移植心脏存活时间较同种移植组明显延长(P=0.001).提示所建立的小鼠心脏移植模型稳定可靠,可用于移植免疫学方面的研究.抗CD45RB mAb可明显延长移植心脏存活时间.     

异体脐带间充质干细胞对大鼠心脏移植的免疫调节

背景:有资料表明骨髓间充质干细胞可延长小鼠和狒狒异体皮肤移植存活时间,降低造血干细胞移植后急性和慢性移植物抗宿主病的发生,但目前尚未见关于大鼠脐带间充质干细胞用于心脏移植减少排斥反应的报道.目的:观察异体脐带间充质干细胞对大鼠心脏移植的免疫调节作用.方法:DA大鼠20只作为供体,Lewis大鼠20只作为受体,均随机分为2组,即药物干预组、对照组,每组供受体大鼠各10只.采用双套管法将供体大鼠的左肺动脉和无名动脉分别与受体大鼠心脏的颈外静脉和颈总动脉在显微镜下行端端吻合,建立异位心脏移植模型.Wistar孕鼠1只,采用胶原酶消化法分离培养脐带间充质干细胞.造模后,细胞移植组经尾静脉注射脐带间充质干细胞,对照组同法注射氯化钠注射液.检测移植心脏的存活时间,采用心脏移植急性排斥反应诊断标准对移植心脏进行组织病理学评分,苏木精-伊红染色观察移植心脏淋巴细胞浸润程度.结果与结论:与对照组比较,细胞移植组移植心脏存活时间显著延长(P=0.001),急性排斥反应病理学评分显著降低(P=0.000 4).对照组心肌组织内有大量淋巴细胞和单核细胞浸润,细胞移植组心肌组织内有少量淋巴细胞浸润,心肌间质轻度水肿.结果证实大鼠脐带间充质干细胞可诱导心脏移植免疫耐受,减轻免疫排斥反应,延长心脏存活时间.     

环孢素A联合供者骨髓细胞输注延长同种大鼠移植心脏存活时间

背景:同种异体器官移植后需长期使用免疫抑制剂控制机体免疫状态以免发生排斥反应,但免疫抑制治疗使受者的感染发生率增高,诱导移植免疫耐受是解决这一问题的理想方法.在啮齿类动物,已能诱导出长期免疫耐受,其中供者骨髓细胞输注在诱导免疫耐受中具有重要作用.目的:观察环孢素A联合供者骨髓细胞输注对同种大鼠移植心脏存活时间的影响.设计:随机对照动物实验.单位:浙江大学医学院附属第一医院肾脏病中心.材料:实验于2002-03/2004-12在浙江大学医学院实验动物中心完成.选用SPF级近交系雄性Lewis大鼠40只和雄性BN大鼠60只,实验方法符合动物伦理学要求.方法:①制作Lewis→BN大鼠的异位(腹部)心脏移植模型(n=40),将40组动物模型按随机数字表法分为4组(n=10):对照组不进行特别处理;环孢素A组术后连续7 d给予环孢素A:联合处理组分别于术中及术后第6天输注供者骨髓细胞,术后连续7 d给予环孢素A;供者骨髓细胞组分别于术中及术后第6天输注供者骨髓细胞.另以BN大鼠间的异位(腹部)心脏移植作为BN对照组(n=10).②观察各组受体大鼠移植心脏的存活时间,检测术后第6天血清白细胞介素2含量以及移植心脏组织中肿瘤坏死因子mRNA表达水平,应用流式细胞仪检测术后第6,12,18天时受体外周血有核细胞中的供体来源细胞、CD3 CD25 细胞、CD4 CD25 细胞的百分比以及共刺激分子CD86表达水平、CD4 CD45RC /CD4 CD45RC-比率等.主要观察指标:各组受体大鼠移植心脏存活时间、血清白细胞介素2含量及心肌组织中肿瘤坏死因子α mRNA水平、排斥反应分级、外周血有核细胞中的供者来源细胞、CD3 CD25 细胞、CD4 CD25 细胞的百分比及共刺激分子CD86表达、CD4 CD45RC /CD4 CD45RC-比率等.结果:Lewis大鼠40只及雄性BN大鼠60只全部进入结果分析.①联合处理组大鼠移植心脏存活时间长于对照组和供者骨髓细胞组(P＜0.05).②联合处理组大鼠血清白细胞介素2含量及心肌组织中肿瘤坏死因子α mRNA表达水平均低于对照组和供者骨髓细胞组(P＜0.05).③联合处理组大鼠排斥反应程度轻于其他3个移植组.④联合处理组大鼠外周血有核细胞上CD86表达受到明显抑制:术后6.12d联合处理组的CD4 CD45RC /C134 CD45RC比率及D3 cD25 细胞百分比均低于对照组和供者骨髓细胞组:接受供者骨髓细胞输注大鼠外周血中供者来源的有核细胞多于未输注大鼠.结论:短疗程环孢素A治疗联合供者骨髓细胞输注能减轻大鼠心脏移植急性排斥反应程度,延长移植心脏存活时间.     

异基因脾细胞诱导大鼠心脏移植及二次皮肤移植的免疫耐受

目的:比较不同时间输注脾细胞诱导大鼠同种异体心脏移植免疫耐受效果的差异,并观察其对二次皮肤移植的耐受情况。方法:实验于2005-03/2006-01在广西医科大学医学实验动物中心外科实验室完成。在SD(供体)→Wistar(受体)大鼠之间进行心脏移植手术。将29只受体大鼠按随机数字表法分为4组:①对照组(n=8):直接进行心脏移植手术。②环磷酰胺组(n=7):心脏移植术后2d,给予受体大鼠腹腔注射环磷酰胺80mg/kg。③脾细胞 环磷酰胺组(n=7):心脏移植术后经门静脉注入供体大鼠脾细胞2×108个,2d后再经腹腔注射环磷酰胺80mg/kg。④脾细胞预处理组(n=7):受体大鼠经门静脉注入供体脾细胞2×108个,1周后行心脏移植手术。术后常规观察移植心脏的存活情况;术后第6天各组随机取1只大鼠的移植心脏进行病理学检查;术后1周测定受体大鼠外周血CD25 的表达水平;术后30d对诱导耐受的脾细胞 环磷酰胺组、脾细胞预处理组大鼠进行二次异体皮肤移植,并以未进行诱导耐受的大鼠作为对照组,以移植皮片出现排斥为标准,观察移植皮肤的存活情况。结果:29只受体大鼠中4只大鼠取供心行常规病理学检查,最终25只受体大鼠进入结果分析。①脾细胞 环磷酰胺组、脾细胞预处理组受体大鼠移植心脏的存活时间均长于未作耐受诱导的对照组和环磷酰胺组[(30.17±2.79,30.67±3.44;5.29±0.76,5.50±0.55)d(P<0.01)]。②病理检查显示,未经过脾细胞诱导处理大鼠的移植心脏均表现出明显的急性排斥反应,脾细胞 环磷酰胺组、脾细胞预处理组大鼠的移植心脏未发生排斥反应。③脾细胞 环磷酰胺组、脾细胞预处理组大鼠心脏移植术后1周外周血的CD25 T淋巴细胞水平均显著低于对照组、环磷酰胺组[(5.10±0.38)%,(4.89±0.51)%;(7.88±0.43)%,(7.12±0.40)%(P<0.01)]。④脾细胞 环磷酰胺组、脾细胞预处理组、对照组大鼠移植皮肤的平均存活时间差异均无显著性意义(P>0.05)。结论:术中/术前输注异基因脾细胞均可以诱导受体大鼠产生针对供体的特异性心脏移植耐受,但并不能诱导产生针对二次皮肤移植的免疫耐受。