新生大鼠心肌细胞原代培养

目的探讨酶法分离新生大鼠心肌细胞过程中的各种影响因素,对Simpson经典方法进行改进,提高原代心肌细胞存活率及搏动率。方法采用低浓度的胰酶消化3～4次后,再用低浓度的Ⅱ型胶原酶消化一次,用短时间的2次差速贴壁法分离培养心肌细胞。结果在分离培养新生鼠心肌细胞过程中,胰酶和胶原酶合用,并改变差速贴壁时间,得到高存活率和高纯度的心肌细胞,细胞搏动率高,持续时间久。结论分离培养大鼠心肌细胞时,低浓度的胰酶和胶原酶合用,并用2次差速贴壁,可提高原代心肌培养的存活率和纯度,使细胞搏动良好。     

氟化物对原代培养大鼠肝细胞酶活力及超微结构的影响

目的研究不同剂量的氟化物对原代培养大鼠肝细胞存活率、酶活力及超微结构的影响。方法采用半原位胶原酶消化法分离大鼠肝细胞;MTT法检测细胞存活率;赖氏法检测培养液中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性;透射电镜观察细胞超微结构改变。结果氟化钠染毒24小时后肝细胞存活率下降,且呈现明显的剂量-效应关系;2mmolL和4mmolL染氟组肝细胞培养液中ALT和AST的活性显著升高(P<005);透射电镜下染氟组肝细胞线粒体肿胀,内质网排列紊乱或断裂。结论过量氟化物对原代培养大鼠肝细胞有明显的毒作用,其主要作用方式是引起细胞膜和细胞器质膜损伤。     

胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定

目的 探讨胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定的方法,为胎儿和早产儿骨骼肌发育程序化的研究提供实验基础. 方法 Sprague-Dawley大鼠孕18 d时剖宫取出胎鼠,手术显微镜下取胎鼠四肢骨骼肌肌肉,采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离胎鼠骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法进行纯化.原代培养的生长培养基为(DMEM/F12+ 20％ FBS+ 10％ HS+5 ng/ml bFGF).分化培养基为(DMEM/F12+ 2％ HS).CCK-8法绘制胎鼠骨骼肌卫星细胞生长曲线图,细胞免疫组化染色鉴定纯化后细胞的肌源性标志蛋白Desmin,观察分化培养基条件下骨骼肌卫星细胞的成肌分化特性. 结果 胎鼠原代骨骼肌卫星细胞在培养的第3天进入对数生长期,5～6d达增殖平台期;纯化后的细胞90％以上表达结蛋白(Desmin).在分化培养基的诱导下细胞之间相互融合形成具有自发节律性收缩特性的多核肌管. 结论 采用消化法和差速贴壁法分离纯化胎鼠骨骼肌卫星细胞,能够获得高活性和高纯度的具有成肌分化能力的骨骼肌卫星细胞.     

纳米二氧化硅诱导巨噬细胞焦亡对肺成纤维细胞的影响

目的 探讨纳米二氧化硅(SiNPs)诱导巨噬细胞焦亡对原代肺成纤维细胞基质金属蛋白酶及成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的影响。方法 构建SiNPs致巨噬细胞焦亡模型后,采用纳米高光谱定位巨噬细胞中SiNPs、光学显微镜观察巨噬细胞SiNPs暴露后形态、Western blot检测焦亡相关蛋白表达。通过胰酶和Ⅳ型胶原酶消化法提取小鼠原代肺成纤维细胞;以光学显微镜和免疫荧光技术表征并鉴定原代肺成纤维细胞;体外构建SiNPs诱导巨噬细胞焦亡与原代肺成纤维细胞共培养模型。以正常巨噬细胞上清干预原代肺成纤维细胞作为MF组,焦亡巨噬细胞上清干预原代肺成纤维细胞作为PF组,采用qRT-PCR、Western blot技术分别检测原代肺成纤维细胞中MMP2、MMP9的mRNA水平和蛋白表达,免疫荧光、免疫细胞化学染色检测肌成纤维细胞标志物α-SMA蛋白表达。结果 纳米高光谱、形态学观察和Western blot检测结果显示, SiNPs 成功诱导J774A.1 巨噬细胞发生焦亡,光学显微镜观察发现,与胰酶消化法相比,Ⅳ型胶原酶法提取小鼠原代肺成纤维细胞的纯度更高;免疫荧光结果提示Ⅳ型胶原酶法获得的成纤维细胞波形蛋白呈现典型的微丝结构,细胞骨架结构完整。qRT-PCR 结果显示,PF组MMP2 和MMP9 mRNA水平较MF组增加(P<0.05), Western blot结果显示,PF组MMP2和MMP9蛋白表达水平较MF组升高(P<0.05), 免疫荧光结果显示,与MF组相比,PF组α-SMA红色荧光强度增加,免疫细胞化学染色为强阳性。结论 SiNPs诱导巨噬细胞焦亡能够促进原代肺成纤维细胞MMP2和MMP9表达水平上调,并促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化。     

新生小鼠成骨细胞原代培养方法的实验研究

目的 验证及比较成骨细胞原代培养常用方法,探讨两种原代培养方法的可行性和应用价值.方法 取出生后24 h昆明小鼠乳鼠顶骨,以含血清胶原酶消化法和分段胶原酶消化法分离成骨细胞,进行细胞形态观察,以噻唑蓝(MTT)比色实验法绘制生长曲线,以台盼兰排斥法计数活细胞率.结果 与含血清胶原酶消化法相比,分段胶原酶消化法提取的成骨细胞产量多;细胞存活率高(P<0.01);对细胞损伤小,细胞纯度高.消化时问易于控制.结论 分段胶原酶消化法是一种方便、高效、细胞生物学特性稳定的原代成骨细胞分离培养方法.

Abstract：

Objective To confirm an alternative method for primary culture of osteoblasts through comparison of two primary culture methods. Methods Calvarias were dissected from newborn Kunming mice, osteoblasts were isolated with serum-containing collagenase digestion method and sequential digestion method respectively. The osteoblasts were observed under invert microscope, the growth curve was made with the application of MTT method, the rate of living osteoblasts was counted with trypan blue method respectively. Results Compared with the serum-containing collagenase digestion method, the sequential digestion method presented higher production of osteoblasts, higher cell survival rate (P<0.01), little damage on osteoblasts and easier control of the digestion time. Conclusion The sequential digestion of calvaria method is simple, efficient and stable for primary osteoblasts culture.     

混合酶消化法大鼠颅盖骨细胞的原代培养和鉴定

目的通过不断的摸索,寻找一种获得细胞数量较多且纯的原代成骨细胞的体外培养方法,为下一步实验研究奠定基础。方法取出生24h内的sD大鼠脱臼处死,取出颅盖骨,剪成1mm×1mm×1mm大小的组织片;采用胰酶和I型胶原酶混合酶消化法分离获得原代成骨细胞;采用“差速贴壁法”进行纯化。通过对细胞形态学的镜下观察,碱性磷酸酶染色及I型胶原免疫组化法等对细胞进行鉴定。结果镜下观察所获得的细胞具有成骨细胞的典型特征,细胞多为单核,呈三角形、多边形、长梭形等形态,并伸有粗大伪足;碱性磷酸酶染色及I型胶原免疫组化染色呈阳性。结论采用混合酶消化法可获得数量较多且活性较好的细胞,再采用“差速贴壁法”可以去除成纤维细胞等杂质细胞,获得纯度较高的成骨细胞。     

胎盘Hofbauer细胞的体外培养和鉴定

目的 通过对早孕胎盘绒毛膜Hofbauer细胞的分离,纯化和培养,寻找一种稳定、简便的,可获得较高纯度Hofbauer细胞的培养方法,以满足后续实验要求.方法 通过胰酶/胶原酶联合消化法对妊娠6～10周绒毛组织进行消化,获得单细胞悬液,根据不同细胞贴壁时间的差异,对Hofbauer细胞进行纯化,并通过免疫组织化学法对Hofbauer细胞进行鉴定.结果 获得了较高纯度的胎盘Hofbauer细胞,免疫组化法鉴定CD68阳性,细胞生长状态良好.结论 利用胰酶/胶原酶联合消化法及差异贴壁法可以获得满意的人胎盘Hofbauer细胞.     

福建水华微囊藻粗毒素对原代培养大鼠肝细胞毒性作用的初步研究

[目的]用直接分离法进行大鼠肝细胞体外培养．研究微囊藻毒素的毒性。[方法]以大鼠作为肝细胞供体,用直接分离法制备肝细胞,进行原代培养后加入不同浓度的藻毒素;在培养的不同时期用台盼蓝排斥法计算贴壁的活细胞数及存活率,用倒置显微镜观察肝细胞形态变化。[结果]①不同浓度的藻毒索对大鼠肝细胞具有毒性作用,呈现出剂量一反应关系。②直接分离法可得到大量单个分散的肝细胞,细胞数量能够满足毒理学的实验要求,在41h内细胞生长较好,适于进行细胞毒理学的实验;65h后肝细胞功能和活力欠佳,不适于实验。[结论]微囊藻毒素对体外培养的肝细胞有毒性作用;直接分离法获取肝细胞进行原代培养的方法可用于短期细胞毒理学的实验研究。     

大鼠肾细胞分离制备及培养方法的比较

目的比较胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法和胶原酶、胰蛋白酶两步消化法(简称两步消化法)对大鼠肾细胞分离效果及细胞产量的影响,以及不同培养基(MEM、RPMI1640)、鼠龄(乳鼠、成年鼠)对细胞产量、质量、增殖率和乳酸脱氢酶(LDH)漏出量的影响。方法分别对两组Wistar大鼠(乳鼠和成年鼠)用三种不同的消化方法制备大鼠肾组织细胞悬液,分别在MEM培养液和RPMI1640培养液中原代培养,培养48小时之后第一次传代,观察细胞质量,计算细胞产量,MTT法检测传代细胞24~48小时之间的增殖率,生化分析仪检测传代细胞第1~7天培养液中LDH漏出量。结果胶原酶消化法和两步消化法的肾细胞产量显著高于胰蛋白酶消化法(P<0.01),两步消化法的细胞质量优于胶原酶消化法,MEM培养液和RPMI1640培养液对细胞产量、增殖率和LDH漏出量的影响均无显著性差异,乳鼠的肾细胞产量显著高于成年鼠(P<0.01)。结论两步消化法对于肾细胞的分离制备尤为适合,MEM培养液和RPMI1640培养液均适于肾细胞的培养,乳鼠比成年鼠更适合肾细胞的制备。     

改良大鼠心脏微血管内皮细胞的培养方法及鉴定

目的 建立一种分离大鼠心脏微血管内皮细胞的方法.方法 雄性SD大鼠2只,快速取出心脏,去除左室外约1/4层,充分剪碎剩余组织,Ⅱ型胶原酶和胰酶先后消化20~30 min,过滤并离心收集细胞,加入培养液置于细胞培养箱中培养.结果 原代细胞基本于接种后1~2 h已大部分贴壁,24 h细胞充分伸展,并进入对数生长期,细胞增殖迅速,培养3 d时,可见细胞汇合度达80%~90%,细胞长至融合后呈典型的＂铺路石＂或＂鹅卵石＂征.免疫细胞化学鉴定表明在分离培养的大鼠心脏微血管内皮细胞中有特定Ⅷ因子及CD31表达,体外小管形成实验证明大鼠心脏微血管内皮细胞具有小管形成的能力.原代周期3~4 d,传代周期2~3 d,P2代细胞纯度达95%以上.传至P4代仍未见细胞形态及分裂增殖活性下降.结论 本方法培养大鼠心脏微血管内皮细胞简单有效,重复性好,且获得细胞数量多、纯度高,有利于实验人员掌握.     

Epithelial-fibroblast interactions in bleomycin-induced lung injury and repair.

Intercellular communication between epithelial cells and fibroblasts of the alveolar wall contributes to regulatory control of each cell type. We examined whether lung injury and subsequent fibrosis are associated with disturbance of this mutual control system. Rats received bleomycin intratracheally, and after 10 days, when acute epithelial injury occurs, and at 6 weeks, when repair with fibrosis is found, pure populations of type 2 epithelial cells and lung fibroblasts were prepared to study interactions with respect to growth control. Epithelial cells were cultured alone, on a permeable filter over fibroblasts, and in co-culture with fibroblasts. The results showed that the low growth rate of normal epithelial cells increased when cells were exposed to fibroblast supernatants. This effect was also seen using cells from the 10-day bleomycin group, but it was diminished in the group treated for 6 weeks. However, epithelial cells from exposed or control rats did not show increased DNA synthesis when grown in contact with fibroblasts in co-culture. In contrast, fibroblast growth was inhibited when exposed to epithelial cell secretions in control cultures and when using cells from the 10-day bleomycin group. No inhibition of fibroblast growth by epithelial cells was found using cells from the fibrotic lungs. These results suggest that after lung injury by bleomycin, a fibroblast-secreted factor promotes epithelial growth; however, during repair, regenerating epithelial cells lose the ability to inhibit fibro-blast proliferation. These local changes in cellular control at the alveolar wall may be sufficient to produce pulmonary fibrosis.     

EGF、bFGF对促进人毛乳头细胞生长及分化的影响

目的 探讨EGF、bFGF对促进人毛乳头细胞生长及分化的影响.方法 实验组培养基加入EFG、bFGF和3H-胸腺嘧啶,对照组培养基加入3H-胸腺嘧啶,采用闪烁计数器检测的方法,观察两组人毛乳头细胞的增殖情况,采用流式细胞仪检测两组人毛乳头细胞分化为成纤维细胞的情况.结果 实验组人毛乳头细胞放射性闪烁计数均数、成纤维细胞的特异性蛋白1（FSP1）阳性率与对照组相比有统计学差异（P＜0.05）.结论 EFG、bFGF能促进人毛乳头细胞的生长、增殖,并向成纤维细胞定向分化.     

梗阻性肾病成纤维细胞体外增殖规律的初步实验研究

[目的]初步探讨梗阻性肾病人肾间质成纤维细胞体外培养的增殖规律。[方法]取慢性梗阻性肾病(UUO)患者手术切除标本取材,体外培养1～7代细胞,在不同时间点,用相差倒置显微镜观察细胞形态变化;通过免疫细胞化学方法对体外培养细胞进行鉴定;用MTT比色法检测体外培养第3代成纤维细胞的吸光光度值。[结果]原代培养5～7 d后,组织块周围开始长出数目不等的立方形或长梭形细胞;大约2～3周后,以占绝对优势的长梭形细胞可铺满瓶底。第2～5代细胞形态较为均一,多呈长梭形,胞浆丰富,核1～2个不等,偶见核仁,细胞呈栅栏状排列,周围有长短不一的轴状突起,并有无定性成分分布于4周。第6、7代细胞形态变化较大,细胞多数呈圆形或椭圆形,长梭形细胞数量减少,部分细胞形态不规则,胞内出现空泡和(或)颗粒状物质等细胞衰老、变性的形态改变。免疫细胞化学检测第2代细胞表达波形蛋白(vimentin)强阳性,角蛋白(keratin)散在灶性个别细胞弱阳性;第3～6代细胞均表达波形蛋白强阳性,结蛋白(desmin)和角蛋白阴性。传3代细胞MTT结果显示第3～5 d增殖速度最快,d 7细胞数量达到高峰,d 9后细胞生长相对稳定。[结论](1)用组织块培养法在体外顺利培养出梗阻性肾病来源的hRIFs。(2)传3～5代hRIFs纯度高、活性佳,于接种培养后3～5 d进入对数增长期,体外实验研究选择该时期的hRIFs较好。     

自然流产胚胎绒毛细胞培养方法比较

目的:探讨自然流产胚胎绒毛细胞培养的简单有效方法。方法:取57例早期自然流产胚胎绒毛组织分别采用改良组织块培养法和酶消化法进行培养。结果:改良组织块培养法培养成功51例(89.5%),酶消化法培养成功42例(73.7%),两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:改良组织块培养法用于自然流产胚胎染色体诊断简单可行,成功率高。     

子宫腺肌病病灶细胞的培养与鉴定

目的原代培养及鉴定子宫腺肌病病灶细胞，为研究子宫腺肌病发病机制与药效学提供新的理想实验模型。方法采用胶原酶消化法对人子宫腺肌病细胞进行原代培养，并采用免疫细胞化学技术鉴定。结果成功培养了6例子宫腺肌病细胞并均经免疫细胞化学法鉴定证实，成功率为75％；第1代与第8代细胞的生长曲线基本一致。结论胶原酶消化法培养的子宫腺肌病细胞性能稳定，后续研究可选择3～6代细胞作为药物干预模型，细胞传代后4—5天加药物干预，选择24小时作为药效学作用的检测时间点。     

乳鼠心肌细胞原代培养方法

目的:探讨新生乳鼠心肌细胞原代培养的条件和方法,培养纯度高、存活时间长的心肌细胞。方法:参照Simpson等的方法加以改进,采用含0.05%EDTA的胰蛋白酶多次消化心肌,差速贴壁1.5 h纯化心肌细胞进行培养,培养过程在37℃、5%CO2条件下进行。用台盼蓝染色法检测培养细胞的存活率,倒置显微镜下观察细胞形态变化,记录3 d、6 d、9 d、12d心肌细胞搏动频率,测定细胞活力。结果:原代培养乳鼠心肌细胞生长良好,培养3 d、6 d、9 d、12 d时,用台盼蓝染色法检测心肌细胞的存活率均大于96%,培养12 d时仍为97.02%。在倒置显微镜下观察,培养48 h左右的细胞之间相互连接的并有细胞搏动。培养6 d、9 d、12 d的细胞与培养3 d的相比,活力增强,差异显著(P<0.05),从6 d开始,细胞活力并未显著增强,两两比较均无统计学差异(P>0.05)。结论:应用此方法培养的心肌细胞纯度高,存活时间长,是一种稳定、可靠的原代心肌细胞培养方法。     

卵巢癌相关成纤维细胞和正常卵巢成纤维细胞的基因表达差异

目的:对卵巢癌相关成纤维细胞(Carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)及卵巢正常成纤维细胞(Normalfibroblasts,NFs)进行分离、培养、纯化,并分析两者多种基因表达的差异。方法:①用组织块贴壁培养法获得原代卵巢癌CAFs和卵巢NFs,通过胰酶消化法和反复传代法进行细胞的纯化;②观察细胞形态,多种基因的免疫细胞化学染色检测及相应mRNA的半定量分析,对CAFs和NFs进行初步鉴定;③应用RT-PCR的方法对CAFs和NFs中多种基因进行分析比较。结果:①获得了纯化的卵巢CAFs和NFs;②卵巢CAFs的细胞免疫化学染色α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色呈阳性,角蛋白呈阴性,卵巢NFs波形蛋白(Vimentin)阳性,而α-SMA和细胞角蛋白阴性;③卵巢CAFs与NFs中Vimentin与α-SMA的mRNA发现均有表达,但CAFs中表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);④与NFs相比,CAFs中多种mRNA的表达增加,其中包括生长因子,血管生成促进因子,细胞因子等。结论:与NFs相比,CAFs在mRNA、蛋白表达等方面均有统计学差异;卵巢癌中CAFs基因表达的检测表明,其基因表达有显著变化,提示这些成纤维细胞可能为卵巢癌细胞的生长提供了最适合的微环境。推测卵巢-宿主界面微环境在上皮性卵巢癌的发展中可能起重要作用。     

胚胎干细胞在心肌样环境中向心肌样细胞的分化情况

目的探讨心肌细胞促进胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)分化为心肌样细胞的诱导作用。方法收集小鼠3.5d胚龄的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,4～5d后取内细胞团接种在饲养层上分离培养出ESCs。取3～5代ESCs,先将ESCs悬浮培养形成2～3d的拟胚体(embryoid bodies,EBs),再与新生大鼠心肌细胞共培养诱导向心肌细胞分化,相差显微镜下观察分化细胞的形态学变化,免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T(TnT)、а-肌动蛋白(а-Actin)的表达。结果诱导d3起可见自发性、有节律跳动的拟胚体出现,12d时共培养组约有93%的拟胚体出现节律性收缩,显著高于对照组,均表达心肌细胞特异性蛋白cTnT、а-actin,心肌细胞直接接触诱导组其分化比率达56.5%,分化的细胞形态较单一。结论心肌细胞与胚胎干细胞直接接触能促进胚胎干细胞向心肌细胞分化。     

矽肺肺泡巨噬细胞对人胚肺成纤维细胞Ⅰ型胶原表达的体外研究

目的探讨矽肺患者的肺泡巨噬细胞(AM)是否通过影响肺成纤维细胞(FB)胶原的表达,参与矽肺纤维化的发生发展。方法收集矽肺患者AM,经SiO_2体外刺激18 h收集培养上清,与人胚肺FB共同孵育6、12、18、24、36、48、72 h,用~3H-脯氨酸掺入检测48 h胶原的合成与分泌,免疫细胞化学方法、Western blot方法检测各时间点Ⅰ型胶原表达。结果经SiO_2刺激矽肺患者AM培养上清,可使FB中Ⅰ型胶原的表达增高,实验组48 h细胞内、外3H-脯氨酸掺入值分别为1259.500±73.879、790.500±70.315,免疫细胞化学染色的积分光密度值为0.341±0.011,Western blot条带扫描灰度值为14.218±0.342,均明显高于空白对照组及AM对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论SiO_2可通过AM介导影响FB中Ⅰ型胶原表达,参与肺纤维化的形成。