登革病毒重组亚单位疫苗的构建及免疫原性分析

目的 构建登革病毒1～4型重组亚单位疫苗,分析重组疫苗的免疫原性.方法 利用连接肽将登革病毒1型与2型,3型与4型的外膜蛋白DⅢ基因片段连接在一起,克隆人原核表达载体pET-30a,在大肠埃希菌中表达DEN1/2型、DEN3/4型融合重组蛋白.重组蛋白经高效液相色谱柱分离纯化后,混和免疫小鼠,采用中和实验法测定血清中和抗体效价,同时进行乳鼠体内中和实验,观察中和抗体对乳鼠的免疫保护作用.结果 重组蛋白能诱导小鼠产生针对登革病毒1～4型的中和抗体,平均中和效价分别为1：34.9、1：45.3、1：24.7和1：38.4.中和抗体能保护新生乳鼠免受致死剂量DEN1～4的攻击,保护率分别为100%,100%,83%,83%.结论 构建的重组亚单位疫苗具有良好的免疫原性,能诱导小鼠产生中和抗体,为构建单一四价疫苗提供了实验室依据.     

登革病毒外膜蛋白DⅢ区融合基因真核表达载体的构建及免疫效果研究

目的:构建登革病毒外膜蛋白DⅢ区融合基因真核表达载体并分析其免疫原性.方法:利用连接肽将登革病毒1型与2型、3型与4型的外膜蛋白(E蛋白)DⅢ基因片段连接在一起,克隆人真核表达载体pCDNA3.1(+),构建DEN1/2型、DEN3/4型EDⅢ融合基因的二价真核表达载体,转染哺乳动物细胞BHK-21,用间接免疫荧光法和免疫印迹法鉴定目的蛋白的表达.将两种二价重组质粒混合形成四价DNA疫苗免疫小鼠,观察其免疫原性及诱导产生中和抗体的能力.结果:二价重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的蛋白,四价DNA质粒免疫小鼠,能诱导产生针对登革病毒1~4型的中和抗体,平均中和效价分别为l:24.7、1:26.9、1:13.4、1:16.0.结论:本研究构建的DNA质粒在小鼠模型中具有良好的免疫原性,为登革多价DNA疫苗的研究提供了可行性.     

人乳头瘤病毒L2 蛋白的病毒样颗粒疫苗研究

目的:构建乙肝病毒核心抗原(HBcAg)与人乳头瘤病毒(HPV)L2抗原的融合蛋白,在大肠杆菌中重组表达形成病毒样颗粒结构;通过小鼠模型检测HBc-L2融合蛋白的免疫原性,并研究免疫后获得的小鼠血清对HPV假病毒的中和效力。方法:通过DNA合成构建16型人乳头瘤病毒L2基因片段与HBcAg基因的融合基因,将其克隆至表达载体p ET9a并在大肠杆菌中进行HBc-L2融合蛋白表达;将经纯化、鉴定后的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA方法检测小鼠血清中针对L2抗原的抗体效价,并分别研究小鼠血清对16型和18型HPV假病毒的中和效力。结果:HBc-L2融合基因经大肠杆菌系统表达形成可溶性蛋白,经硫酸铵沉淀和CL-4B凝胶分离纯化后获得纯度80%的HBc-L2蛋白;分子筛高效液相色谱-多角度激光光散射(SEC-MALS)联用技术和透射电子显微镜的分析结果表明,HBc-L2融合蛋白在表达过程中自动组装形成稳定的病毒样颗粒;将纯化后的HBc-L2蛋白免疫BALB/c小鼠可获得针对L2抗原的高滴度抗体,且小鼠血清具有中和16和18型两种假病毒的中和抗体活性。结论:HBc-L2病毒样颗粒可以有效地增强L2抗原的免疫原性,并可刺激机体产生针对多型HPV的免疫保护力,是一个具有潜力的新型广谱HPV疫苗。     

一个能诱生戊型肝炎病毒中和抗体的ORF2编码蛋白短片段

目的：比较戊型肝炎病毒（HEV）第4基因型ORF2编码蛋白片段pN472-C617（aa472～617）和pN477-C613（aa477～613）的免疫原性，找到能诱生HEV中和抗体的ORF2编码蛋白的更短片段。方法：表达和纯化pN472-C617和pN477-C613，分别免疫BALB/c小鼠，以间接ELISA检测免疫血清的抗体效价，并以基于PCR的体外中和试验检测免疫血清的中和活性。结果：pN472-C617和pN477-C613可在大肠杆菌高效可溶性表达，纯化后的重组蛋白能在小鼠体内诱导出高效价的抗体。基于PCR的体外中和试验显示pN472-C617免疫血清可有效中和HEV，阻断其在敏感细胞表面的吸附和细胞内复制；而两端仅比pN472-C617各短5个氨基酸的pN477-C613的免疫血清不具有中和HEV的活性。结论：重组蛋白pN472-C617具有良好的抗原性和诱生中和抗体的能力，是目前文献报道中含有HEV中和抗原表位的最短ORF2编码蛋白片段，可作为重组亚单位候选疫苗用于HEV疫苗的开发。     

EGFRvIII/PEP-3 cDNA与HBcAg重组基因原核表达载体的构建、表达与免疫分析

目的:构建EGFRvIII与HBcAg重组基因的原核表达质粒,进行原核表达、纯化,观察表达蛋白的免疫原性和抗原性。方法:通过双酶切从pGEM-TEasy/PEP-3载体获得编码EGFRvIII突变区的cDNA片段,插入去除了主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/c-PEP-3-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET28a( )中,通过IPTG诱导蛋白表达,利用Ni2 -NTA亲和层析法对融合蛋白进行纯化;用融合蛋白常规免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、序列测定证实融合基因已插入pET28a( )载体中,融合基因序列与设计序列完全一致。原核表达后表达量占沉淀全菌蛋白的56%,纯化产物占总蛋白的92%,浓度约8g/L。BALB/c小鼠经4次免疫后,其血清中中和抗体的滴度可达1∶16000,第6次免疫后血清中中和抗体的滴度达到1∶2.56×105,抗PEP-3抗体滴度达到1∶1.28×105,抗HBcAg抗体滴度小于1∶4×103。结论:融合基因PEP-3-HBcAg在大肠杆菌中可获得高效表达,表达的融合蛋白可以诱导小鼠产生高滴度和高特异性中和抗体,从而为高表达EGFRvIII恶性肿瘤基因工程疫苗的研究奠定基础。     

EB病毒gp85 N端片段的原核表达与初步鉴定

目的：构建EB病毒基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。分析非糖基化的EB病毒包膜糖蛋白gp85N端截短片段的抗原性。方法：采用基因工程技术，以B95—8细胞（美洲绒猴外周血B淋巴细胞经EBV转化后的细胞系）培养上清为模板，用PCR扩增EB病毒的BXLF2基因N端片段。PCR产物经Hind Ⅲ和XhoⅠ双酶切，插入原核表达载体pGEX-5T中，构建pGEX5T-85N重组表达质粒，并在大肠杆菌BL21中诱导表达gp85N蛋白。纯化表达的蛋白用Westernblot鉴定，并免疫BALB／c小鼠。结果：序列分析表明，插入片段的序列与GenBank登录的参考序列完全一致。重组表达的蛋白的相对分子质量（Mr）约为45000，同预期的大小相符。以纯化的可溶性重组蛋白免疫BALB／c小鼠，经ELISA检测获得了高效价的抗血清，且抗gp85单克隆抗体（mAb）可识别所表达的gp85N抗原。Westernblot显示，该抗原可与小鼠免疫血清起特异性反应。结论：表达并纯化的EB病毒截短的gp85N重组蛋白具有良好的抗原性，为下一步分析所产生抗体的生物学特性提供了条件。     

Balb/c小鼠MBL-C糖识别域的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的 原核表达Balb／c小鼠肝型甘露聚糖结合凝集素（mMBL-C）糖识别域（CRD）并制备其多克隆抗体。方法应用PCR从含Baib／c小鼠MBL-C全长编码区基因的质粒pmMBL-C中扩增目的基因片段，构建重组表达载体，在大肠杆菌中表达。分离纯化表达产物并免疫动物，制备mMBL-C CRD的抗血清，采用ELISA和Western blot鉴定其效价和特异性。结果从pmMBL-C中扩增到约450bp的DNA片段，构建重组载体pET-CKS-mMBL-C-CRD和pET32a-mMBL-C-CRD，经酶切和测序鉴定，证实重组表达载体构建成功。将其导入大肠杆菌BL21（DE3）中表达，表达产物主要以包涵体的形式存在，相对分子质量（Mr）分别为44000和34000。利用pET-CKS载体表达产物免疫家兔，分离免疫血清后，使用pET32a（＋）载体表达产物进行ELISA及Westem blotting，显示多克隆抗体能够与mMBL-C CRD蛋白特异结合。结论获得了重组mMBL-CCRD蛋白及其多克隆抗体，为mMBL-C分子以及CRD的研究奠定了一定的基础。     

德国小蠊细胞色素P450 CYP4G19基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建细胞色素P450 CYP4G19基因部分片段的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备CYP4G19多克隆抗体。方法应用RT-PCR扩增CYP4G19基因部分片段,产物经T-A克隆、测序鉴定,亚克隆入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,镍离子亲和层析法纯化重组蛋白后,免疫小鼠,获得多克隆抗体,ELISA及Western-blot检测多抗的效价及特异性。结果从德国小蠊cDNA中克隆出一段771bp的亲水性基因片段,在大肠杆菌中诱导表达出约32000Mr、以包涵体形式存在的P450重组蛋白。将纯化、复性的重组蛋白免疫小鼠。得到了滴度高于1：10^6的高效价多克隆抗体。Western-blot显示此多抗能与32000Mr的重组蛋白特异结合,并能识别天然的德国小蠊微粒体P450蛋白。结论利用原核表达的CYP4G19融合蛋白具有良好的免疫原性。制备出效价高、特异性强的抗德国小蠊CYP4G19多克隆抗体,为下一步关于德国小蠊CYP4G19蛋白表达特性及其抗药性功能的深入研究提供了重要的实验工具。     

Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达、纯化及免疫效果评价

目的:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)进行表达,纯化后评价其免疫效果,以探索HSV-2重组亚单位疫苗的研制。方法:提取HSV-2DNA作为模板,用聚合酶链式反应(PCR)扩增gD2基因,克隆至pFastBac HTA载体中,利用载体中的His基因标记gD2,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达His-gD2融合蛋白,表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot检验,用镍柱进行纯化,免疫小鼠评价其免疫原性。结果:HSV-2gD2在昆虫细胞Sf9中得到特异性表达,纯化后的重组蛋白诱导小鼠体内产生高水平的IgG抗体及中和抗体。结论:gD2基因在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中获得表达,表达产物表现出良好的免疫原性及中和活性,为发展HSV-2亚单位疫苗奠定了基础。     

肺炎链球菌蛋白PspC的制备与鉴定

目的对肺炎链球菌表面蛋白C(PspC)进行全基因合成、重组表达、纯化制备和鉴定。方法根据Gen Bank中Psp C的基因序列和氨基酸序列,通过密码子优化和全基因合成的方式获得目的蛋白基因,构建无标签、高效重组表达菌株,建立重组蛋白的纯化制备方法,并进行抗原鉴定及免疫原性检测分析。结果人工合成的Psp C基因序列经鉴定与预期一致,目的蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量在30%以上,经两步纯化后纯度达到95%。重组蛋白能与肺炎链球菌阳性血清产生特异性抗原抗体反应,免疫小鼠后可诱导产生较高水平的蛋白特异性抗体。结论获得了重组肺炎链球菌蛋白Psp C,其具有与天然抗原相似的抗原性和免疫原性,为今后开展疫苗研制、载体蛋白应用等研究奠定基础。     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的：构建幽门螺杆菌（Hp）UreB-Ompll融合蛋白的重组疫苗候选株，在大肠杆菌中表达UreB-Ompll融合蛋白，并检测其免疫学活性。方法：用PCR方法扩增郑州分离坳菌株MEL-HP27的ureB和ompll基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-ompl1融合基因，将融合基因ureB-ompl1插入原核表达载体pET30a（＋）、pET28a（＋）及pMAL-c2X中，筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达，采用Westernblot对表达产物进行鉴定，并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白，应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析，纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠，Westernblot对免疫小鼠血清进行检测。结果：特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB—ompll克隆人表达载体pE330a（＋）、pET28a（＋）与pMAL—c2X中；重组菌TBl（pMAL-ureB—ompl1）经诱导获得了高效表达的MBP-UreB—Ompll融合蛋白，该融合蛋白可以被却免疫小鼠血清和却阳性患者血清中的相应抗体所识别，纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后，与纯化的融合蛋白进行杂交，结果显示在M，134000处出现特异杂交带，融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论：成功地构建并筛选出了却MELHP27融合蛋白UreB-Ompl1的重组疫苗候选株TBl（pMAL-ureB—ompll），为坳蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。     

PCR合成的A型肉毒毒素重链C端结合区基因的高效表达与免疫原性分析

目的 A型肉毒毒素重链C-端结合区（BoNT／AHc-C）的PCR拼接合成、重组表达与免疫原性分析。方法 经密码子优化软件对编码基因序列重新优化设计，以16条长片段寡核苷酸引物经重叠PCR合成BoNT／A Hc-C基因片段，插入表达载体pET-His，再转化大肠杆菌BL21（DE3）plys S中进行诱导表达，以金属螯合亲和层析法纯化重组蛋白，并进行鉴定和抗原性分析。结果 表达工程菌裂解液经SDS-PAGE分析，重组蛋白约占细胞总蛋白的65％，为包涵体形式，经亲和层析一步纯化和柱上复性获得纯度大于95％的可溶性重组蛋白，Western blot和ELISA均证明，该重组蛋白与抗天然BoNT／A马血清抗毒素有特异性结合反应，是BoNT／AHc-C抗原，且免疫小鼠可耐受10个LD50 BoNT／A的攻击。结论 所获重组BoNT／AHc-C蛋白具有良好的免疫原性，为研制基因工程疫苗奠定了基础。     

恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2的原核表达及多抗制备

目的克隆表达恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2亚基,制备多抗,为该蛋白的功能研究奠定基础。方法PCR扩增目的基因片段,克隆到表达载体pGEX．KG中,构建PjRPA2／pGEX-KG原核表达载体,IPTG诱导表达,SDS—PAGE电泳分析表达产物．谷胱甘肽柱纯化蛋白,Western blot检测其抗原性,以纯化的GST-PfRPA2免疫小鼠,制备抗tyRPA2的多抗．间接ELISA法检测鼠血清效价,Western blot鉴定多抗特异性。结果成功构建了重组踯PA2／pGEX．KG原核表达质粒,并在大肠杆菌中以可济眭形式高效表达,纯化表达产物,制备抗邸PA2的鼠多抗,效价为10-7,Western blot证实此抗体可识别恶性疟原虫内与PJRPA2蛋白位置对应的特异性条带。结论恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2亚基在大肠杆菌中获得可溶性高效表达,纯化表达产物能诱导小鼠生产能识别天然蛋白的特异性抗体。     

SARS冠状病毒S基因重组DNA诱导的体液免疫反应

目的 以严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）密码子优化的S、S1和S2基因分别构建其真核表达质粒，免疫BALB／c小鼠，以初步评价其诱导特异性体液免疫的效果。方法将人工合成密码子优化的S、S1和S2基因克隆入pcDNA4／HisMax-TOPO表达载体，重组质粒转染293T细胞，Western blot和免疫组化检测其真核表达，重组质粒免疫BALB／c小鼠，酶联免疫（ELISA）检测抗S蛋白抗体，伪病毒中和试验、细胞融合抑制试验检测中和抗体。结果3种重组质粒均可在真核细胞中获得表达，免疫小鼠后可诱导针对S蛋白的特异性抗体，抗体在12周观察期内呈持续上升趋势；其中，仅S和S1蛋白重组质粒能够诱导中和抗体的产生，以S蛋白的效价为高。结论密码子优化S和S1蛋白重组质粒可以有效诱导BALB／c小鼠产生中和抗体，其抗体可能具有阻断SARS-CoV侵袭易感细胞的能力。该结果为进一步研究SARS-CoV DNA疫苗提供了参考依据。     

B族链球菌C5a肽酶蛋白表位的克隆、表达和免疫学分析

目的应用生物信息学方法预测B族链球菌C5a肽酶蛋白表位，结合基因工程手段进行表位重组、表达和免疫原性分析。方法用预测程序ProPred和ANTIGENIC预测B族链球菌C5a肽酶蛋白的表位，应用PCR技术扩增出编码该表位基因片段，克隆PCR产物构建重组质粒，测序验证。在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达融合蛋白。表达的蛋白经质谱分析和Western blot鉴定。纯化该融合蛋白并免疫C57／BL小鼠，萃取GBS表面蛋白，双向琼脂扩散试验检测抗体水平。结果在SCPB中预测到1个既具有MHC结合肽特性又具有B细胞表位特征的肽段。重组和表达了这一肽段，质谱得出与SCPB蛋白的相似性分数为79，Western-blot证实能与抗SCPB的抗体反应，纯化后融合蛋白纯度〉90％。动物实验证实融合蛋白能产生特异性的抗GBS抗体。结论重组表位具有一定免疫原性。为相关蛋白的毒力机制研究和亚单位疫苗等方面的研究打下了良好的基础。     

间日疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化及免疫活性的鉴定

目的在大肠杆菌中表达间日疟原虫乳酸脱氢酶（PvLDH）与谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白，对重组蛋白进行纯化并测定其免疫活性。方法将构建的LDH／pGEX-4T-1重组菌BL21接种于LB培养基中，异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组融合蛋白的表达，重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清，ELISA检测血清效价，Western-blotting鉴定其免疫活性。结果重组质粒在大肠杆菌中表达PvLDH与谷胱甘肽S-转移酶（GST）的融合蛋白，表达产物主要以包涵体形式存在，经复性、纯化后免疫小鼠，能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答．ELISA法测效价为1：51200．Western-blotting结果显示该血清能特异性与间日疟和恶性疟患者全血发生反应．而不能与正常人起交叉反应。结论PvLDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性和免疫原性。     

跨膜区缺失的流感病毒M2蛋白表达纯化及其抗原性检测

目的 表达并纯化缺失跨膜区的流感病毒M2蛋白，并检测其抗原性。方法 利用RT．PCR方法从流感病毒A／PR／8／34（H1N1）的cDNA中扩增全长M2基因，利用两套引物扩增出缺失跨膜区26—43位氨基酸的sM2基因，并克隆到pET30a载体中表达融合蛋白，用镍柱纯化后的融合蛋白免疫小鼠获得抗血清，免疫荧光检测其抗原性。结果 sM2融合蛋白在大肠埃希菌中可高效表达，纯化后可获得高纯度的重组蛋白。免疫小鼠获得的血清进行免疫荧光检测，显示表达的融合蛋白有免疫原性。结论 跨膜区缺失的流感病毒M2融合蛋白与完整M2蛋白有相同的抗原性。     

破伤风毒素C片段的基因克隆、表达、纯化及免疫原性分析

目的　对破伤风毒素C片段进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性分析。方法　应用PCR技术直接从破伤风梭状芽孢杆菌的质粒DNA中扩增出 1370bp的破伤风毒素C片段(简称TTC)基因 ,将此基因片段插入到表达载体pET 2 2b( )中 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达。用阴离子交换层析和金属离子螯合亲和层析方法进行蛋白纯化后 ,参照《中国生物制品规程 2 0 0 0年版》的免疫攻击实验方法测定其效价。结果　经SDS PAGE分析 ,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的15 %。免疫印迹实验证实该重组蛋白是破伤风毒素C片段抗原。纯化得到纯度为 96 .5 %的重组蛋白 ,纯化回收率达 4 0 %。免疫攻击实验测定其效价为 18.70 6IU/mg,ED50 为 2 0 μg。经加强免疫 ,1μg免疫剂量即能产生足够的抗体保护动物免受破伤风毒素的攻击。结论　所获得的重组蛋白具有良好的免疫原性 ,为开发基因工程疫苗奠定了基础     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7 espA基因的克隆与表达

目的 通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7的EspA蛋白，并分析其免疫学性质。方法 采用PCR技术从EHEC O157：H7基因组中扩增espA基因，T／A法克隆，连接至pET-28a（＋）载体上，转化宿主细胞E．coli BL21（DE3），IPTG诱导表达，亲和层析法纯化目的蛋白，SDS-PAGE测定其相对分子质量，同时分析其N端氨基酸序列，免疫家兔鉴定其抗原性。结果 重组espA基因片段的测序结果与GenBank上基因序列只有1个碱基不同，一致性为99．83％，所编码的氨基酸序列没有改变。重组EspA蛋白在工程菌中以包涵体的形式表达，表达量约30％。免疫家兔所得抗体滴度为1：32。结论构建高效表达EspA蛋白的重组载体pET-28a（＋）-espA，表达的蛋白具有良好的免疫原性，为进一步制备亚单位疫苗奠定基础。     

HCV复合多表位抗原基因的克隆表达及其免疫学特性分析

目的构建丙型肝病炎病毒（HCV）截短C基因和多表位基因重组原核表达质粒，表达纯化融合蛋白，分析其免疫原性和抗原性。方法PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct；合成HCVE2区模拟表位与NS3～NS57个表位基因Em；分别将Ct、Em克隆人原核表达质粒pQE30，筛选阳性重组质粒pQE30-CtEm，转化E．coli M15，IPTG诱导融合蛋白表达，薄层扫描分析表达蛋白；可溶性分析后用Ni^2＋-NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白；Westernblot分析纯化蛋白的特异性和抗原性；纯蛋白免疫小鼠后分析其免疫原性。结果成功构建了HCV复合多表位抗原基因的原核表达质粒pQE30-CtEm，目的基因可高效表达，表达产物主要以包涵体形式存在，Ni^2＋-NTA纯化可获得目的蛋白，纯化蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。结论HCV复合多表位抗原基因融合蛋白可高效表达并得到纯化，该融合蛋白可作为HCV诊断抗原，也为丙型肝炎新型疫苗的研究提供了靶抗原。