登革2型病毒ZS01/01株E蛋白在真核细胞中的分泌表达研究

目的 对登革2型病毒(DENV-2)ZS01/01株E蛋白在哺乳动物细胞及昆虫细胞中的分泌表达进行研究.方法 RT-PCR扩增DENV-2 prM/E基因,通过融合PCR在prM基因前添加来自乙型脑炎病毒的信号肽序列,并将E基因羧基末端20%区域缺失或替换为乙型脑炎病毒SA14-14-2株E基因相应序列,将上述基因元件分别克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA5/FRT及昆虫细胞表达载体pAcUW51-M中,将重组质粒转染293T细胞或S19细胞,利用间接免疫荧光(Immunofluoreseence assay,IFA)及Western Blot检测E蛋白的表达与分泌.结果 各重组质粒分别转染293T细胞或Sf9细胞后,E蛋白在细胞内均有效表达,而仅有携带乙脑信号肽且缺失或替换E基因羧基末端20%区域的重组质粒转染293T细胞后,上清中可检测到明显的E蛋白分泌.结论 信号肽及E基因羧基末端20%区域对登革病毒E蛋白的分泌至关重要,宿主细胞对其亦有一定影响.     

登革2型病毒ZSO1／01株E蛋白在真核细胞中的分泌表达研究

目的对登革2型病毒（DENV-2）ZSO1／01株E蛋白在哺乳动物细胞及昆虫细胞中的分泌表达进行研究。方法RT．PCR扩增DENV-2prM／E基因,通过融合PCR在prM基因前添加来自乙型脑炎病毒的信号肽序列,并将E基因羧基末端20％区域缺失或替换为乙型脑炎病毒SA14-2株E基因相应序列,将上述基因元件分别克隆人哺乳动物细胞表达载体pcDNA5／FRT及昆虫细胞表达载体pAcUW51-M中,将重组质粒转染293T细胞或Sf9细胞,利用间接免疫荧光（Immunofluoreseence assay,IFA）及Western Blot检测E蛋白的表达与分泌。结果各重组质粒分别转染293T细胞或Sit）细胞后,E蛋白在细胞内均有效表达,而仅有携带乙脑信号肽且缺失或替换E基因羧基末端20％区域的重组质粒转染293T细胞后,上清中可检测到明显的E蛋白分泌。结论信号肽及E基因羧基末端20％区域对登革病毒E蛋白的分泌至关重要,宿主细胞对其亦有一定影响。     

登革2型病毒ZS01/01株E蛋白在真核细胞中的分泌表达研究

目的 对登革2型病毒(DENV-2)ZS01/01株E蛋白在哺乳动物细胞及昆虫细胞中的分泌表达进行研究.方法 RT-PCR扩增DENV-2 prM/E基因,通过融合PCR在prM基因前添加来自乙型脑炎病毒的信号肽序列,并将E基因羧基末端20%区域缺失或替换为乙型脑炎病毒SA14-14-2株E基因相应序列,将上述基因元件分别克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA5/FRT及昆虫细胞表达载体pAcUW51-M中,将重组质粒转染293T细胞或S19细胞,利用间接免疫荧光(Immunofluoreseence assay,IFA)及Western Blot检测E蛋白的表达与分泌.结果 各重组质粒分别转染293T细胞或Sf9细胞后,E蛋白在细胞内均有效表达,而仅有携带乙脑信号肽且缺失或替换E基因羧基末端20%区域的重组质粒转染293T细胞后,上清中可检测到明显的E蛋白分泌.结论 信号肽及E基因羧基末端20%区域对登革病毒E蛋白的分泌至关重要,宿主细胞对其亦有一定影响.     

登革2型病毒NGC株E基因在NIH3T3细胞中的表达及初步鉴定

目的　构建登革 2型病毒E基因的真核表达载体 ,实现登革病毒E蛋白的真核表达。方法　采用逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR)扩增登革 2型病毒 (NGC株 )包膜糖蛋白E基因全长片段 ,克隆入真核表达载体pcDNA3的Pcmv启动子下游 ,构建重组真核表达质粒pcDNA3 E ,用脂质体转染法转染NIH3T3细胞 ,表达产物以免疫荧光、SDS PAGE和蛋白质印迹进行分析检测。结果　成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3 E ,通过脂质体转染法导入NIH3T3细胞 ,免疫荧光、SDS PAGE和蛋白质印迹分析检测表明 ,E基因在NIH3T3细胞实现了真核表达 ,产物相对分子质量 (Mr)为 6 0× 10 3。结论登革病毒E基因真核表达载体的构建及E基因的真核表达为研究登革病毒E蛋白的结构与功能、研制登革病毒诊断试剂及核酸疫苗奠定了基础     

我国D2—43株PrM—E基因的复制型载体质粒DNA的免疫原性研究

目的 通过观察含我国登革2型病毒株（D2－43）的PrM-E基因的复制型SFV重组质粒DNA的免疫原性,为登革新型疫苗的研制提供依据。方法 将PrM-E基因自T载体上切下,插入复制型SFV病毒载体质粒DNA中。将此重组质粒DNA以电穿孔法导入BHK21细胞,表达产物的特异性用间接免疫荧光法进行鉴定。采用去除内毒素的质粒提取试剂盒制备重组质粒DNA,然后以不同剂量通过肌肉注射途径免疫Balb/c鼠,鼠血清中的抗体用间接免疫荧光法进行检测。结果 含PrM-E基因的重组SFV质粒DNA在BHK21细胞中可表达登革2型病毒的特异蛋白;经免疫Balb/c鼠后,鼠血清可与登革D2－43感染的C6／36抗原片起特异的抗原抗体反应。结论 含登革2型病毒PrM-E基因的复制型SFV病毒载体质粒DNA在Balb/c鼠中可诱导登革2型病毒特异抗体的产生,但抗体水平较低。     

我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因免疫原性的研究

目的 构建含有我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因片段的真核表达质粒,观察重组质粒DNA的免疫原性,为登革多价疫苗的研究提供依据。方法 首先将包含我国登革2型病毒43株E蛋白Ⅰ/Ⅱ抗原区和4型病毒B5株E蛋白Ⅲ抗原区的嵌合E基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,通过测定确定嵌合基因序列的正确性。然后将重组质粒以肌肉注射途径,免疫Balb/C小鼠。通过间接免疫荧光法对采集的鼠血清中的病毒特异抗体进行检测。结果 构建的含有我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因的真核表达质粒pcDNA-D2/4,经序列测定表明,导入的嵌合E基因片段的序列是正确的。将重组质粒DNA免疫小鼠,在初次免疫后的第3周,可同时检测到针对登革2型和4型病毒的特异荧光。结论 所构建的含有不同血清型的我国登革病毒株嵌合E基因片段的真核重组质粒,可诱导小鼠同时产生针对两个血清型病毒的特异抗体,该研究为新型登革多价疫苗的研制提供了依据。     

登革2型病毒NGC株E基因在NIH3T3细胞中的表达？…

目的 构建登革２型病毒Ｅ基因的真核表达载体,实现登革病毒Ｅ蛋白的真核表达。方法 采用逆录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增登革２型病毒（ＮＧＣ株）包膜糖蛋白Ｅ基因全长片段,克隆人真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的Ｐｃｍｖ启动子下游,构建重组真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｅ,用脂质体转染法转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,表达产物以免疫荧光、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹进行分析检测。结果 成功构建了重组真核表达质粒ｐｃＤＮ     

蜱传脑炎病毒prM-E蛋白的真核表达及其在荧光素酶免疫共沉淀技术中的应用?

为了探索一种新型的血清学技术的荧光素酶免疫共沉淀技术（LIPS）,本研究利用真核表达系统制备了蜱传脑炎病毒结构蛋白prM?E与荧光素酶融合蛋白,并评价了其在LIPS系统中的检测效果。首先以蜱传脑炎病毒RNA为模板,采用RT?PCR技术扩增prM?E抗原基因,连接到pNLF1?secN质粒上构建真核表达载体pNLF?prM?E,使prM?E蛋白与荧光素酶串联融合表达,并将该质粒转染到Cos7细胞中。结果显示,转染重组质粒pNLF?prM?E的细胞上清中可检测到荧光素酶的高表达;进而用间接免疫荧光试验（ IFA）检测到转染的细胞与蜱传脑炎病毒抗体特异性结合;在此基础上,用LIPS方法对蜱传脑炎病毒感染患者血清进行检测,从20份患者血清中检出19份阳性,7份对照血清均为阴性。结果表明该重组抗原具有良好的特异性和灵敏性,可以用于LIPS系统中的候选检测抗原。     

登革病毒外膜蛋白DⅢ区融合基因真核表达载体的构建及免疫效果研究

目的:构建登革病毒外膜蛋白DⅢ区融合基因真核表达载体并分析其免疫原性.方法:利用连接肽将登革病毒1型与2型、3型与4型的外膜蛋白(E蛋白)DⅢ基因片段连接在一起,克隆人真核表达载体pCDNA3.1(+),构建DEN1/2型、DEN3/4型EDⅢ融合基因的二价真核表达载体,转染哺乳动物细胞BHK-21,用间接免疫荧光法和免疫印迹法鉴定目的蛋白的表达.将两种二价重组质粒混合形成四价DNA疫苗免疫小鼠,观察其免疫原性及诱导产生中和抗体的能力.结果:二价重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的蛋白,四价DNA质粒免疫小鼠,能诱导产生针对登革病毒1~4型的中和抗体,平均中和效价分别为l:24.7、1:26.9、1:13.4、1:16.0.结论:本研究构建的DNA质粒在小鼠模型中具有良好的免疫原性,为登革多价DNA疫苗的研究提供了可行性.     

含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体构建与表达Tat蛋白功能检测

目的 构建含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体及评价表达Tat蛋白的功能。方法 使用HindⅢ将HIV-1 Tatl0l蛋白编码基因从pEN质粒中切出，插入到表达质粒IZRSpBMN-Z中，构建成重组反转录病毒表达质粒IZRS-Tat101。采用磷酸钙转染法将重组质粒LZRS-Tat101转染进含反转录病毒env、gal和pol编码基因的包装细胞phoenix(φNX)中，嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。免疫组化(IHC)染色检查Tat在临时转染和稳定转染φNX细胞中的表达水平。收集临时转染和稳定转染包装细胞分泌的病毒上清，并分别感染293细胞，Western blot检测Tat在293中表达。与此同时，收集感染293细胞培养上清，加入到HL3T1细胞(HeLa-HIV-1-LTR／CAT报告基因)中，共培养72h后收集细胞，提取蛋白作CAT活性检测。结果 ①含Tat101基因重组反转录病毒表达质粒转染包装细胞后，Tat在临时转染φNX中表达水平显著高于在稳定转染中的水平；②临时转染病毒感染293细胞，Tat在感染细胞中得到了表达，且分泌至上清中的Tat蛋白能够激活靶细胞HL3T1中HIV-1的LTR启动子，使得其下游的CAT基因得到表达。结论 重组LZRS-Tat101反转录病毒能够在其感染靶细胞中表达Tat蛋白，且表达蛋白具有转录激活功能。     

登革3型病毒prM-E和NS1多基因重组质粒DNA免疫原性增强效果观察

目的　观察登革 3型病毒的prM E和NS1基因重组质粒DNA混合免疫对免疫原性的增强作用 ,为登革DNA疫苗混合免疫提供实验依据。方法　将登革 3型病毒的prM E和NS1基因重组质粒DNA分别混合及单独免疫BALB/c小鼠 ,采用中和试验及MTT法检测免疫小鼠血清中和抗体及脾细胞特异性CTL(cytotoxicT lymphocytes)杀伤率。结果　混合重组质粒DNA免疫组与单一prM E基因重组质粒DNA免疫组均在末次免疫后第 14天检测到中和抗体 ,在第 33天达到高峰 ,为 1∶32。在末次免疫后第 4 1天 ,当效靶比为 4 0∶1时 ,混合重组质粒DNA免疫组的特异性CTL杀伤率为 15 % ,而 2个单质粒DNA组分别为 10 .9%和 12 .4 %。结论　重组质粒DNA混合免疫可同时诱发小鼠产生体液免疫和细胞免疫 ,而且细胞免疫应答具有一定的增强作用 ,但没有出现特异性CTL杀伤率的协同增强效果。     

圣路易斯脑炎病毒样颗粒的真核表达、纯化与鉴定

目的 利用293T细胞表达、纯化圣路易斯脑炎病毒样颗粒（Virus like particles,VLPs）,为研制圣路易斯脑炎病毒免疫诊断试剂奠定基础.方法 构建含圣路易斯脑炎病毒PrM和E基因的重组质粒pcDNA5/FRT-SJME,瞬时转染293T细胞,表达并纯化重组蛋白,通过透射电镜、间接免疫荧光试验、Western-Blot和ELISA对其进行鉴定.结果 表达的重组蛋白形成50 nm的球型颗粒,能与抗圣路易斯脑炎病毒抗体产生特异性反应,与部分黄病毒属阳性血清发生交叉反应.结论 已成功在哺乳动物细胞中表达并纯化了圣路易斯脑炎病毒样颗粒,其具有良好的抗原性和完整的颗粒形态,为进一步研制圣路易斯脑炎病毒感染的免疫诊断试剂奠定了基础.     

重组纤溶酶原Kringle 5区基因杆状病毒载体的构建及表达研究

目的克隆人源性纤溶酶原Kringle5(K5)基因,构建K5分泌型杆状病毒载体,并检测其在肌细胞中的表达。方法引物中加入前胰岛素原信号肽基因序列,PCR产物经Age Ⅰ和Acc Ⅰ双酶切后装入pFB载体中构建为pFBK5,将其转染肌细胞C2C12,经Western印迹检测重组蛋白的表达并用MTT试验进行初步活性鉴定。结果成功扩增出了K5基因序列,测序正确,转染了pFBK5的C2C12细胞及上清中均检测到了特异性的14 ku蛋白条带且其对ECV304细胞产生剂量依赖性抑制作用,而转染空载体对照组无相应蛋白表达。结论人源性纤溶酶原K5分泌型杆状病毒载体构建成功,表达的重组蛋白具有生物活性,为进一步的病毒制备奠定了基础。     

登革2型病毒ZS01/01株病毒样颗粒免疫原性研究

目的 研究登革2型病毒（Dengue virus type 2,DENV-2）病毒样颗粒（virus-Like particles,VLPs）的免疫原性.方法 利用已构建的DENV-2 ZS01/01株病毒样颗粒的表达质粒转染293T细胞,对分泌型VLPs进行大量培养并通过蔗糖密度梯度离心法对其进行纯化.纯化的VLPs经Western Blot及透射电镜观察等方法鉴定后免疫BALB/c小鼠.利用ELISA及中和试验等方法对体液免疫反应进行检测,ELISPOT法测定细胞免疫水平.结果 登革2型病毒样颗粒表达质粒转染哺乳动物细胞所得上清经蔗糖密度梯度离心后,电镜下可观察到类似于天然登革病毒的大小在45～55nm之间的病毒样颗粒.体液及细胞免疫检测结果显示登革2型VLPs可以刺激小鼠产生较高水平的登革E蛋白特异性抗体及一定水平的中和抗体,免疫小鼠脾淋巴细胞经体外刺激后IFN-γ水平显著升高.结论 登革2型病毒病毒样颗粒免疫BALB/c小鼠后可引起一定水平的细胞免疫及体液免疫反应,该研究结果为四价登革病毒样颗粒疫苗的研制奠定了基础.     

人CD226分子胞膜外区D1和D2真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的 构建含有人CD226分子胞膜外区结构域1(D1)和结构域2(D2)的真核表达载体,表达并纯化重组蛋白.方法用特异性引物分别扩增CD226 D1和D2的基因,定向插入真核表达载体pSecTag2B-Fc,进行酶切和DNA测序鉴定,重组质粒瞬时转染293T细胞,收集上清,纯化蛋白及SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果利用PCR方法克隆出CD226胞膜外区D1和D2的基因,并正确插入pSecTag2B-Fc载体中,真核表达载体瞬时转染293T细胞,Western blot结果证实转染293T细胞的培养上清液中含有hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc融合蛋白,培养上清经亲和层析柱纯化,可获得较高纯度的重组蛋白.结论 成功的构建了分泌型融合蛋白hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc真核表达载体,获得纯度较高的融合蛋白,为进一步探讨其配受体的相互作用机制奠定了基础.     

1b型丙型肝炎病毒NS3-4b重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的 构建1b型丙型肝炎病毒(HCV) NS34b基因重组腺相关病毒载体并了解其在HEK 293细胞中的表达,为进一步研究HCV重组腺相关病毒疫苗及其树突状细胞疫苗奠定前期基础.方法 收集基因1b型的丙型肝炎病人血清,用RT-PCR的方法扩增NS3-4b全长片段,与腺相关病毒的表达载体pAAV.CMV.eGFP重组,构建pAAV.CMV.HCV.NS3-4b重组表达载体,转染HEK293细胞,检测其蛋白表达情况.结果 PCR扩增获得的NS3-4b条带与预期大小(2838 bp)一致,重组质粒经双酶切和测序证实NS3-4b基因已重组成功,重组质粒转染HEK 293细胞后Western Blot图可见有目的蛋白表达.结论 成功构建腺相关病毒重组HCV NS3-4b载体并且其能在真核细胞中表达.     

PEX慢病毒载体构建及其在293FT细胞中的分泌表达

目的 构建含人MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒,并在293FT细胞中分泌表达PEX蛋白.方法 利用RT-PCR、基因重组等技术,构建含MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒表达载体pBPLV-signal-PEX,在脂质体介导下与包装质粒(pLP1、pLP2)、包膜质粒(pLP/VSVG)共转染293FT细胞,包装产生慢病毒并进行滴度测定.慢病毒感染2931;3"细胞后,Western印迹法检测293FI"细胞培养上清中PEX的表达.结果 酶切和DNA测序表明慢病毒表达载pBPLV-signal-PEX构建正确,四质粒共转染293FT细胞成功获得慢病毒;慢病毒感染293FT细胞后,在细胞培养卜清中可检测到PEX蛋白的表达.结论 成功构建了含人PEX的重组慢病毒,在体外有效感染293fT细胞并持续分泌表达目的 蛋白,为进一步研究PEX在肿瘤侵袭与转移中的作用提供实验基础.     

重组慢病毒表达载体介导HIV-1 Vpr蛋白调控KSHV潜伏感染的初探

目的 利用慢病毒载体系统包装含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒蛋白R(Vpr)的重组慢病毒,使之感染原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1,并检测Vpr蛋白对细胞中卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)潜伏感染与裂解性复制的影响.方法 从实验室先前构建的重组真核表达质粒pCI-neo-Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen载体中构建成重组慢病毒质粒pHAGE-Vpr,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2及包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达,293T细胞培养上清经0.45 μm滤器过滤后即获得重组病毒悬液.慢病毒系列稀释后感染293T细胞,荧光计数法测定病毒滴度,逆转录PCR(RT-PCR)检测Vpr基因在293T细胞中的转录.以感染复数(MOI)为1的病毒量感染靶细胞BCBL-1,荧光显微镜观察靶细胞中GFP的表达,并利用RT-PCR和和免疫印迹(Western blot)技术分别检测Vpr基因在靶细胞中的转录和表达情况,同时检测KSHV裂解期基因复制与转录激活子(Rta)mRNA转录及蛋白表达.结果 经酶切鉴定、核酸序列测定和293T细胞中GFP表达证实成功包装了携带HIV-1Vpr基因的重组慢病毒,滴度为4×107TU/ml.重组慢病毒感染BCBL-1细胞后,细胞中有GFP表达,RT-PCR和Western blot均能够在相应位置检测到目的 基因Vpr的条带,并且Vpr降低了KSHV RtamRNA转录及蛋白表达水平.结论 重组慢病毒介导的HIV-1 Vpr蛋白过表达能够抑制KSHV裂解性复制、增强病毒的潜伏感染.     

人IgG Fc基因的扩增及其在真核细胞中的分泌性表达

目的:通过扩增人IgG Fc基因并与人CD5基因信号肽序列融合,构建真核分泌型表达载体,实现在真核细胞中高效表达,为利用Fc基因制备融合抗原,研究抗原基因和抗原蛋白的免疫治疗奠定了基础.方法:从外科手术切除的扁桃体中分离人淋巴细胞,用Trizol试剂提取淋巴细胞的总RNA,通过RT-PCR方法从淋巴细胞中扩增人IgG Fc 片段的基因序列,并将其克隆到pMD-T18 质粒载体上.然后以上述含有Fc片段序列的质粒载体和含有人CD5基因的质粒为模板,通过重叠延伸PCR方法将Fc片段与CD5信号肽基因序列进行融合,并将其插入到pcDNA3.1A 真核表达载体上,构建成与CD5信号肽融合的Fc片段基因的分泌型表达载体.经磷酸钙介导转染293T细胞使其表达.结果:测序表明扩增的Fc基因序列与GeneBank发表的序列完全一致,Western blot检测结果表明,本实验构建的Fc基因分泌型表达载体能够在真核细胞进行高效分泌性表达,表达水平在转染后48小时可达50 μg/1×106细胞.结论:采用RT-PCR扩增了人IgG Fc cDNA 基因,经过与人CD5信号肽序列融合构建了分泌型表达载体,实现了在293T细胞中的高效表达,这为今后构建特定抗原基因与IgG Fc基因融合表达载体,研究DNA疫苗及Fc的生物佐剂提供了实验依据.     

小鼠BTLA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠BTLA慢病毒表达载体,并对表达产物进行鉴定.方法 以pET-28a-mBTLA质粒为模板,通过PCR技术构建pMD18-T-mBTLA质粒,将小鼠BTLA基因全长编码序列克隆到慢病毒转移载体,通过脂质体转染293T细胞包装成小鼠BTLA慢病毒颗粒.PCR技术和基因测序对重组质粒进行鉴定.荧光显微镜观察重组慢病毒感染293T细胞形态学变化.RT-PCR和Western blot法鉴定BTLA在重组慢病毒感染293T细胞中的表达.50％组织培养感染剂量法(TCID5o法)检测重组慢病毒滴度.结果 成功构建的pMD18-T-mBTLA质粒和pSL6-mBTLA质粒,经双酶切电泳后均出现大小约为1 kb的条带与mBTLA编码序列的大小相符.基因测序并比对分析进一步证实mBTLA编码序列成功整合到质粒载体.病毒上清PCR扩增和293T细胞形态学观察证实Lenti-mBTLA慢病毒包装成功.TCID50法测定Lenti-mBTLA慢病毒滴度为1.3×108 pfu/mL.RT-PCR和Western blot法证实Lenti-mBTLA慢病毒能有效表达mBTLA mRNA和蛋白质.结论 成功构建了表达小鼠BTLA的慢病毒.