MicroRNA-A6增效的HEV体外瞬时转染HepG2复制体系的建立及鉴定

目的验证HEV编码的MicroRNA-A6对全长HEV瞬转HepG2细胞系中病毒复制的增效作用。方法按照已报道序列合成miR-A6,利用重组PCR、基因克隆以及体外转录技术获得单一高浓度的HEV RNA。HEV RNA与miR-A6按比例采用脉冲电流转染HepG2细胞,转染后24、48和96 h后观察细胞上清IgG分泌和HEV RNA表达载量,与不加miR-A6的HepG2细胞进行比较,分析miR-A6对HEV复制的作用,然后加入anti-A6抑制miR-A6表达,分析其对HEV表达和复制的影响。结果 MiR-A6∶HEV RNA质量比为0.5∶1和1∶1,共转染HepG2细胞后48 h,与单转染HEV RNA相比,lg值升高了1.57和2.44。HEV-IgG先于HEV RNA表达。体外实验显示,Ⅰ型和Ⅳ型HEV复制力没有明显差别,都在转染后48 h达到峰值,加入anti-A6抑制miR-A6后HEV-IgG抑制47.12%,HEV RNA抑制43.3%。结论 MiR-A6可以在体外显著增加HEV RNA瞬转HepG2细胞系中HEV病毒的复制力,为后续HEV分子病毒学和表型耐药研究奠定基础。     

戊型肝炎病毒ORF3和标签His融合真核表达载体的构建与表达

目的体外构建HEV ORF3蛋白融合His标签的真核表达载体及其初步鉴定和蛋白表达。方法从1例男性31岁戊型肝炎患者血清中分离HEV RNA,逆转录合成cDNA,特异性引物扩增HEV ORF3片段,将其定向连接到pcDNA3.1(-）-His真核表达载体中,经抗生素筛选后,酶切及测序鉴定其序列正确性。采用提取质粒转染HepG2细胞,培养96 h后裂解细胞,采用抗His-Tag抗体进行Western blot检测目的蛋白。结果从戊型肝炎患者血清中成功分离出I型HEV RNA,经抗生素筛选、酶切鉴定和测序确认pcDNA3.1(-）-HEF3-His真核表达载体构建成功,转染HepG2细胞,经Western blot检测显示15 kDa位置有明显融合蛋白条带。结论成功构建了HEV ORF3与His标签融合的真核表达载体,体外转染HepG2细胞后鉴定其工作良好,为后续HEV ORF3蛋白的研究奠定了基础。     

一例丁型肝炎患者体内HDV全基因克隆及分析

目的通过逆转录PCR方法从HDV RNA阳性患者血液中扩增HDV全长基因组。方法从血液中提取病毒RNA,利用HDV序列中较保守的序列设计引物分别扩增得到两个相互交叉的HDV cDNA片段,然后再通过SalⅠ单酶切位点将两个cDNA片段连接成单位长度的HDV cDNA。经过测序、对比分析得到全部HDV基因组序列,并与其他HDV序列进行同源性比对。结果 HDV基因组全长1 677 bp。与基因型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的序列同源性分别为86%~98%、80%~81%和89%。结论利用RT-PCR的方法可以成功克隆出HDV cDNA序列,通过序列比对可以发现本实验样本为Ⅰ型HDV感染。     

粉尘螨Ⅰ类变应原的cDNA克隆测序及亚克隆

目的　获得粉尘螨I类变应原(Derf1)cDNA克隆及亚克隆,并进行测序。　方法　设计合成引物,从粉尘螨体内提取RNA,经逆转录聚合酶链反应(RTPCR)获得cDNA,PCR扩增目的片段经纯化回收后克隆至pMD18T,转化大肠埃希菌(E.coli)JM109,经PCR初筛挑选阳性克隆并测序,将PCR筛检阳性重组子及pET32a(+)表达载体分别用BamHⅠ和SacⅠ双酶切,连接转化至E.coli感受态细胞JM10 9中过夜培养,挑选菌落进行酶切鉴定。　结果　从粉尘螨基因组RNA中扩增出Derf1基因,获得pET32a(+)Derf1亚克隆,酶切产物的大小与预期相符。　结论　对粉尘螨Derf1基因进行体外扩增并获得pET32a(+)Derf1亚克隆。     

肠道病毒71型(EV71)感染性克隆的构建

目的构建肠道病毒71(enterovrius 71,EV71)的感染性克隆,为研究EV71毒力基因及新型疫苗设计等建立一个技术平台。方法用RT-PCR方法扩增出EV71FJ08149株全基因组,通过TA克隆组装进TOPO-XL-PCR载体中,获得全长cDNA克隆pFJ08149T5和pFJ08149T25。应用T7聚合酶系统在体外将线性化后全长cDNA克隆转录出RNA并转染RD细胞。通过间接免疫荧光试验、RT-PCR、序列测定及免疫电镜等对拯救病毒进行鉴定。结果 RNA转染后72h观察到典型的肠道病毒致细胞病变,拯救病毒经RT-PCR、间接免疫荧光和免疫电镜检测鉴定为EV71型,表明已成功构建了EV71感染性克隆。结论本研究成功构建出具有感染性的EV71全长cDNA克隆,为深入研究EV71的致病机制等提供了有利的工具。     

HBx基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建重组HBx蛋白的真核表达载体pIRES2-AcGFP-HBx.方法 设计合成HBx基因的特异性PCR引物.PCR扩增获得HBx基因序列;将HBx基因序列克隆人T载体(pGEM-T-HBx);再用限制性内切酶BglⅡ和EcoR Ⅰ双酶切下目的片段,将其亚克隆人真核表达载体pIRES2-AcGFP;双酶切(Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ)和序列测定鉴定重组子;脂质体包裹pIRES2-AcGFP-HBx转染入HepG2细胞,G418筛选得到稳定表达HBx的细胞克隆,Western blot检测HBx蛋白在转染细胞中的表达情况.结果 PCR扩增获得全长HBx基因序列;双酶切筛选得到阳性重组子,测序分析证实插入序列正确;转染plRES2-AcGFP-HBx的HepG2细胞,荧光显微镜可观察到GFP的表达,Western blot 证实表达HBx蛋白.结论 成功构建重组HBx基因真核表达载体,获得稳定表达HBx蛋白的HepG2细胞株,为深入研究HBx蛋白的生物学功能提供实验条件.     

GDNF基因克隆及表达载体的构建

目的:克隆大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)全长基因,构建真核细胞表达质粒。方法:从孕17 d大鼠胚胎脑组织中提取RNA,参照《分子克隆实验指南》,合成cDNA第一、二链,加入引物PCR扩增目的基因,与pcDNA3质粒连接,构建表达质粒。结果:提取的总RNA经纯化后电泳出现18 S和28 S 2个条带,PCR扩增目的基因为630 bp的条带,测序结果为633 bp。结论:正确地克隆了大鼠GDNF基因全序列,为进一步获得重组活性的GDNF蛋白奠定基础。     

中华按蚊防御素基因 cDNA序列和基因组序列的克隆及鉴定

目的 克隆中华按蚊防御素基因全长cDNA序列及基因组序列,并对其进行鉴定和生物信息学分析。方法 根据已发表的埃及伊蚊和冈比亚按蚊等的防御素基因序列设计引物,提取中华按蚊总RNA并构建其基因组文库,分别进行多轮RT-PCR和巢式PCR扩增,将所得片段进行克隆、测序,并应用相关生物信息学软件对序列进行鉴定和分析。结果 从中华按蚊基因组文库中扩增出完整的防御素基因组序列(由两个外显子和一个内含子组成)以及5′端和3′端的非编码序列(UTR)片段,总长度为2 256 bp;从中华按蚊总RNA中扩增出大小为324 bp的cDNA片段,经测序证实为中华按蚊防御素基因全长cDNA序列,其开放阅读框共编码107个氨基酸,成熟肽部分具有40个氨基酸残基。结论 首次克隆出中华按蚊防御素基因全长cDNA序列及基因组序列,为进一步的功能研究奠定了基础。     

阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因的克隆和序列分析

目的　构建阴道毛滴虫铁氧还蛋白 (ferredoxin ,Fd)基因重组质粒 ,并进行克隆及序列分析。　方法　根据Fd基因已知序列 ,设计合成 1对引物 ,应用螯合树脂 (Chelex-100 )提取基因组DNA ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增出Fd基因 ,克隆入pMD-18T载体 ,转化大肠埃希菌JM109感受态细胞 ,经PCR及酶切鉴定、测序。　结果　Fd基因体外扩增产物长度为 306 bp ,重组质粒经PCR及酶切鉴定结果表明获得正确重组子 ,测序结果表明其片段与已知序列吻合。　结论　克隆出阴道毛滴虫Fd基因。     

登革病毒(NGC株)C与prM全长基因的扩增与克隆

目的　从登革病毒 (NGC株 )中快速分离基因组RNA ,RT -PCR扩增及克隆C和 prM全长基因 ,从而为研究蚊虫细胞对登革病毒的细胞内免疫研究奠定基础。方法　以Trizol试剂从C6 / 36细胞培养上清中提取基因组RNA ,RT -PCR扩增全长C和 prM基因 ,T -A重组入pGEM -T载体 ,重组质粒的双酶切、PCR与测序鉴定。 结果与结论　应用Trizol试剂从蚊细胞培养液上清中快速分离到高纯度和完整登革病毒RNA基因组 ,成功扩增与克隆出全长登革病毒C和 prM基因     

GDNF基因克隆及表达载体的构建

目的：克隆大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)全长基因，构建真核细胞表达质粒。方法：从孕17d大鼠胚胎脑组织中提取RNA，参照《分子克隆实验指南》，合成cDNA第一、二链，加入引物PCR扩增目的基因，与pcDNA3质粒连接，构建表达质粒。结果：提取的总RNA经纯化后电泳出现18S和28S2个条带，PCR扩增目的基因为630bp的条带，测序结果为633bp。结论：正确地克隆了大鼠GDNF基因全序列，为进一步获得重组活性的GDNF蛋白奠定基础。     

HEV ORF3真核表达载体的构建

目的 构建戊型肝炎病毒（HEV） ORF3真核表达载体pcHEV3并进行初步鉴定.方法 从实验感染HEV新疆株的猕猴胆汁中提取HEV RNA,逆转录法合成HEV cDNA,采用RT-PCR方法扩增HEV ORF3 cDNA片段,将其克隆至载体质粒pcDNA3,构建HEV ORF3真核表达载体,经抗生素初步筛选后,重组阳性载体进行酶切和测序鉴定.结果 从实验感染HEV新疆株的猕猴胆汁中克隆出HEV ORF3全长cDNA片段,经酶切鉴定及DNA测序鉴定,成功构建HEV ORF3蛋白真核表达载体pcHEV3.结论 成功构建HEV ORF3蛋白真核表达载体,为进一步研究HEV ORF3蛋白的功能提供了条件.     

狂犬病毒载体的构建与鉴定

目的构建狂犬病毒载体,为新型疫苗研究提供依据。方法将狂犬病毒减毒株SAE基因组分段扩增,然后经逐步拼接得到全基因组克隆,并在其中引入转录终止-起始元件和多克隆位点获得重组质粒pSAETOPO。将绿色荧光蛋白(EGFP)基因和西尼罗病毒prME基因分别克隆至pSAETOPO,然后将带有这两个基因的狂犬病毒全长cDNA切下并克隆至pcDNA3.1(+)载体。将获得的重组质粒pcSAE-GFP和pcSAE-ME转染细胞,分别观察辅助病毒对外源基因表达的影响。结果获得狂犬病毒载体质粒pcSAE-GFP和pcSAE-ME,经酶切分析和序列测定表明所构建克隆是正确的。pcSAE-GFP及pcSAE-ME转染细胞后,在辅助病毒存在下可表达相应外源基因。结论构建的狂犬病毒载体质粒可表达外源基因,为进一步获得表达外源基因的重组狂犬病毒奠定了基础。     

mmu_circ_0001033过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建环状RNA mmu_circ_0001033慢病毒表达载体,作为在低氧性肺动脉高压功能学实验研究的基础。 方法首先设计引物将目的基因片段从原质粒上扩增下来,通过引物两端所含无缝克隆识别位点将其重组到酶切后的过表达载体上;将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞,而后将其单克隆菌落送测序公司进行测序鉴定。其次通过PCR产物跑胶和测序验证成环情况。最后用构建的重组表达载体和包装质粒共同转染293T细胞,包装慢病毒,收集病毒原液,超滤浓缩,并测定滴度。 结果经过比对,重组克隆中插入片段序列与目的片段序列完全一致,表明质粒构建成功。PCR产物后经sanger测序确认环化位点处序列完全正确。将构建的过表达载体测序结果和质粒构建方案基因比对,重组克隆中插入片段序列与目的片段序列与预期完全一致,可实现转染质粒后目的基因的表达,PCR产物跑胶和测序结果表明mmu_circ_0001033成环成功。PCR产物跑胶和测序结果表明mmu_circ_0001033成环成功。最后通过比较RT-qPCR测定病毒滴度值为2.09×10⁸ TU/ml。 结论成功构建环状RNA mmu_circ_0001033慢病毒表达载体,能稳定转染293T细胞,可用于后续细胞实验。     

丙型肝炎病毒F反式调节靶基因反式激活基因的筛选和生物信息学分析

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）F反式调节靶基因FTP2的反式激活基因的cDNA文库，克隆FTP2反式激活基因。方法以HCVFTP2表达质粒pcDNA3．1（-）-HCVFTP2转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应（PCR），将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HCVFTP2反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到56个2001000bp插入片段的克隆，随机挑选其中24个插入片段测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得20种编码基因，其中1个为未知功能的新基因。结论筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。     

应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒e抗原调节基因

目的 筛选与克隆HBeAg激活基因，了解其在体内的凋节功能线索。方法 以HBeAg表达质粒pcDNA3．1(-)-HBeAg转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为eDNA，经RsaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染人肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HBeAg激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到40个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～800bp插入片段。对插入片段测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得12种编码基因，包括11种已知基因和1种未知基因。结论 筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因，推测了HBeAg在体内可能存在的调控机制的线索，尚需进一步的实验证明。     

cDNA文库基础上运用热启动聚合酶链反应末端延伸快速分离全长cDNA序列

建立一种cDNA文库基础上运用热启动聚合酶链反应末端快速扩增分离人类新基因全长cDNA序列的新技术。以文库载体序列与待扩增目的基因片段为模板各设计引物进行热启动聚合酶链反应扩增，从人胎肝cDNA文库中获得氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞泡沫化过程中差异表达序列标签片段（FRG4）的全长cDNA序列，聚合酶链反应产物克隆到pGEM-T载体中，并测序鉴定，从而成功获得FRG4的全长cDNA序列，该技术是一种快速有效的分离人类新基因全长cDNA序列的方法。     

应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选HBV XTP12蛋白反式激活基因的上调基因

目的 克隆并筛选乙型肝炎病毒(HBV)反式激活基因XTP12的上调基因,了解其可能存在的调节功能.方法 应用抑制性消减杂交技术克隆并筛选XTP12反式激活的新型靶基因.以XTP12表达质粒pcDNA3.1(-)-XTP12转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果 成功构建人XTP12反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到68个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000 bp插入片段.随机挑选其中28个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果 共获得28种编码基因,其中26种为已知基因编码蛋白,2种为未知功能的新基因.结论 筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞牛长调节、物质代谢、免疫及肿瘤等密切相关的蛋白编码基因,推测了XTP12可能存在的调控机制的线索.     

编码小鼠分泌型Klotho蛋白的cDNA克隆及其重组腺相关病毒载体构建

目的 克隆编码小鼠分泌型Klotho蛋白(secKlotho)的全长cDNA片段,构建secKlotho重组腺相关病毒载体.方法 以小鼠肾脏组织mRNA为模板,通过RT-PCR扩增获得小鼠Klotho基因大片段并克隆至pMD18-T载体中,再采用长臂引物进行二次PCR扩增获得编码secKlotho的全长cDNA片段,经EcoR I/Xho I酶切、连接、转化将目的 片段亚克隆至腺相关病毒载体pAAV-MCS中,酶切及DNA测序对阳性克隆进行鉴定.结果 RT-PCR成功扩增出1 600 bp的小鼠Klotho基因大片段,经二次PCR扩增得到编码secKlotho 的全长1 650 bp cDNA片段,并最终获得3个序列信息和读码框完全正确的pAAV/secKlotho克隆.结论 成功构建小鼠分泌型Klotho重组腺相关病毒载体,为Klotho基因转染治疗慢性肾功能衰竭及冠状动脉粥样硬化等疾病奠定了基础.