虾源达卡气单胞菌全基因组分析和致病性研究

目的 为了解虾源达卡气单胞菌的毒力、耐药基因分布和全基因组信息,并初步评估达卡气单胞菌的致病性。方法 对虾源分离株进行分子鉴定和多位点序列分型;利用β-溶血和胞外蛋白酶实验、秀丽隐杆线虫液体毒性实验、细胞毒实验、小鼠实验及毒力基因检测研究其致病性;通过药敏实验及耐药基因检测分析其耐药特征;利用eggnog、Prophage Hunter工具对全基因组序列进行分析。结果 菌株18FX22鉴定为达卡气单胞菌。该菌的致病性主要表现：有β-溶血能力和胞外蛋白酶活性;对秀丽隐杆线虫、小鼠成纤维细胞和小鼠均有致病性。经检测,该菌携带7种毒力基因和12种耐药基因,发现其对阿莫西林/克拉维酸、头孢唑林和多粘菌素3种药物有耐药性。全基因组测序结果发现：18FX22的全基因组大小为4 811 079 bp, GC含量为61.33%。COG注释发现18FX22共有3850个基因,具有20类功能。前噬菌体预测结果发现18FX22的基因组中含有2个前噬菌体序列。全球达卡气单胞菌的聚类结果显示该菌与GCA016729585的进化关系更近。结论 本研究从商品虾分离出达卡气单胞菌,发现该菌株的毒性较强,指示应加强海鲜...     

感染多耐药大肠杆菌新噬菌体vB_EcoM_RZ的性质鉴定及基因组学研究

目的：分离鉴定新型毒性噬菌体并研究其生物学特性,为用于治疗临床多耐药菌感染提供备选方案。方法：从南京城区污水中收集废水样本,以临床分离的大肠杆菌多药耐药菌株为宿主,采用双层琼脂法分离纯化新噬菌体,然后采用电镜观察其形态,一步生长曲线确定其潜伏期及爆发量,并通过全基因组测序及质谱分析结合生物信息学分析研究其基因组及编码蛋白。结果：成功分离出一种新型大肠杆菌毒性噬菌体命名为vB_EcoM_RZ,其能感染并裂解多株大肠杆菌临床耐药菌株;生物学性质分析表明该噬菌体裂解速度快、宿主范围广、温度稳定性良好;全基因组测序结果表明vB_EcoM_RZ不编码毒素或其他毒力因子基因,溶源周期相关基因及抗性基因;质谱分析发现vB_EcoM_RZ噬菌体颗粒含有43种已知蛋白和一些未知功能的假定蛋白;系统发育树分析表明vB_EcoM_RZ是一株新型噬菌体。结论：分离并鉴定出一株新型大肠杆菌毒性噬菌体vB_EcoM_RZ,性质优良,有进一步应用于治疗耐药菌引起感染的潜能。     

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药基因及毒力基因分析研究

目的 通过全基因组测序技术（whole genome sequencing,WGS）检测耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia, CRKP）的耐药基因及毒力基因,了解本院CRKP的分布及耐药情况,为临床治疗和预防耐药菌的产生提供理论依据。方法 收集甘肃省肿瘤医院2019年6月至2021年6月临床分离的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌,用全自动细菌鉴定仪进行细菌鉴定和抗菌药物敏感试验,用改良碳青霉烯灭活试验（mCIM）确认所筛选出的菌株是否产碳青霉烯酶,通过全基因组测序分析研究CRKP菌株的耐药基因种类和分布情况以及毒力基因类型和毒力基因位点。结果 23株CRKP分离自4个不同的临床科室,标本主要来源于痰液和血液,药敏结果显示所有菌株对碳青霉烯类、头孢菌素类、青霉素类及含β-内酰胺酶抑制剂类抗菌药物均耐药,对环丙沙星、阿米卡星和复方新诺明部分耐药。基因组测序分析显示：23株CRKP中,17株为ST11型,6株为ST23型。CRKP的荚膜型（KL）均为KL64,一致性均在99.9%以上。23株CRKP均携带bla_KPC-2,此外还有3株菌同时携带bla_NDM-1;还检测出了不同型别的β-内酰胺类（TEM、SHV、CTX-M等）、氨基糖苷类（rmtB）、磷霉素类（fosA）、喹诺酮类（qnr）、四环素（tet）、磺胺类（sul）、甲氧嘧啶（dfrA）等耐药基因;检测出5株耐碳青霉烯高毒力肺炎克雷伯菌,携带耐碳青霉烯酶基因同时携带高毒力质粒及多种亚型;23株CRKP中毒力质粒相关的毒力因子rmpA和rmpA2的携带率分别为21.7%和60.9%。结论 23株 CRKP菌株以重症医学科和呼吸肿瘤内科检出率最高;标本类型以痰液和血液为主,提示呼吸道和血流感染为 CRKP 感染的防控重点;23 株 CRKP 均携带 bla_KPC-2;CRKP 菌株 MLST 分型以 ST11为主,占73.9%;荚膜K抗原类型均为KL64。     

基于全基因组测序的院内耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药性及同源性分析

目的：基于基因组学研究医院内碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的耐药基因分布，毒力情况及同源性分析，深入阐明院内感染的分子机制，为多重耐药菌株临床治疗和预防提供实验室依据。方法：收集1株临床分离的碳青霉烯耐药的泛耐药肺炎克雷伯菌，经培养鉴定，测定对常用抗生素的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），多位点序列分型（multi- locus sequence typing，MLST）进行基因分型并行全基因组测序。根据基因测序结果，选择相关耐药基因在临床收集的另外50 株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌中进行扩增检测，验证其携带情况，对测序结果进行进一步的阐述。结果：药敏结果显示该菌对除粘菌素和替加环素外的抗生素全部耐药，测序结果显示该菌染色体基因序列全长5 468 925 bp，含有4个质粒（179 972 bp、141 377 bp、85 181 bp和20 247 bp），共有5 984个蛋白质编码基因，85个tRNA基因和25 个rRNA 操纵子。此外，该菌携带有大量参与编码多种抗生素的耐药基因。MLST结果显示，该菌基因型为ST11型，该菌大部分序列与之前在四川和杭州报道的菌株类似，最接近的是一株编号SCKP020029（NCBI Accession number：CP029384）的肺炎克雷伯菌。收集的另外50株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌确认均为产超广谱β内酰胺酶（extented-spectrum beta-bactamases，ESBLs），其中97％为ST11型。脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）结果显示分属3个克隆。在这些菌株中，耐药基因检出率分别为KPC-2（98%）， SHV -11（98%），TEM -1（76%），CTX -M（76%），Oqxb1（66%），qnrS（70%），Int1（42%），sul1（82%），sul2（96%），iutA（88%）， iucABCD（10%）和rmpA2（100%）。结论：实验结果揭示了院内碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的基因组学具有高度相似性，流行病学具有聚集性和散发性交叉的特点。抗生素耐药结果提示了细菌耐药中选择性抗生素耐药压力的作用效应，同时质粒耐药基因在细菌中的传播提示这些耐药菌在院内的传播以质粒传播为主，有效的院内感染监测、隔离和控制这类质粒的传播是减少这种细菌耐药感染必不可少的措施。     

一株宋内志贺菌的分离鉴定及基因组分析

目的通过对口岸腹泻样本中分离到的志贺菌鉴定及全基因组的测序和分型研究,对志贺菌从致病性、抗药性及分子分型进行全面分析,建立入境腹泻病原体风险分析流程。方法对细菌的选择性培养基进行初筛后,分离菌株通过全自动微生物鉴定仪及实时荧光PCR的方法进行鉴定。对分离菌株进行全基因组测序、组装、注释、进化分析,通过多位点序列分型(MLST)方法进行分型。结果本次从口岸腹泻样本中成功分离到的志贺菌鉴定为宋内志贺菌,得到全长基因组4 817 693 bp,GC含量51.0%,注释了4 811个编码基因。对基因组分析发现了4种耐药基因及多种志贺毒素基因,进化研究表明该菌株与宋内志贺菌Ss046同源性最高,通过MLST方法分型为ST152克隆群。结论通过对志贺菌分离菌株鉴定及基因组学分析及分型,建立入境志贺菌分型溯源及风险分析流程,为口岸传染病疫情监控提供技术支撑。     

深圳市3例人感染猪链球菌病原学和基因组学分析

目的 对深圳市3例人感染猪链球菌（Streptococcus suis, Ss）分离株进行病原学及基因组学分析,为预防与控制Ss感染疫情提供依据。方法 对3家医院共3名重症患者的3份血平板培养可疑菌株进行生化鉴定、基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱和实时荧光PCR鉴定,获得3株猪链球菌血清2型（Streptococcus suis serotype 2, SS2）阳性菌株。取阳性纯培养物进行药敏试验、提取核酸用于全基因组测序及分析。全基因组序列分析包括物种鉴定、耐药基因比对、多位点序列分型、毒力基因比对和基于coregene的系统进化树分析。结果 3例患者的血平板分离株均鉴定为Ss,VITEK 2生化结果鉴定为SS2,基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱鉴定结果为Ss。Ss通用基因gdh及血清型2型cps2基因实时荧光PCR结果均为阳性。药敏试验结果显示,3株菌均对红霉素、克林霉素耐药,对四环素药敏试验表现出差异。全基因组测序结果发现3株菌物种鉴定均为Ss,包括1株ST7型和2株ST1型。基于VFDB数据库毒力基因预测结果显示,3株菌均为mrp、sly和cps阳性,显示出高毒力株基因特征...     

肠杆菌科细菌mcr-1流行病学研究

目的探讨临床常见肠杆菌科细菌携带质粒介导多黏菌素耐药基因（mcr-1）的情况,为医院感染防控提供依据。方法收集2018年1月至2022年3月浙江省台州医院临床分离得到的菌株共1980株,包括大肠埃希菌1400株,肺炎克雷伯菌580株。采用PCR检测mcr-1基因;利用微量肉汤稀释法和E-test法检测抗生素对mcr-1阳性菌株的最低抑菌浓度;采用接合试验检测mcr-1基因在可转移质粒上的位置;通过提取细菌DNA基因组进行全基因组测序,并对测序结果进行多位点序列分型、质粒Inc分型和耐药基因识别等分析。结果在1400株大肠埃希菌中,共检测出6株携带mcr-1,阳性率为0.43%;580株肺炎克雷伯菌,仅1株检出mcr-1,阳性率为0.17%。其中5株菌株接合试验成功。6株大肠埃希菌的ST型分别是ST648、ST95、ST359、ST602、ST453、ST156,肺炎克雷伯菌是ST25。质粒Inc分型结果显示不同菌株携带相同类型质粒,提示该类质粒可以在菌株间水平传播。耐药基因分析发现7株细菌均携带大量的耐药基因,其中1株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌同时携带mcr-1和碳青霉烯耐药基因。结论mcr-1在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的分离率相对较低,然而考虑到含有mcr-1的质粒在不同细菌之间水平传播的潜力,以及mcr-1与同一质粒内的多个耐药基因整合的能力,在临床环境中要加强对多重耐药菌的管理。     

全基因组测序用于宁夏羊种3型布鲁氏菌毒力基因筛选的研究

目的 从3株布鲁氏菌分离株的全基因组序列中筛选出可能导致脑损害的关键毒力基因,为后续筛选布鲁氏菌致脑损害毒力基因的研究奠定基础.方法 通过BCSP31PCR、传统生化实验对3株分离于布鲁氏菌病患者外周血中的布鲁氏菌进行鉴定分型.利用Illumina Hiseq2000平台对3株布鲁氏菌进行全基因组测序与比较基因组学分析,根据文献报道分析筛选出布鲁氏菌的经典毒力基因,通过检索NCBI核酸数据库查找出所选毒力基因的参考序列,利用所选参考序列分别与3株布鲁氏菌全基因组序列做BLAT比对分析.结果 3株布鲁氏菌经BCSP31PCR、传统生化实验鉴定为羊种3型;比较基因组分析显示3株布鲁氏菌与标准株参考序列的同源性比例均达到99.02％.BLAT比对分析发现所选毒力基因wbkA、pgm、hemolysin、hemolysin Ⅲ和Omp25在这3株布鲁氏菌全基因组序列中的比对分数均达到99％以上.结论 本研究所选取的3株羊种3型布鲁氏菌的全基因组中存在经典的毒力基因序列.     

基于高通量测序的多重耐药大肠埃希菌HX43耐药分子机制分析

目的通过高通量测序法对多重耐药大肠埃希菌HX43进行耐药分子机制的研究。方法用Illumina Miseq平台对HX43进行高通量测序,用Edena、RAST、Res Finder、MLST和BLAST等生物信息学工具或数据库进行数据分析,获得耐药基因相关序列数据。结果 HX43对多种临床常用抗生素均不敏感,仅对碳氢霉烯类药物敏感。对高通量测序数据的分析研究发现,该菌存在多种耐药基因,包括β-内酰胺类耐药基因3个(blaCMY-42、blaCTX-M-14和blaOXA-30),氨基糖苷类耐药基因5个(aac(3)-IIa、aad A5、strA、str B和aac(6')-Ib-cr),喹诺酮类耐药基因1个(aac(6')-Ib-cr),磺胺及甲氧苄啶类耐药基因3个(sul1、sul2和dfrA17),四环素耐药基因1个(tet(B)),氯霉素耐药基因2个(cat B3和cml A1),大环内酯类耐药基因2个(erm(B)和mph(A))。对包含blaCMY-42的contigs进行分析,发现该基因与ISEcp1插入序列、blc和sug E等基因相关联。质粒分型发现HX43携带5种不相容群的质粒。多位点序列分型(MLST)分析发现HX43属于ST3835,为国内外较少见的序列型。结论高通量测序技术可准确获得临床菌株抗生素耐药的相关基因信息,为临床抗菌治疗提供重要的实验室数据支持。     

痤疮感染金黄色葡萄球菌分子分型及毒力特征

目的：了解痤疮感染金黄色葡萄球菌的分子类型、毒力及耐药特征,为防治金葡菌感染提供依据。方法收集门诊分离自痤疮患者的31株金葡菌菌株,采用PCR方法鉴定MRSA菌,利用spa、SCCmec、MLST等分型方法对MRSA菌进行分子分型,检测pvl等17种毒力基因,同时测定所有细菌对苯唑西林等17种药物的敏感性,分析金葡菌分型特征、毒力特征及耐药情况。结果31例金葡菌中有17株为MRSA菌,所有MRSA菌株可分为3种SCCmec型,4种spa型,3种ST型。14株MSSA菌可分为5种ST型和spa型。所有金葡菌均携带有多种毒力基因,溶血素基因及seg基因携带率最高。结论分离自痤疮金葡菌均携带有多种毒力基因,主要的感染克隆为MRSA-ST239-Ⅲ以及MSSA-ST121,对多种抗生素耐药。