实时荧光定量PCR和测序法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的比较

背景与目的 以厄洛替尼(Erlotinib)为代表的小分子表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂在治疗非小细胞肺癌已经取得很好的疗效.许多研究发现表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变与酪氨酸激酶抑制剂的疗效密切相关.本研究目的是通过比较荧光定量PCR(Real-time PCR)和DNA测序法检测EGFR基因突变的一致性,建立适用于临床的EGFR基因突变检测方法.方法 应用荧光定量PCR(Real-time PCR)及DNA测序法检测103例非小细胞肺癌标本的EGFR外显子19和21的基因突变,结果比较采用卡方检验.结果 两种方法对EGFR外显子19和21的基因突变的榆测结果无统计学差异,且荧光定量PCR法比测序法更快捷和灵敏.结论 与测序法相比,荧光定量PCR更适用于临床检测.     

荧光定量聚合酶链反应技术在胃幽门螺杆菌检测中的应用

目的:评估荧光定量PCR在检测胃粘膜上幽门螺杆菌的DNA中的应用价值。方法:用荧光定量PCR与普通PCR检测胃粘膜上的幽门螺杆菌的DNA,并对二者进行方法学比较。结果:荧光定量PCR阳性率为95.3%(143/150),普通PCR阳性率仅为86.0%(129/150),二者之间有明显的差异(P<0.01)。结论:荧光定量PCR在临床上检测幽门螺杆菌DNA方面具有简单、快速、敏感、特异的特点,在临床上具有较高的应用价值。     

肺腺癌组织EGFR外显子19基因突变的实时定量PCR检测

目的:应用实时定量PCR技术建立上皮生长因子受体(EGFR)外显子19基因突变的检测新方法。方法:根据Taqman原理设计了外显子19特异性引物和探针,经过优化形成试剂盒后检测了61例肺腺癌组织中的EGFR外显子19基因突变,并将结果与基因测序进行对比分析。结果:本方法对22种EGFR外显子19基因突变均具有高度特异性,其最低检测限度为10个外显子19基因拷贝或3ng组织DNA,当突变型DNA占野生型DNA含量的20%或以上时,检测结果具有良好的分辨率。本诊断试剂在4℃保存4d仍性能稳定,批次间实验误差小于10%。在61例肺腺癌组织中,45例野生型组织的ABP/SYB比值为1.437±0.707,而16例突变型组织的比值为0.631±0.280,二组间差异具有统计学显著意义(P<0.001)。若以ABP/SYB比值<0.800作为外显子19基因突变的检测临界值,则定量PCR检测与基因测序结果完全相符。结论:实时定量PCR方法具有特异性好、敏感性高、简便易行等优点,有助于从肺癌患者中快速筛选EGFR抑制剂合适的治疗对象,便于合理用药。     

血浆EB病毒DNA检测在鼻咽癌中的应用进展

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)与鼻咽癌的发生、发展密切相关,采用PCR方法对鼻咽癌患者不同阶段的血浆EB病毒DNA (EBV DNA)进行定量检测可有效评估患者对治疗的反应,预测复发、转移的风险,治疗前的EBV DNA基线浓度与肿瘤负荷密切相关,而治疗后的EBV DNA含量与肿瘤复发转移关系更密切.EBV DNA定量检测有望成为一种新的肿瘤预后指标.本文就鼻咽癌患者不同时期的EBV DNA水平在诊断、分期、疗效评估和预后预测中的应用进行综述.     

定量PCR检测肝细胞癌患者血浆循环DNA及其临床意义

背景与目的:血循环DNA是一种新的肿瘤诊断及预后判断的标志物.本研究运用定量PCR技术检测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者血浆循环DNA含量并探讨其诊断价值.方法:收集72例HCC患者术前血浆样本,37例肝良性病变(肝硬化以及慢性肝炎)和41例健康志愿者的血浆样本,纯化血浆循环DNA,采用实时定量PCR技术对血浆DNA水平进行检测.应用接受者操作特性(receiver-operating characteristics,ROC)曲线分析血浆循环DNA在HCC诊断中的价值.结果:HCC中位血浆循环DNA浓度(173 ng/mL)显著高于健康对照(9 ng/mL)和肝良性病变组(46 ng/mL)(P<0.001);其ROC曲线下面积(area under the ROC curve,AUC)分别为0.949和0.874.而HCC血浆DNA浓度也显著高于肝硬化及慢性肝炎患者(P=0.001),AUC为0.703.以18.2 ng/mL作为诊断HCC的临界值,其诊断特异度为90.2%,敏感度达90.3%;与血清AFP联合检测可提高HCC诊断效率,AUC上升至0.974,其诊断特异度和敏感度分别为95.1%和94.4%.伴肝内播散或脉管癌栓HCC患者的血浆DNA浓度(261 ng/mL)明显高于不伴肝内播散灶或脉管痛栓患者(142 ng/mL,P=0.035).结论:定量PCR技术可精确定量血浆循环DNA浓度;血浆DNA分析对于HCC诊断,预测肿瘤转移潜能具有重要价值.     

荧光定量PCR法检测外周血淋巴细胞中EB病毒DNA含量对鼻咽癌诊断及预后的价值

目的　评价外周血淋巴细胞中EB病毒DNA含量对鼻咽癌诊断及预后的价值。方法　采用荧光定量PCR方法检测 52例鼻咽癌患者和 127例非鼻咽癌患者外周血淋巴细胞中EB病毒DNA含量。结果　鼻咽癌患者中EB病毒DNA的阳性率为 55 76% (29 /52),对照组阳性率为 8 66% (11 /127),阳性率差异有显著性P<0. 01。早期(Ⅰ、Ⅱ期)鼻咽癌患者EB病毒DNA含量与晚期 (Ⅲ、Ⅳ期 )比较有显著性差异(P<0 05)。结论　荧光定量PCR方法检测外周血淋巴细胞中EB病毒DNA含量在鼻咽癌的诊断上有极高价值,可作为判断疗效及监测病情的一种有效手段。     

上皮生长因子受体外显子21基因突变L858R的实时定量PCR检测

目的应用实时定量PCR技术建立上皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)外显子21基因突变L858R的检测新方法。方法根据Taqman-MGB原理设计野生型外显子21和L858R特异性探针,经过优化制备成试剂盒检测171例肺癌组织中的L858R基因突变,并将结果与基因测序进行对比分析。结果171例肺癌组织经基因测序共检出L858R突变15例,突变率为8.8%。突变多见于女性、肺腺癌及腺鳞癌。定量PCR检测显示,15例突变型组织的R值平均为0.840±0.223,而156例野生型组织的R值平均为1.552±0.278,两组间差异具有统计学显著意义(P<0.001)。此外,以突变型为主的肺癌组织其R值(0.613±0.137)显著低于野生型占优势组织(0.992±0.103),两组间差异极为显著(P<0.001)。实验证明,定量PCR检测方法对L858R基因突变具有高度特异性,其最低检测限度为突变型DNA占野生型DNA含量的12.5%。结论本方法检测EGFR基因L858R突变具有敏感性高、特异性好、简便快速等优点,应用本方法不仅可以对野生型EGFR外显子21或突变型L858R进行诊断,而且还可以根据R值判断样本中突变型基因的比例。     

US、CT和手术所见在肝癌定性、定量、定位诊断中的对照研究

目的探讨US、CT在肝癌定性、定量、定位诊断中的意义.方法对78例经手术及病理证实的肝内实质占位进行了US与CT及US、CT与手术所见的对照研究.其中,原发性肝癌50例,转移性肝癌7例,肝海棉状血管瘤13例,其他病变8例.结果US、CT对肝癌定性诊断的敏感性为87.72%、90.00%,特异性为52.38%、65.00%,准确性为78.28%、82.85%.虽然CT对肝癌定性诊断的敏感性、特异性及准确性略高于US,但统计学上无显著性差异(P＞0.05),US、CT对肝癌定量(肿块大小)诊断的完全符合率分别为US42.18%、CT46.00%,定位诊断上完全符合率分别是US12.28%、CT34.00%,统计学上均无显著性差异.结论US、CT作为对肝癌的常规检查方法在某些方法是可以互相替代的,影像学在肝癌的定量及定位诊断上仅是一个参考指标.     

建立RDPCR技术检测p53基因的DNA损伤

目的：设计、建立并初步评价能检测特定基因DNA损伤的随机末端连接物依赖的PCR（Randomized Terminal Linker-Dependent PCR,PDPCR)析技术。方法；培养TK6细胞并提取基因组DNA。用PCR技术扩增186bp的p53基因外显子7，以凝胶回收纯化的扩增产物为模板，再进行新的PCR反应标记地高辛探针，标记探针被电泳和定量，用限制性内切酶AfaI完全消化基因组DNA建立损伤模型；经过p53基因外显子7的特异性引物P1重复直线延伸，与一带有3'随机粘性末端的双链公共连接物（Linker)在T4 DNA连接酶作用下连接后，用基因特异性引物P2和连接物引物经PCR指数扩增；琼脂糖电泳，真空转印至带正电荷的尼龙膜上，再与地高辛标记的探针杂交后显色。结果：p53基因外显子7的扩增条带清晰，特异。标记探针的电泳速度稍慢于未标记片段。定量为50μg/μl。RDPCR结果表明，使用3'末端阻止的Linker可见在相应位置出现了清晰的目标带，而未阻止的由于Linker的自身连接显色信号微弱；灰度计量显示RDPCR的信息信号强度是传统的连接介导聚合酶链反应（Ligation-mediated Polymerase Chain Reaction,LMPCR)的7倍，但其背景稍高。结论：RDPCR是在LMPCR，单链连接PCR（Single-strand Ligation PCR,SLPCR)和末端转移酶依赖的PCR（Terminal transferase-dependent PCR,TDPCR)技术上设计的新的体外扩增技术，可以有效检测特定基因的DNA损伤。它可能克服LMPCR、SLPCR和TDPCR各自的缺陷，如应用局限、连接效率低和定位不精确率，更为灵敏、简便、快速和适用。结合Maxam-Gilbert化学测序技术，RDPCR还能在核酸序列水平检测特定基因的DNA损伤，包括DNA加合物、链断裂和氧化损伤等，有很好的应用前景。     

EGFR基因突变与EGFR酪氨酸激酶抑制剂近期疗效的关系

背景与目的 多项研究证实表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变与EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)的疗效存在相关性.本研究应用荧光定量PCR技术检测晚期肺癌的EGFR基因突变,分析其与EGFR TKI药物Gefitinib二线治疗晚期非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)的近期疗效之间的关系.方法 从63例血浆和胸腔积液标本(其中血浆53例,胸腔积液10例)中提取游离DNA,应用荧光定量PCR技术进行EGFR 18、19、21外显子基因的检测,并结合临床进行分析.结果 在63例血浆和胸腔积液标本中检测到EGFR基因突变17例,突变率为27.0%.EGFR基因突变主要见于女性及非吸烟人群(P＜0.05).存在EGFR基因突变的患者Gefitinib二线治疗的疗效明显优于野生型患者(P＜0.01).结论 晚期NSCLC患者的血浆、胸腔积液游离DNA中存在EGFR基因突变,这类突变可以通过荧光定量PCR技术检测出来.EGFR基因突变患者对Gefitinib的反应率明显高于野生型患者,检测胸腔积液和/或血浆EGFR基因突变有助于选择有效患者接受EGFR TKI治疗.     

胃癌细胞系和胃癌组织中EphA7基因的高甲基化及其临床意义

背景与目的：启动子区CpG岛高甲基化是导致基因转录水平下调的重要表观遗传学机制,我们前期的研究发现EphA7基因在部分胃癌中表达下调.本研究探讨EphA7基因下调的机制及其临床意义.方法：检测6株胃癌细胞及62例胃癌标本中EphA7基因甲基化状态.采用同位素掺入方法对胃癌细胞系的EphA7基因表达进行半定量RT-PCR测定;利用亚硫酸氢钠处理DNA后,进行DNA测序和甲基化特异性PCR检测.结果：对胃癌细胞系亚硫酸氢钠修饰后DNA测序发现,在EphA7基因启动子区内CpG岛存在超甲基化现象,利用甲基化特异性PCR检测胃癌标本证实,在部分胃癌组织中存在高甲基化.高甲基化与胃癌细胞的分化程度有关（P=0.03）.结论：高甲基化是导致该基因下调的机制之一.EphA7基因在胃癌的发生过程中可能发挥一定作用.     

巢式聚合酶链反应检测人类DNA修复基因:ERCC2/XPDexon 6突变

背景与目的：探讨血样DNA来源困难及DNA产量低的情况下,获得理想的可供突变分析的PCR产物的方法。材料与方法：应用巢式聚合酶链反应(NPCR)．限制性片断长度多态(RFLP)技术检测了人类微量DNA样品的DNA修复基因：ERCC2／XPD exon 6的单核甘酸多态(SNP)。结果：该位点群体基因分型结果显示：自身平衡检验结果符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则。结论：巢式PCR技术在扩增微量DNA、分析突变的实验中较一般单次扩增PCR技术更具有敏感性高,特异性强的优点。     

鼻咽癌患者血浆Epstein-Barr病毒DNA定量分析

目的　探讨鼻咽癌患者血浆游离 EBV - DNA水平测定的临床应用价值。方法　采用荧光定量 PCR技术测定鼻咽癌患者治疗前 2 3例、治疗后 2 3例以及正常对照者 30例血浆 EBV- DNA水平 ,并用免疫酶法检测血清VCA - Ig A水平。结果　鼻咽癌患者血浆游离 EBV- DNA水平高于正常对照者 ,治疗后低于治疗前。结论　 (1)血浆EBV- DNA的实时定量 PCR分析对鼻咽癌的筛选检查有实用价值 ;(2 )血浆 EBV- DNA水平可能是当前反映鼻咽癌局部肿瘤负荷和治疗效果的较理想指标。     

人膀胱移行细胞癌EGFR基因片段与核基质蛋白的相关性

背景与目的:研究人膀胱移行细胞癌中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因片断与核基质蛋白(nuclear matrix proteins,NMPs)的相关性.材料与方法:分别提取培养细胞和膀胱癌组织标本的核基质蛋白及其全细胞蛋白,同时抽提组织标本的基因组DNA和核基质DNA,根据EGFR cDNA序列合成两对PCR引物,分别以基因组DNA和各核基质DNA为模板,PCR扩增其结合片断;并对引物Ⅰ产物进行序列测定;以引物Ⅱ的产物制备探针,southwestern杂交进一步检测EGFR基因片断与核基质蛋白结合情况.结果:110 bp PCR(引物Ⅱ)产物见于基因组DNA和各核基质DNA(NM DNA 0,NM DNA25,NM DNA 50,NMDNA100);940 bp PCR(引物Ⅰ)产物出现在基因组DNA和除NM DNA100外其他核基质DNA中.940 bp序列与EGFR基因DNA序列完全一致.Southwestern blot检测结果表明,全细胞蛋白及核基质蛋白中出现特异的分子量约为60 kD的DNA-蛋白阳性杂交条带.结论:人膀胱移行细胞癌中,EGFR活性转录基因片段与核基质及核基质蛋白结合,NMPs可能和EGFR基因转录或转录后翻译等基因调控事件相关,核基质对EGFR在膀胱癌中高表达可能具有重要的调控作用.     

肿瘤患者血清DNA甲基化的研究进展

血清DNA是循环核酸的一种，DNA甲基化与肿瘤的发生发展有密切关系；甲基化特异性PCR(MSP)是血清DNA甲基化检测的灵敏方法，血清DNA甲基化在肿瘤的早期诊断、分期、治疗及预后监测等方面有重要意义，是目前肿瘤分子生物学研究热点之一，具有极大的应用价值。     

肿瘤DNA细胞化学定量研究的一些进展

近十多年来,定量细胞化学发展很快,它对生物学、医学许多领域的研究,起到了有意义的影响。迄今能进行原位定量的细胞化学成份有糖元、脂类、RNA、DNA、单胺类、抗原物质、特异性膜受体以及30多种酶。但是DNA原位定量仍然是目前细胞化学定量研究     

多聚酶链反应的原理、应用及其进展

多聚酶链反应、(polymerase Chainreaction,PCR)是近年来出现的一种新的DNA体外扩增法。利用这一方法,经过简单的操作,便可把某个靶DNA片段扩增上百万倍,使对该片段的检测、分离和结构分析等大为简化。PCR是核酸研究中非常实用的一种方法。在许多应用方面,它可以完全取代或部分取代一些传统的分子生物学方法,或与这些方法结合使用使其变得更为灵敏、简便和有效。PCR自1985年建立以来,一直引起人们极大的兴趣和关注。其方法学的研究和应用性研究都进展很     

血液病患者巨细胞病毒和EB病毒定量检测的临床价值

目的 评价实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）对血液系统疾病患者巨细胞病毒（CMV）和EB病毒（EBV）感染的早期诊断价值.方法 应用实时荧光定量PCR检测271例血液系统疾病患者和28名健康对照者血液中CMV DNA和EBV DNA的含量.结果 28名健康对照者CMV DNA和EBVDNA均阴性.271例患者中147例检测EBV,阳性率为24.5％（36/147）;124例检测CMV,阳性率为4.8％（6/124）,DNA介于102～ 106基因拷贝/ml,治疗有效者EBV DNA和CMVDNA均迅速下降,1～3周后转阴.结论 实时荧光定量PCR动态监测血液系统疾病患者CMV DNA和EBV DNA水平对CMV和EBV感染的早期诊断和疗效判断具有重要意义.     

血浆EBV DNA定量分析在监测鼻咽癌患者复发和转移中的价值

目的 探讨血浆EB病毒DNA(EBV DNA)含量在监测鼻咽癌患者放疗后复发和转移中的临床价值.方法 采用荧光定量PCR方法 检测81例放疗后随诊的鼻咽癌患者血浆EBV DNA含量,比较缓解组与复发、转移组血浆EBV DNA差异.结果 放疗后缓解组患者血浆EBV DNA阳性率为15.7%,中位拷贝数为0 copy/ml;放疗后复发或转移组患者血浆EBV DNA阳性率93.3%,中位拷贝数6 432 copies/ml,差异均有显著性(P<0.001).结论 血浆EBV DNA定量检测有可能成为监测鼻咽癌患者放疗后复发、转移的肿瘤标记物.     

2014年圣安东尼奥乳腺癌研讨会报道:乳腺癌循环核酸检测最新进展

循环核酸(circulating nucleic acid),是指循环血中游离于细胞外的机体内源性DNA。循环核酸最早由Mandel和Métais[1]于1947年发现,由于缺乏高灵敏性和高特异性的检测方法,有关血液中游离DNA与疾病相关性的研究在较长时期内进展缓慢。直到有效分离游离DNA技术、高通量测序和数字PCR的出现,使这一领域的研究在近些年得到了较为迅速的发展。尤其在发现循环核