Omi/HtrA2在大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧模型凋亡中的作用

目的研究在大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡模型中Omi/HtrA2的表达,并观察抑制Omi/HtrA2表达后细胞凋亡的变化。方法用脂质体介导的基因转染方法将Omi/HtrA2的特异性shRNA表达载体251(Pgenesil-1/Omi/HtrA1 shRNA1)和252(Pgenesil-1/Omi/HtrA2 shRNA2)及阴性质粒HK(Pgenesil-1/HK)分别转入NRK-52E。应用Western印迹方法检测Omi/HtrA2及caspase3的表达,用DNA ladder检测各组细胞发生凋亡的情况。结果带有绿色荧光的NRK-52E即为成功转染细胞;在Western blot结果显示:对照组在缺氧复氧后Omi/HtrA2表达较正常组明显增强,而在转251和252组Omi/HtrA2表达较对照组减弱(P<0.05),但251和252两组间差异无统计学意义。对照组caspase3的表达明显较正常组增强(P<0.05)。且在Omi/HtrA2被抑制的两组caspase3的明显较对照组(P<0.05)。DNA ladder也显示:在对照组出现典型的DNA条带。251和252组条带减弱。结论通过RNA干扰技术成功抑制了Omi/HtrA2缺氧/复氧模型中Omi/HtrA2的表达,从而抑制了凋亡的发生。     

Omi/HtrA2在大鼠肾缺血-再灌注损伤诱导的细胞凋亡中的作用

目的探讨促凋亡因子Omi/HtrA2在大鼠肾缺血-再灌注损伤诱导的细胞凋亡中的作用。方法雄性Wistar大鼠随机分为假手术组[给空溶剂二甲基亚砜(DMSO)]、模型1组和模型2组(分别于再灌注1h时及再灌注前10min给予空溶剂DMSO)、阻断剂1组和阻断剂2组(分别于再灌注1h时和再灌注前10min给予Omi/HtrA2特异性阻断剂Ucf-101)。双侧肾动脉夹闭45min再灌注24h制作动物模型。原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡;Western印迹法检测肾组织匀浆中Omi/HtrA2蛋白质表达;比色法检测肾组织匀浆中caspase-3活性。结果肾缺血45min再灌注24h后,肾小管上皮细胞凋亡数目明显增加,同时肾组织中Omi/HtrA2表达及caspase-3活性显著增高。再灌注前10min给予Ucf-101,抑制Omi/HtrA2的表达,caspase-3活性显著降低,细胞凋亡明显减轻。再灌注1h时给予Ucf-101阻断Omi/HtrA2的表达,caspase-3活性及细胞凋亡的变化不明显。结论促凋亡因子Omi/HtrA2在肾缺血-再灌注损伤诱导的细胞凋亡中发挥重要作用,在再灌注前10min阻断Omi/HtrA2的表达,可减轻肾缺血-再灌注损伤引起的细胞凋亡。     

中介素真核表达质粒的构建及其在大鼠近端肾小管上皮细胞中的表达

目的构建带有绿色荧光蛋白的中介素(IMD)真核表达质粒pIRES2-EGFP/IMD,并转染大鼠近端肾小管上皮细胞系(NRK-52E)。方法合成带有IMD基因片段的pMD19-TSimple/IMD质粒,将pMD19-TSimple/IMD质粒和pIRES2-EGFP载体双酶切之后进行高效连接,将IMD亚克隆至pIRES2-EGFP上,对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用FuGENEHD转染试剂转染NRK-52E细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白。提取细胞mRNA和蛋白,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测基因表达,Western检测IMD蛋白表达。结果经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP/IMD载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的NRK-52E细胞有绿色荧光蛋白的表达,经RT-PCR和Western测定分析,转染细胞IMD基因及蛋白的表达增加。结论pIRES2-EGFP/IMD载体构建成功,并在NRK-52E细胞内成功表达。     

风轮菜总黄酮联合miR-702-5p抑制物对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响

目的研究风轮菜总黄酮联合miR-702-5p抑制物对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响。方法实验设置对照组(Con,不作任何处理)、缺氧/复氧组(H/R,缺氧6 h,复氧3 h),H/R+药物-1组、H/R+药物-2组、H/R+药物-3组(6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml的风轮菜总黄酮+缺氧/复氧处理)、H/R+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC+缺氧/复氧处理)、H/R+anti-miR-702-5p组(转染anti-miR-702-5p+缺氧/复氧处理)、H/R+药物-3+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC+25μg/ml风轮菜总黄酮+缺氧/复氧处理)、H/R+药物-3+anti-miR-702-5p组(转染anti-miR-702-5p+25μg/ml风轮菜总黄酮+缺氧/复氧处理)。蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(P21)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达;细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡;试剂盒检测丙二醛(MDA)含量及乳酸脱氢酶(LDH)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-702-5p表达水平。结果缺氧/复氧诱导的心肌细胞中P21、Caspase-3表达水平升高,细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,MDA含量升高,LDH活性升高,CAT、SOD活性降低。不同浓度风轮菜总黄酮处理后P21、Caspase-3表达水平降低,细胞存活率升高,细胞凋亡率降低,MDA含量降低,LDH活性降低,CAT、SOD活性升高。抑制miR-702-5p表达可抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤。风轮菜总黄酮联合miR-702-5p抑制剂可显著提高细胞存活率,抑制细胞凋亡和氧化应激反应。结论风轮菜总黄酮联合miR-702-5p抑制物可保护心肌细胞免受缺氧/复氧引起的损伤。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对心肌细胞缺氧/复氧损伤的抑制作用及其机制

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的抑制作用及其机制。方法体外培养H9c2心肌细胞,随机分为正常(N)、缺氧/复氧(H/R)、EGCG低剂量(L)、中剂量(M)和高剂量组(H),共5组(n=6)。建立细胞缺氧/复氧模型,给予EGCG预处理,用CCK-8法测定细胞存活率;Annex V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;按照试剂盒说明书检测细胞培养液T-AOC、TNF-α含量;用Western blot法检测Akt蛋白及磷酸化水平;用荧光定量PCR法检测PI3K、Akt、caspase-3基因表达。结果与模型组相比,EGCG能增加H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤后的存活率,减少细胞凋亡,提高T-AOC水平,降低TNF-α含量,增加PI3K、Akt和p-Akt表达,减少caspase-3的表达。结论 EGCG通过影响PI3K/Akt信号通路,减少细胞凋亡,保护心肌细胞。     

米非司酮诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及对OMI/HTRA2蛋白的影响

目的观察米非司酮、Omi/HtrA2对人宫颈癌Hela细胞凋亡的作用,探讨在宫颈癌HeLa细胞中米非司酮对Omi/HtrA2的影响。方法①对Omi/HtrA2重组质粒DNA的提取;②通过细胞转染,利用共聚焦显微镜观察Omi/HtrA2在细胞内的表达和定位;③应用流式细胞仪方法研究米非司酮、Omi/HtrA2对宫颈癌Hela细胞凋亡的作用。结果①融合蛋白EGFP-Omi/HtrA2、DsRed2-Omi/HtrA2在HeLa细胞中的定位为弥漫分布在细胞核和细胞浆;②米非司酮（40umol.L-1）促进Hela细胞凋亡,凋亡率为（46.16%）,转染pDsRed2-Omi/HtrA2凋亡率为32.69%,米非司酮＋转染质粒pDsRed2-Omi/HtrA2的凋亡率为78.85%。结论米非司酮能够促进HeLa细胞凋亡,DsRed2-Omi/HtrA2融合蛋白能够促进HeLa细胞凋亡,米非司酮能增加Omi/HtrA2促凋亡作用,Omi/HtrA2与米非司酮在HeLa细胞凋亡中存在协同作用。Omi/HtrA2可能是治疗宫颈癌的一个新靶点,米非司酮可能成为治疗宫颈癌的新方法。     

黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的作用

目的观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关基因caspase-3表达的影响。方法取原代培养8 d的大鼠海马神经元,随机分为4组:正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪注射液溶剂对照组和黄芪注射液组。除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5 h,再复氧复糖。各组于复氧复糖后0、0.5、2、6、24、48、72 h和120 h采用免疫组织化学染色法和Western blot检测caspase-3蛋白的表达,采用原位杂交检测海马神经元caspase-3 mRNA的表达。结果免疫组化结果显示:与正常对照组相比,除0 h和0.5h之外,缺氧缺糖/复氧复糖组各时间点海马caspase-3阳性神经元数目占神经元总数的百分率均明显增多(P<0.05),于24 h达到高峰。黄芪注射液溶剂对照组以上指标的变化趋势与缺氧缺糖/复氧复糖组相一致。黄芪注射液组除0 h和0.5 h之外,各时间点以上指标均比缺氧缺糖/复氧复糖组减少(P<0.05)。Western blot检测结果显示:除0 h和0.5 h外,各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元caspase-3蛋白的平均灰度值均较正常对照组明显增加(P<0.05),24 h最高;与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点caspase-3蛋白的平均灰度值无变化(P>0.05),而黄芪注射液组除0 h和0.5 h外,在各个时间点caspase-3蛋白的平均灰度值明显降低(P<0.05)。原位杂交检测结果显示:caspase-3 mRNA阳性神经元形态、数目占神经元总数的百分率的变化趋势与caspase-3蛋白的变化趋势完全一致。结论黄芪注射液可抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关基因caspase-3的表达,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的凋亡。     

Survivin基因沉默对裸鼠人卵巢癌细胞移植瘤凋亡的影响

目的探讨survivin基因沉默对人卵巢癌细胞株SKOV3裸鼠移植瘤凋亡的影响。方法将重组survivin shRNA plasmid转染人卵巢癌细胞株SKOV3细胞,通过裸鼠移植瘤实验比较survivin基因沉默对裸鼠移植瘤的生长抑制作用,荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法检测与凋亡密切相关的cytochrome-c、caspase-9和caspase-3基因的表达。结果裸鼠移植瘤实验显示,与对照组(空载体组和未转染组)相比,survivin shRNA plasmid转染组人卵巢癌细胞株SKOV3细胞生长速度减慢,肿瘤体积缩小(P<0.05);荧光定量PCR和蛋白印迹法结果都显示,与对照组相比,survivin shRNA plasmid转染组cytochrome-c、caspase-9和caspase-3的表达明显升高(P<0.05)。结论 survivin基因沉默可通过促进肿瘤细胞的凋亡而抑制裸鼠移植瘤生长。     

牛磺酸对肾NRK-52E细胞缺氧/复氧损伤的保护及初步机制

目的观察牛磺酸(Tau)对NRK-52E细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的保护作用及初步机制。方法用NRK-52E细胞缺氧8 h复氧12 h培养建立了H/R模型,流式细胞仪检测凋亡率和胞内游离钙离子浓度,RT-PCR和Western blot检测GRP78、Caspase-12、Caspase-3 mRNA和蛋白表达。结果与对照组比较,H/R组细胞凋亡率上升,GRP78、Caspase-12及Caspase-3 mRNA和蛋白表达均明显增高(P<0.01),胞质游离钙离子浓度也升高(P<0.01);与H/R组比较,各浓度牛磺酸处理组的细胞Caspase-3活性和凋亡率明显下降,胞质游离钙和GRP78、Caspase-12及Caspase-3 mRNA和蛋白表达均有明显降低(P<0.01)。结论牛磺酸对NRK-52E细胞H/R损伤有较好的抑制作用,且呈一定的剂量依赖性,其机制可能是调节胞内钙稳态、抑制GRP78、Caspase-12及Caspase-3表达,减少了细胞凋亡。     

贝那普利对氧化低密度脂蛋白诱导的肾小管上皮细胞间质转化及转化生长因子-β/Smad通路的影响

目的探讨贝那普利对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的肾小管上皮NRK-52E细胞间质转化(EMT)及转化生长因子-β(TGF-β)/Smad通路的影响。方法体外培养NRK-52E细胞,分为对照组、ox-LDL组(50μg/mL ox-LDL)、贝那普利组(50μg/mL ox-LDL+10μmol/L贝那普利)、TGF-β1组(50μg/mL ox-LDL+5 ng/mL TGF-β1)、贝那普利+TGF-β1组(50μg/mL ox-LDL+5 ng/mL TGF-β1+10μmol/L贝那普利)。高倍光学显微镜观察各组NRK-52E细胞表型变化;免疫荧光染色法检测EMT标志性蛋白α-SMA、E-cadherin荧光强度;免疫印迹法检测各组NRK-52E细胞中α-SMA、E-cadherin蛋白及TGF-β/Smad通路蛋白表达水平。结果与对照组比较,ox-LDL组梭形或不规则形细胞增多,α-SMA荧光强度及α-SMA、TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白量显著升高(P0.05);E-cadherin荧光表达强度减弱,蛋白量明显降低(P0.05)。与ox-LDL组比较,贝那普利组细胞表型改变明显减轻,α-SMA荧光表达强度明显减弱,α-SMA、TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白量显著降低(P0.05),E-cadherin荧光表达强度及蛋白量明显升高(P0.05);TGF-β1组细胞α-SMA荧光表达强度及α-SMA、TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白量显著升高(P0.05),Ecadherin荧光表达强度及蛋白量明显降低(P0.05)。与贝那普利组比较,贝那普利+TGF-β1组细胞α-SMA荧光表达强度明显增强,α-SMA、TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白量显著升高(P0.05),E-cadherin荧光表达强度及蛋白量明显降低(P0.05)。与TGF-β1组比较,贝那普利+TGF-β1组细胞α-SMA荧光表达强度及α-SMA、TGF-β1、pSmad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白量显著降低(P0.05),E-cadherin荧光表达强度及蛋白量明显升高(P0.05)。结论贝那普利可逆转ox-LDL诱导的肾小管上皮NRK-52E细胞间质转化的发生,机制可能是通过抑制TGF-β/Smad通路活化而发挥作用。     

Omi/HtrA2抑制剂对肾脏缺血再灌注损伤诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的研究Omi/HtrA2抑制剂(UCF-101)对大鼠肾脏缺血/再灌注(I/R)损伤诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法雄性Wistar大鼠随机分为5组:假手术组(DMSO)、模型1组(I/R+R前DMSO)、模型2组(I/R+R后DMSO)、治疗1组(I/R+R前UCF-101)和治疗2组(I/R+R后UCF-101)。双侧肾动脉夹闭45min再灌注24h制作动物模型;比色法测定血清肌酐和尿素氮浓度;Western blot法检测肾组织中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-9的蛋白质表达;原位末端标记TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡。结果肾脏缺血45min再灌注24h后,大鼠肾功能明显减退(P<0.05);肾组织中caspase-3、caspase-9蛋白质表达显著增加(P<0.05),大量肾小管上皮细胞凋亡(P<0.05)。再灌注前给予UCF-101能显著改善肾功能(P<0.05),并显著下调caspase-3、caspase-9蛋白质表达(P<0.05),减轻肾小管上皮细胞凋亡(P<0.05),而再灌注后给药不能改善肾功能及caspase-3、caspase-9蛋白质的表达(P>0.05)。结论再灌注前给予UCF-101能抑制肾脏I/R损伤诱导的肾小管上皮细胞凋亡,对肾脏I/R损伤具有保护作用。     

PITX2 shRNA对卵巢癌细胞H08910裸鼠移植瘤凋亡的影响

目的探讨PITX2基因沉默对人卵巢癌细胞株H08910裸鼠移植瘤凋亡的影响。方法将重组PITX2 shRNA plasmid转染人卵巢癌细胞株H08910细胞,通过裸鼠移植瘤实验观察PITX2基因沉默对裸鼠移植瘤的生长抑制作用,同时,利用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法检测PITX2基因沉默对caspase-3、cytochrome-c和caspase-9表达的影响。结果与对照组(空载体组和未转染组)相比,PITX2 shRNA plasmid转染组人卵巢癌细胞株H08910细胞生长速度减慢,肿瘤体积缩小(P<0.05),而且caspase-3、cytochrome-c和caspase-9的表达明显升高(P<0.05)。结论 PITX2基因沉默可通过促进肿瘤细胞的凋亡而抑制裸鼠移植瘤生长。     

激活素A及卵泡抑素对肾小管上皮细胞转分化的作用

目的探讨激活素A(ACTA)对大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)转分化的影响及卵泡抑素(FS)的干预作用。方法 NRK-52E细胞生长于达氏修正伊氏培养基(DMEM)/F12培养基。实验A:将培养的NRK-52E细胞按rh-ACTA浓度不同分为4组:ACTA浓度分别为0,1,10,100ng/ml。实验B:分为4组:对照组;ACTA组(A组),rh-ACTA浓度10ng/ml;rh-FS组(F组),rh-FS浓度为100ng/ml;ACTA+FS组(A+F组):rh-ACTA浓度10ng/ml,rh-FS浓度为100ng/ml。24h后收集各组细胞及细胞上清液。蛋白印迹法检测各组细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤维连接蛋白(FN)的表达;酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞上清液转化生长因子-β(TGF-β)的含量。结果 ACTA能剂量依赖性刺激肾小管上皮细胞α-SMA及FN的表达(P<0.05),而对TGF-β的表达没有影响。FS能抑制ACTA的上述效应,而单纯FS对肾小管上皮细胞α-SMA及FN的表达无影响(P>0.05)。结论 ACTA能刺激NRK-52E细胞转分化及FN的合成;FS可通过阻断ACTA的上述效应产生有效的肾脏保护作用。     

The induction of reactive oxygen species and loss of mitochondrial Omi/HtrA2 is associated with S-nitrosoglutathione-induced apoptosis in human endothelial cells

The pathophysiological relevance of S-nitrosoglutathione (GSNO)-induced endothelial cell injury remains unclear. The main objective of this study was to elucidate the molecular mechanisms of GSNO-induced oxidative stress in endothelial cells. Morphological evaluation through DAPI staining and propidium iodide (PI) flow cytometry was used to detect apoptosis. In cultured EA.hy926 endothelial cells, exposure to GSNO led to a time- and dose-dependent apoptotic cascade. When intracellular reactive oxygen species (ROS) production was measured in GSNO-treated cells with the fluorescent probes 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein diacetate, we observed elevated ROS levels and a concomitant loss in mitochondrial membrane potential, indicating that GSNO-induced death signaling is mediated through a ROS-mitochondrial pathway. Importantly, we found that peroxynitrite formation and Omi/HtrA2 release from mitochondria were involved in this phenomenon, whereas changes of death-receptor dependent signaling were not detected in the same context. The inhibition of NADPH oxidase activation and Omi/HtrA2 by a pharmacological approach provided significant protection against caspase-3 activation and GSNO-induced cell death, confirming that GSNO triggers the death cascade in endothelial cells in a mitochondria-dependent manner. Taken together, our results indicate that ROS overproduction and loss of mitochondrial Omi/HtrA2 play a pivotal role in reactive nitrogen species-induced cell death, and the modulation of these pathways can be of significant therapeutic benefit.     

比色法检测Caspase-3相对活性

目的建立比色法检测Caspase-3相对活性的方法。方法以H9c2(2-1)细胞缺氧/复氧损伤为凋亡诱导模型,采用比色法检测Caspase-3相对活性,并使用吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色法进行平行的方法学比较。结果H9c2(2-1)细胞缺氧/复氧组与对照组相比Caspase-3相对活性升高了0.48倍,差异具有统计学意义(1.48±0.16 vs 1.00±0.06,P<0.01);缺氧/复氧组细胞经AO/EB染色出现凋亡的形态学特征。结论本研究成功建立了Caspase-3相对活性的比色检测方法,与试剂盒方法相比大大降低了检测成本,同时也为检测Caspases家族其他蛋白酶的活性提供了方法学依据。