优化流式细胞术测定保存血小板CD62p表达

CD62p阳性率是保存血小板质量监测的重要指标之一。为在静脉全血内血小板CD62p测定方法的基础上优化建立流式细胞术(FCM)测定保存血小板表达CD62p的方法，在血小板检测标本内加入0．1mmol/L潘生丁稳定血小板；对TBS溶液进行了改良，添加了1．1mmol/L的EDTA和100μmol/L潘生丁，用以代替PBS；采用新鲜富含血小板血浆(FPRP)制备的阴、阳性对照；进行方法学评价。结果表明：加入0．1mmol/L潘生丁和1．1mmol/L的EDTA可以有效防止实验过程中的血小板人为激活；采用新鲜富含血小板血浆(FPRP)制备的阴、阳性对照既可优化FCM分析方法，还可用于检验所购荧光抗体的质量，保证实验结果的有效性。采用泛血小板特异性标志物CD61可灵敏特异地识别血小板，提高了实验抗干扰能力。制备保存血小板时采用的是专用大号采血针，抽血流畅，对血小板CD62p表达测定人为影响很小，明显优于用注射器采集患静脉全血的做法。CD62p测定灵敏度可达1％，制备的标本可稳定48小时。结论：利用该流式细胞术可以灵敏而特异地测定保存血小板的CD62P表达率；该方法简便易行，提高了结果的准确性，具有良好的稳定性和重复性。     

改良血小板添加液低温液态保存血小板的形态及功能研究

本研究探讨使用改良的血小板添加液替代70％自体血浆在低温（10℃）液态条件下对血小板的保存效果。采集6名供者单采血小板,每一名供者单采血小板平均分为3组,A组（常规保存组）加入100％血浆、22℃保存：B组（添加液10℃保存组）加入70％PAS—ⅢM／30％血浆、10℃保存;C组（冰冻保存组）加入100％血浆和海藻糖、-85℃保存;另设D组（血浆4℃保存组）加入100％血浆、4℃保存,作为扫描电子显微镜对照组。A、B组在第1、5、7、9天取样,C组在20天后复苏取样,分别检测CD62p、HSR、PAgT、LDH的变化。血浆常温组、添加液低温组于保存后第3、9天取样扫描电镜观察,血浆低温组于保存后第3天取样观察．冰冻组在20天后复苏取样观察,同时使用新鲜血小板作为对照。结果表明,保存期内随保存时间延长,A组和B组CD62p表达增加,HSR和最大聚集率降低;A组的LDH释放、CD62p表达、HSR、血小板最大聚集率与B组比较有显著统计学差异（P〈0．05）。C组LDH释放明显较其他两组增多,但CD62p表达较少（P〈0．05）。A、B组血小板形态保持较好,C组血小板形态保持差。结论：改良的PAS—ⅢM保存液能够替代血浆用于血小板的保存,在低温条件下能够很好地保护血小板的功能,保存效果优于血浆常温保存。     

深低温保存新鲜富含血小板血浆质量分析

为了评价批量制备的深低温保存富含血小板血浆(cryo-FPRP)的效率和效果,在优化建立的无偿献血者血小板的批量分离和制备cryo-FPRP过程中测定了ACD抗凝的200ml全血、FPRP、含5%DMSO的FPRP(DM-SO-PRP)和-80℃冰箱然冰冻保存后复温的FPRP(Cryo-FPRP)的血小板计数(Plt)、血小板平均体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血浆内pH、血浆乳酸(LA)浓度和乳酸脱氢酶(LDH)浓度、细菌培养、血小板CD62p阳性率、PAC-1阳性率及抗GPIb-Ⅸ-Ⅴ荧光强度,也测定了FPRP和cryo-FPRP的促凝血活性.结果表明①血小板的总平均得率为70%;FPRP中残余的红细胞≤1×109/袋;白细胞≤1×107/袋.②血浆pH、LA浓度和PAC-1阳性率在整个制备和保存过程中没有明显变化.③血浆内LDH、血小板CD62p阳性率和血小板抗GPIb-Ⅸ-Ⅴ荧光强度在血小板冰冻保存后出现明显升高.④与FPRP比较,cryo-FPRP诱导的血浆凝固时间明显缩短.结论①本研究选择的离心分离制备FPRP条件可高效分离无偿献血者的血小板,同时不会导致血小板激活率增加.②深低温保存无偿献血者的新鲜富含血小板血浆可有效防止代谢产物的积累和pH下降,并且可以高效预防血小板GPⅡb/Ⅲa的激活.③冰冻保存后部分血小板胞膜受到明显损害.④血小板胞膜表面GpIb-Ⅸ-Ⅴ复合物的数量增加,促凝血活性明显增强.     

-80℃长期保存血小板的可行性研究

目的探索-80℃条件长期保存血小板的关键技术。方法将12人份加终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO)的富含血小板血浆,分为若干等份后置于实验专用-80℃低温冰箱中保存1—16个月,1—6个月每月每人份各取1份样本、8—16个月每2个月每人份各取1份样本37℃水浴复温后检测:血小板计数(P lt)、血小板平均体积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)、pH、血小板CD62p表达、凝血酶激活CD62p表达、凝血酶激活CD62p再表达、磷脂酰丝氨酸(PS)表达和激活血小板诱导血浆凝固时间。结果在16个月的保存过程中P l、tMPV、PDW、pH、血小板CD62p表达、凝血酶激活CD62p表达、凝血酶激活CD62p再表达、PS表达和激活血小板诱导血浆凝固时间等,变化均无统计学意义(P>0.05)。结论血小板加终浓度为5%DMSO,在-80℃条件下长期保存质量较好且较稳定,此技术条件可用于长期储备血小板资源。     

白膜法汇集浓缩血小板的研究进展

手工分离制备浓缩血小板有富含血小板血浆法（PRP法）和白膜法（BC法）2种。BC法制备的血小板被欧洲许多国家广泛应用，其优点在于：白细胞含量少、血小板膜表面CD62p的表达率及糖分解率显著降低、pH保持恒定等。目前，白膜法汇集浓缩血小板的辐照、过滤、洗涤、病毒灭活、冰冻保存已成为输血界研究的焦点。血小板膜微粒衍生物的制备研究也已初见成效。     

血小板冰冻后功能变化及临床应用研究

目的 探讨血小板冰冻后功能变化及临床应用,并试图探讨血细胞冰冻的个体化依据.方法 将不同浓度的二甲基亚砜(DMSO)作为保护剂加入血小板中,在--80℃条件下冰冻,观察冰冻前后凝血及收缩块形成过程,检测冰冻前后及不同离心条件下血小板计数、血浆中血小板第3因子(PF3)、第4因子(PF4)、血小板体积分布宽度(PDW)及P-选择素(CD62P)对血小板的聚集、黏附、血块收缩功能的影响.对质控条件合格的冰冻血小板单独或合并新鲜血小板的临床应用进行回顾性分析.结果 血小板阻断后血液不凝集;5 ％DMSO与2％DMSO做保护剂冰冻血小板的血浆凝固时间、血块收缩时间及血块收缩功能(血浆析出率)的差异均无统计学意义(P＞0.05),但1％DMSO做保护剂的冰冻血小板的上述各项指标与5％DMSO做保护剂的血小板的差异均有统计学意义(P＜0.05);各样本随着离心次数的增多,所取上清血浆中血小板计数越低,但血浆凝固时间也越短,血块凝固效果越差,离心1次和离心2次后上清血浆的凝固时间、凝固效果的差异均有统计学意义(P＜0.05),1％ DMSO做保护剂的冰冻血小板的上述各项指标与5％DMSO做保护剂的血小板的差异也有统计学意义(P＜0.05);1％DMSO做保护剂的冰冻血小板无凝块形成,将其离心并用新鲜血浆代替上清液后,血块收缩现象又重新出现.2％ DMSO做保护剂与5％DMSO做保护剂的样本中血小板计数、PDW、血浆中PF3、PF4及CD62P等各项指标的差异有统计学意义(P＜0.05).冰冻血小板和新鲜血小板搭配应用与单独新鲜血小板临床效果的差异有统计学意义(P＜0.05).结论 血小板冰冻后血浆凝固时间明显缩短,且与血小板破坏程度有关,血小板破坏越严重,血浆凝固时间越短;但血块收缩时间明显延长,血小板破坏程度越严重,血块收缩时间越长;血块的凝固质量随着血小板的破坏增加而变差;血小板破坏后释放出的PF3、PF4、CD62P对血小板功能有促进凝集和抑制收缩两方面的影响.冰冻血小板和新鲜血小板搭配应用效果较好;可用低浓度2％ DMSO进行冻存.     

二甲亚砜对血小板冻存中功能保护作用的实验研究

本研究探讨二甲亚砜（DMSO）对血小板冻干保存中激活的抑制作用。以CD62p和PAC-1表达作为血小板的激活标志，CD62p和PAC-1再表达和血小板最大聚集率作为评价血小板功能的指标。对血小板经离心、洗涤及海藻糖负载等顸处理过程中加与不加DMSO的实验组，分别进行血小板膜表面糖蛋白CD62p和PAC-1表达及再表达的流式细胞术（FCMs）分析，血小板最大聚集率和血小板平均体积（MPV）的测定，研究DMSO对血小板激活抑制作用的可逆性。结果显示，血小板经预处理后，不含DMSO组的CD62p和PAC-1表达率显著增高，分别达30．37％和15．01％；含DMSO的组，CD62p表达率为10．72％，PAC．1几乎不表达（0．11％），显著低于不含DMSO组（P〈0．01）。DMSO稀释后，血小板CD62p再表达为54．39％，显著低于对照组（71．69％）和高于不含DMSO组（35．98％）（P均〈0．01）；PAC-1再表达率为49．28％，与对照组（54．48％）无显著差异，显著高于不含DMSO组（P〈0．叭）。在含DMSO组，血小板用原血浆稀释后，血小板聚集功能恢复，对restocetin，thrombin和propylgallate诱导的血小板聚集率分别为92．76％，91．24％和89．66％，与对照组和无DMSO组比无显著性差异，对ADP诱导的聚集率有34．33％，显著高于无DMSO组（P〈0．01），但仍显著低于对照组（P〈0．01）。结论：DMSO对体外处理所致的血小板膜表面CD62p和PAC-1表达具有抑制作用，且该抑制作用是可逆的，DMSO稀释后血小板仍具有CD62p和PAC．1表达能力和聚集反应功能，提示DMSO具有抑制激活损伤和低温保护的双重功能，这一生物学特性使DMSO在血小板的冻干保存中发挥重要作用。     

L-精氨酸对液体保存血小板的保护作用研究

目的研究在血小板4℃液体低温保存体系中添加L-精氨酸对血小板保存效果的影响。方法制备新鲜富含血小板血浆(PRP)5份,每份PRP分为7份平行样品。一份为对照组22℃保存,另一份为4℃保存,其余5份加入不同浓度L-精氨酸溶液,保存第1天到第5天检测血小板膜CD62P表达率的变化,CD62P表达率最低的L-精氨酸浓度为最佳介入浓度。所有数据经配对资料采用t检验分析。结果血小板4℃保存并加入L-精氨酸4mmol/L时每天CD62P表达率与对照组比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论血小板4℃液体低温保存时L-精氨酸的最佳介入终浓度为4mmol/L,在这一浓度下L-精氨酸能有效抑制血小板膜CD62P表达,提高血小板的保存质量。     

低浓度二甲基亚砜冰冻血小板的个性化研究

目的 探讨血小板(PLT)冰冻保存时保护剂二甲基亚砜(DMSO)的最佳浓度.方法 计算机随机选择2009年6月至2011年9月本血站机采室采集的120袋PLT作为研究对象.将不同质量浓度的DMSO作为保护剂加入PLT中,在-80℃条件下进行冰冻保存.检测冰冻前、后及不同离心条件下PLT计数、血浆中PLT第3因子(PF3)、PLT第4因子(PF4)、PLT体积分布宽度(PDW)及P-选择素(CD62P)的含量,并分析PLT的聚集、黏附、血块收缩功能的变化情况.结果 质量浓度为2％与5％的DMSO作为保护剂时,对冰冻PLT的各项功能指标影响不大,差异无统计学意义(P＞0.05).但1％的DMSO作为保护剂时,对PLT的各项功能指标影响较大.结论 PLT为无核细胞,结构简单,可用2％的DMSO作为保护剂进行冷冻保存.     

DMSO在人血小板冻干前负载海藻糖过程中对血小板的保护作用

目的研究人血小板冻干保存前负载海藻糖至细胞内过程中DMSO的作用,优化血小板负载缓冲液配方。方法实验设对照组(负载缓冲液中未添加DMSO)和实验组(负载缓冲液中添加DMSO),使用流式细胞仪检测血小板负载海藻糖4h后膜表面糖蛋白分子CD62p、PAC-1的表达,通过激光共聚焦荧光显微镜观察血小板负载荧光物质LYCH4h后其胞内LYCH的分布,同时检测实验组和对照组负载海藻糖4h后血小板平均体积(MPV)。结果两组结果比较,实验组CD62p、PAC-1的表达显著低于对照组(P<0.05),实验组LYCH均匀分布在血小板胞质中,而对照组LYCH大部分分布在几个有限细胞器内,两组MPV未有显著性差别(P>0.05)。结论DMSO在血小板负载海藻糖过程中可有效抑制血小板体外激活,并使胞质内海藻糖均匀分布,更好发挥海藻糖对细胞的保护作用。     

血小板保存3天后再冷冻保存的实验研究及临床应用

本研究探讨血小板常温保存3天后再进行-80℃冰箱内冷冻保存及临床应用的可行性。对当天冷冻和保存3天后再冷冻血小板进行了计数，并检测聚集力、黏附力以及CD62p的表达，并通过可对比性病例观察保存3天后再冷冻与当天冷冻血小板，临床应用的可能性。结果表明：在保存期3天之内血小板数量、低渗性休克反应、黏附功能无显著差异性改变（P〉0．05），但聚集功能和CD62p的表达率的变化有显著性差异（P〈0．05）。当天保存并冷冻的血小板与保存3天后再冷冻的血小板各项指标的变化都无显著性差异。CD62p的再表达率（CD62p凝血酶激活后阳性率-CD62p激活前的阳性率）也无显著性差异，分别是51．1±4．5和51．1±4．4（P〉0．05）。临床应用当天冷冻和保存3天后再冷冻血小板的CCI值分别是48％和49％，无显著性差异（P〉0．05）。结论：血小板保存3天后可以再-80℃冷冻保存，其临床应用效果与当天冷冻血小板比较后无明显差异。     

丁胺卡那霉素对EDTA依赖性凝集血小板的解离及其机制

目的研究丁胺卡那霉素对EDTA抗凝剂依赖的聚集血小板的解离作用和机制,为血常规标本中血小板凝聚提供可靠的解决方法。方法在EDTA依赖的假性血小板减少症(PTCP)患者的EDTA-K2抗凝血样本中,于不同时间段加入不同浓度丁胺卡那霉素进行凝集血小板的解离试验,通过血小板计数和涂片观察解离效果;用流式细胞仪检测血小板膜表面CD41、CD61、CD62p、PAC-1和IgG的表达百分率。结果抽血后1h内加入丁胺卡那霉素对血小板凝集的解离作用明显,血小板计数可恢复到即时检测的水平,血小板CD62p、PAC-1和IgG的表达量被显著抑制,而CD41和CD61未受明显影响。结论PTCP患者血常规样品抽血后1h内加入丁胺卡那霉素能有效解离凝集的血小板,作用机制可能与抑制患者血小板膜表面CD62p、PAC-1和IgG的表达有关;此法有助于解决EDTA所致的血小板计数的假性减少。     

糖基化修饰血小板冷藏稳定性研究

本研究旨在观察尿苷二磷酸半乳糖（UDP-6ai）糖基化修饰人血小板的稳定性、理化指标及体外功能变化。实验分为室温对照组、冷藏对照组以及修饰组（U＋4组和4＋U组）。机采人浓缩血小板悬液，4℃保存前或后添加适量UDP—Gal，进行糖基化修饰，分别于0、1、3、5、7、14天，通过荧光标记识别血小板膜糖蛋白末端半乳糖残基的凝集素（FITC—RCAⅠ）检测糖基化修饰效果；pH计检测血小板悬液pH值；血细胞计数仪检测血小板平均体积；比浊法测定血小板聚集率；流式细胞术检测血小板活化标志CD62P、血小板膜蛋白CD42b及Ps的表达。结果表明：保存14天时，修饰组血小板RCAⅠ结合率是室温组的5—6倍；修饰组血小板悬液pH低于室温组，但二者之间无显著性差异（P〉0．05）；保存14天时室温组和修饰组血小板平均体积分别为10．6±1．9fL和11．14±1．1fL，二者之间无显著性差异（p〉0．05）；各组体外聚集活性在保存过程中均逐渐下降，但修饰组优于室温组（p〈0．05）；流式检测结果显示，保存1—5天修饰组CD62P、CD42b和Ps表达的阳性率与新鲜血小板无显著性差异（P〉0．05），但保存14天时，CD62P和Ps表达的阳性率升高，CD42b表达的阳性率降低，与新鲜血小板相比差异极显著（p〈0．01）。结论：在修饰血小板保存过程中，糖基化修饰的效果稳定，修饰血小板的pH和平均体积均处于正常值范围之内，聚集活性良好，优于室温保存组，但在保存5天后表现出不同程度的活化。     

人血小板表面CD36糖蛋白检测方法的建立及初步应用

个体血小板表面CD36抗原缺乏在随机输注时有产生抗-CD36免疫反应的风险,是血小板输注无效的原因之一。本研究应用流式细胞术检测杭州地区单采血小板供者的血小板表面CD36抗原表达情况,并分析个体血小板上CD36缺失表型的频率。留取献血者新鲜抗凝血样,经离心获取富血小板血浆,洗涤并调整血小板计数至1×106。采用CD36-FITC、CD41-PE单克隆抗体和血小板孵育反应,然后用流式细胞仪检测和分析血小板表面糖蛋白CD36抗原表达情况。对于血小板表面CD36抗原阴性的标本,进一步筛查其单核细胞表面CD36的表达情况。结果表明:192例无偿献血者筛查出7例血小板表面CD36抗原阴性,CD36缺失型频率为3.6%,均为Ⅱ型缺失。人群中个体CD36抗原表达强度存在差异,参照CD36几何平均荧光强度数值大小,59例为低表达,126例为高表达。结论:人群中存在CD36Ⅱ型缺失表型,这些数据将为研究CD36抗原分布提供参考,有助于解决血小板输注无效问题。     

Preanalytical requirements for flow cytometric evaluation of platelet activation: choice of anticoagulant

Accurate assessment of in vivo or in vitro platelet activation requires optimal preanalytical conditions to prevent artefactual in vitro activation of the platelets. The choice of anticoagulant is one of the critical preanalytical conditions as anticoagulants exert different effects on the activation of platelets ex vivo. We tested the effectiveness of Diatube-H (also known as CTAD; sodium citrate, theophylline, adenosine and dipyridamole) and citrate vacutainer tubes in preventing artefactual activation of platelets and preserving functional reserve. Platelet surface expression of the CD62P (reflecting alpha granule release), CD63 (reflecting lysosomal release) and modulation of normal platelet membrane glycoproteins CD41a and CD42b, were measured in whole blood and in isolated platelets immediately after collection and at 6, 24 and 48 h after venipuncture. Samples taken into Diatube-H showed less spontaneous platelet activation than did those taken into citrate. To measure in vitro platelet functional reserve, thrombin was added as agonist to blood stored for varying periods up to 48 h. Although Diatube-H suppressed in vitro platelet activation for up to 4 h, in samples kept for 6-24 h before thrombin addition, the inhibitory effect was lost and platelets responded fully to agonist activation. Hence, Diatube-H preserved platelets and allowed for measurement of in vivo platelet activation as well as thrombin-induced in vitro platelet activation after 6-24 h, in both whole blood and isolated platelets.     

流式细胞术联合测定保存血小板表达的磷脂酰丝氨酸和CD62p

人类血小板通过不同的技术进行离体保存后，其特性改变差异较大。建立适用于各种保存血小板特性分析的流式细胞术（FCM）对保存血小板的质量监测和新保存方法研究有重要意义。本研究通过对FCM分析方法主要条件的优化评估，建立了联合测定血小板膜表面包括磷脂酰丝氨酸在内的多参数FCM定量分析方法。在标本制作中，血小板不需要洗涤即可直接进行标记，减少了血小板离心洗涤过程中的激活。除了FCM常用的同型对照外，中还将新鲜富含血小板血浆（FPRP）、凝血酶激活FPRP和液氮处理FPRP作为血小板标准阴性、阳性对照，直接应用于FCM分析，且效果良好。该方法中Gly-Pro-Arg-Pro乙酸盐（GPRP）的选择应用，既防上了血小板聚集和纤维蛋白的形成，同时可稳定血小板，减少制备过程中人为激活，克服了在血小板、Ca^2 和血浆共存条件下FCM定量分析血小板的困难，尤其是为深低温处理血小板包括PS在内的多参数分析提供了良好的方法基础。研究表明该方法标本处理简单，结果分析简便、准确，重复性好。作还通过低温、低渗或激活剂的方法制备了几种膜表面分子标记显不同的血小板应用于FCM分析，不仅证实了所建立的FCM分析方法在各种不同膜表面分子标记的血小板分析中的实用性，又表明了中制备的4种不同膜表面分子标记的血小板在FCM分析保存血小板方法学中的实用价值。     

预冻技术参数对血小板冻干保存的影响

本研究采用正交设计方案探讨冻结速率、退火速率、退火温度和退火持续时间4个预冻条件参数对血小板冻干保存的影响．冻干血小板再水化后的数值恢复率、细胞形态和结构、血小板活化和聚集力等指标分别用血细胞计数计、扫描电子显微镜、3色流式细胞仪及对凝血酶的聚集反应进行检测并综合评价．结果显示：在不同的预冻条件组合方式下，冻干血小板的数值恢复率在（91．3％-53．5）％范围内；实验各组血小板冻干制品的冰晶大小和形状有所不同；冻干再水化血小板的活化标记物PAC-1和CD62p的表达和分布与新鲜血小板较为接近，其中PAC-1表达率均维持在较低水平（0．03％-0．22％），而各组样本CD62p的表达水平存在差异．实验中根据血小板数值恢复率得到预冻条件的最佳理论组合是A2B1C1D3，即将血小板悬液先以20℃／min的速率冻结至-40℃维持2小时。再以1．5℃／min对搁板升温至-30℃后维持0．5小时，最后进入冻干程序直至结束。结论：冻结速率、退火速率、退火温度和退火持续时间对冻千血小板的数值恢复率均有作用，预冻条件参数的不同组合方式影响血小板冻干保存效果．     

Usefulness of delta value of platelet parameters on ADVIA 120 for the functional reactivity of stored platelets

An agonist‐induced expression of CD62P by flow cytometry analysis for evaluating platelet functional reactivity has some disadvantages. We investigated the usefulness of platelet parameters by ADVIA 120 to predict an agonist‐induced expression of CD62P in stored platelets. The CD62P expression by flow cytometry and the platelet parameters by ADVIA 120 were studied in samples from 27 platelet pheresis products. Delta (Δ) values were calculated as the degree of change of the platelet parameters studied with or without adenosine 5′‐diphosphate sodium (ADP) stimulation. The CD62P expression of the ADP‐activated platelets were correlated with the Δplatelet count (r=0.517) in the short‐term storage group (within 10 hr from preparation), with the platelet component distribution width (PCDW) without ADP (r=?0.744) and the ΔPCDW (r=?0.755) in the long‐term storage group (after 10 hr from preparation). Therefore, the delta values of platelet parameters on ADVIA 120 analysis in platelets between with and without ADP stimulation could be useful as a simple predictor for the functional reactivity of stored platelets. J. Clin. Lab. Anal. 24:38–43, 2010. © 2010 Wiley‐Liss, Inc.