结核分枝杆菌Rv2450蛋白诱导小鼠免疫应答的实验研究

目的:以原核表达的结核分枝杆菌Rv2450蛋白在小鼠体内诱导体液和细胞免疫应答。方法:采用皮下包埋的方法,以预先转移到硝酸纤维素膜上的原核表达的Rv2450蛋白免疫小鼠(10只)3次,每次间隔2周。用间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。末次免疫完成后4周,处死3只免疫小鼠并分离脾淋巴细胞,体外经PPD(2μg/孔)刺激后,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖指数。用ELISA法检测脾淋巴细胞悬液中IFN-γ、IL-10及IL-12的水平。结果:Rv2450蛋白免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶3200,淋巴细胞增殖指数为3.76±0.19。免疫小鼠脾淋巴细胞培养液中IFN-γ、IL-10及IL-12的含量,分别为(1740±19)ng/L、(678±15)ng/L、(469±13)ng/L,均高于各组的生理盐水对照组(P<0.05)。结论:Rv2450有可能作为新型结核疫苗的候选组分。     

EGFRvⅢ与HBcAg重组疫苗抗肿瘤作用的实验研究

目的:观察PEP-3/HBcAg融合蛋白疫苗的体内抗肿瘤作用。方法:BALB/c小鼠30只随机分成3组,分别接种PEP-3/HBcAg融合蛋白、HBcAg和生理盐水,待融合蛋白组小鼠体内抗体效价达到1:20000时终止免疫,于每只小鼠背部皮下种植阳性Renca细胞,2×105个/只。观察融合蛋白疫苗的抗肿瘤效应。采用HE染色和免疫组织化学图像分析法检测各组肿瘤组织的坏死情况和EGFRvIII表达水平。结果:融合蛋白组、HBcAg组和生理盐水组的成瘤率分别为50%、100%和100%。生理盐水组肿瘤生长速度最快,HBcAg组次之,融合蛋白组肿瘤出现最晚,生长速度最慢。融合蛋白组成瘤小鼠肿瘤平均质量显著小于生理盐水组和HBcAg组(t=4·731,P=0·044;t=6·890,P=0·040);后两组肿瘤质量无统计学意义(t=0·024,P=0·382)。HBcAg组和生理盐水组移植瘤呈不完全小片状坏死,融合蛋白组移植瘤呈大片状坏死,伴炎细胞浸润。融合蛋白组EGFRvⅢ表达水平明显低于生理盐水组和HBcAg组(t=3·157,P=0·006;t=2·539,P=0·021),后两者EGFRvIII表达水平无统计学差异(t=0·460,P=0·651)。结论:PEP-3/HBcAg融合蛋白疫苗能诱导机体产生保护性免疫反应,并具有抗肿瘤作用。     

基因工程鼠Muc1-MBP融合蛋白的制备及其免疫活性测定

目的:制备鼠Muc1-MBP融合蛋白,探讨其免疫活性.方法:将pMAL-Muc1转化大肠杆菌,通过IFTG诱导、SDS-PAGE和Western blot鉴定Mucl的表达,Amylose resin亲和层析纯化Muc1-MBP.将Muc1-MBP融合蛋白免疫小鼠,采用ELISA方法检测小鼠血清Muc1特异性抗体的水平;MTT法测定小鼠抗Muc1特异的CTL活性;ELISPOT法测定脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌.结果:获得稳定表达Muc1的菌株,制备了分子量67 kD较纯的Muc1-MBP融合蛋白.Muc1-MBP融合蛋白免疫小鼠产生高效价Muc1特异抗体,效价在8 000~16 000之间,Muc1-MBP融合蛋白可诱导CTL杀伤活性,对人乳腺癌MCF-7和小鼠Lewis肺癌LLC1靶细胞的杀伤率分别为(74.5±5.9)%和(60.5±10.4)%,与对照组比P<0.05,差异显著;Mucl.MBP融合蛋白免疫可诱导脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ,特异性活化Th1细胞.结论:成功制备莺组鼠Muc1-MBP融合蛋白,其不仅能诱导特异体液免疫应答,而且可诱导细胞免疫应答,尤其能诱导对人类MCF-7细胞较小鼠lewis肺癌LLC1细胞更加强烈的CTL杀伤活性,提示异种同源蛋白疫苗具有比同源蛋白疫苗更好的抗肿瘤作用.     

异种表皮生长因子受体胞外段的表达及其抗肿瘤效果研究

目的:构建异种EGFR蛋白疫苗并研究其抗肿瘤效果.方法:用PCR方法获得鸡EGFR胞外片段, 与pGEX- 4T-2载体连接, 并在E.coli BL21(DE3)中表达鸡的EGFR胞外片段与GST的融合蛋白, 融合蛋白经Ni2 亲和层析柱纯化、复性后, 免疫小鼠, 免疫3次后, 接种小鼠Lewis细胞, 观测肿瘤生长情况, ELISA检测小鼠血清中抗EGFR蛋白的抗体效价.结果:成功构建了EGFR胞外段基因的原核表达载体; SDS-PAGE显示成功表达了目的融合蛋白; 融合蛋白免疫小鼠后, ELISA法检测到特异性抗EGFR抗体; 实验组与对照组肿瘤体积的比较结果显示, 融合蛋白疫苗能够在一定程度上抑制肿瘤的生长.结论:异种EGFR蛋白能够克服免疫耐受问题, 诱导机体产生抗体, 有一定的抗肿瘤效果, 为后续的肿瘤疫苗研究打下了基础.     

结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠免疫应答及其保护力

目的:研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护能力。方法:用预先转移到硝酸纤维素膜条的ES-AT6-CFP10融合蛋白采用皮下包埋的方法免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。末次免疫后,取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后计数脾脏中的细菌数。结果:ESAT6-CFP10融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6400。淋巴细胞刺激增殖指数为1.90±0.15,明显高于生理盐水组(0.90±0.15);IFN-γ和IL-2的含量分别为1.792±19ng/L和0.211±11ng/L,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时融合蛋白诱导的脾细胞杀伤率为36%。与生理盐水免疫组(细菌负荷6.51±0.13)相比较,融和蛋白免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷为5.24±0.15,P<0.05),但与BCG免疫组相比脾脏中细菌负荷减少甚微。结论:ESAT6-CFP10融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分。     

连翘苷对Lewis肺癌VEGF和内皮抑素表达的影响

 目的: 探讨连翘苷对Lewis肺癌组织中血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成抑制因子内皮抑制素(endostatin)蛋白表达的影响。方法: 免疫组化染色检测临床收集的正常肺部组织、癌旁组织和肺癌组织样本中VEGF和endostatin的蛋白表达。设空白对照组10只,同时于40只小鼠右肢腋窝皮下接种Lewis瘤细胞,随机分为模型组、连翘苷低剂量组、连翘苷中剂量组和连翘苷高剂量组,每组10只。模型组每天1次灌胃等体积无菌水;连翘苷低、中剂量组每天灌胃5、10 g/kg连翘苷1次;高剂量组每天灌胃10 g/kg连翘苷2次。给药20 d后取肺部组织进行HE染色和免疫组化染色检测肿瘤组织形态学与肺部组织中VEGF和endostatin的蛋白表达。 结果: 临床样本中,与正常组织和癌旁组织相比,肺癌组织中的VEGF呈高表达,endostatin呈低表达。连翘苷随剂量增加可显著减少Lewis肺癌小鼠肿瘤体积和瘤组织密度;给予不同剂量连翘苷后,VEGF在肺癌组织中表达显著低于模型对照组,而endostatin表达则明显高于模型对照组。结论: 连翘苷通过下调VEGF的表达、上调endostatin的表达而发挥抑制肺部肿瘤发展的作用。     

重组基因c-Aβ-c的构建及其表达蛋白的免疫原性分析

目的:构建原核表达质粒pHGhis/c-Aβ-c,并在大肠杆菌中表达,观察融合蛋白c-Aβ-c的免疫原性,为阿尔茨海默病(AD)基因工程疫苗的研究打下基础。方法:采用PCR法,分别扩增编码HBcAg的1~71、88~144氨基酸的基因片断(HBc1~71和HBc88~144),以及编码淀粉样肽Aβ1-42的基因。将后者连接于HBc1~71和HBc88~144之间,构建重组质粒pGEMEX/c-Aβ-c,并将重组基因亚克隆于原核表达载体pHGhis中,构建表达质粒pHGhis/c-Aβ-c,通过温度诱导表达。用SDS-PAGE(考马斯亮蓝染色)检测融合基因的表达。以融合蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测小鼠血清中抗-Aβ抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、DNA序列测定证实,融合基因重组于表达质粒之中,表达质粒与理论设计相符。诱导表达后,表达蛋白约占细菌沉淀的16%。BALB/c小鼠经3次免疫后,其血清中抗-Aβ抗体的滴度可达1∶16000,且检测不到抗-HBcAg抗体。结论:c-Aβ-c融合基因在大肠杆菌中可高效表达,表达的融合蛋白具有较强的免疫原性。     

参慈胶囊联合顺铂抑制小鼠Lewis肺癌组织血管生成的机制研究

目的:探讨参慈胶囊及顺铂对Lewis肺癌组织生长及血管生成的抑制作用。方法:将40只C57BL/6小鼠自接种Lewis肺癌瘤株细胞建立实体瘤模型,随机分为参慈胶囊组、参慈胶囊+顺铂组、顺铂组、模型组。模型组予等量生理盐水,其余各组荷瘤小鼠均用药21 d,测量肿瘤重量并计算抑瘤率,采用免疫组化技术检测血管内皮生长因子(VEGF)、微血管密度(MVD)表达情况;采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测Lewis肺癌荷瘤小鼠癌细胞表达血管内皮生长因子受体-2(KDR)mRNA的情况。结果:(1)在抑瘤率方面,参慈胶囊+顺铂组抑瘤率明显高于其它3组,差异显著(P0.01)。(2)参慈胶囊+顺铂组能降低Lewis肺癌组织VEGF、KDR的表达及MVD的形成,差异显著(P0.01)。结论:(1)参慈胶囊联合顺铂能抑制Lewis肺癌组织生长及血管生成,二者联用具有相加或者协同效应;(2)下调VEGF及其受体KDR的表达,可能是二者联合抗肿瘤血管生成的机制之一。     

重组人MUC1-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫活性测定

目的 :以MUC1为靶点研制抗肿瘤蛋白疫苗。方法 :将MUC1基因连入pMAL p2原核表达载体 ,并转化大肠杆菌 ,通过IPTG诱导MUC1表达 ,经Westernblot鉴定 ,Amylose亲和层析纯化蛋白。用MUC1 MBP免疫健康C5 7BL 6小鼠 ,测定其免疫活性 ,通过ELISA测定血清中抗MUC1抗体的效价 ;采用MTT法测定小鼠脾CTL活性 ,通过3H TdR掺入法测定T细胞增殖能力。结果 :成功构建了pMAL MUC1表达载体并得到稳定表达MUC1的菌株 ,鉴定了MUC1在大肠杆菌中的表达 ,纯化了MUC1蛋白。经重组MUC1 MBP免疫的C5 7小鼠 ,血清抗MUC1抗体的效价为 1:5 76 0± 32 2 1;脾CTL对MCF 7及Lewis肺癌细胞的杀伤率分别为 4 7 7%± 4 3%和 6 7 5 %± 6 5 %。结论 :人类重组MUC1融合蛋白可引发小鼠CTL反应和体液免疫应答 ,有希望研制成抗腺癌蛋白疫苗。     

ClpP融合蛋白诱导的免疫反应可抵抗不同型别肺炎链球菌的侵袭性感染

目的 ClpP融合蛋白在调节肺炎链球菌其他毒力因子表达和入血过程中起重要作用,评价Trx-ClpP融合蛋白对不同型别肺炎链球菌的侵袭性感染的免疫保护效果,为后续蛋白疫苗的开发提供依据.方法 含有重组质粒pET-32a(+)/ClpP工程菌BL21(DE3)经IPTG诱导后表达Trx-ClpP融合蛋白,纯化后与铝佐剂混合经腹腔注射免疫小鼠,而对照小鼠则用PBS与铝佐剂混合免疫.免疫程序:初次免疫5周后用ELISA法测小鼠针对ClpP融合蛋白的抗体免疫应答水平,末次免疫2周后用12个型别肺炎链球菌攻击,监测其生存时间.结果 重组ClpP融合蛋白主动免疫BALB/c小鼠后,产生了高滴度的anti-ClpP融合蛋白抗体,对多个血清型的肺炎链球菌菌血症小鼠模型的保护效果较对照组具有统计学意义.结论 ClpP融合蛋白免疫小鼠后可抵抗1、2、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F等12个型别的肺炎链球菌侵袭性感染,提示以ClpP融合蛋白为活性成分的疫苗具有较高的开发价值.     

EGFRvIII/PEP-3 cDNA与HBcAg重组基因原核表达载体的构建、表达与免疫分析

目的:构建EGFRvIII与HBcAg重组基因的原核表达质粒,进行原核表达、纯化,观察表达蛋白的免疫原性和抗原性。方法:通过双酶切从pGEM-TEasy/PEP-3载体获得编码EGFRvIII突变区的cDNA片段,插入去除了主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/c-PEP-3-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET28a( )中,通过IPTG诱导蛋白表达,利用Ni2 -NTA亲和层析法对融合蛋白进行纯化;用融合蛋白常规免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、序列测定证实融合基因已插入pET28a( )载体中,融合基因序列与设计序列完全一致。原核表达后表达量占沉淀全菌蛋白的56%,纯化产物占总蛋白的92%,浓度约8g/L。BALB/c小鼠经4次免疫后,其血清中中和抗体的滴度可达1∶16000,第6次免疫后血清中中和抗体的滴度达到1∶2.56×105,抗PEP-3抗体滴度达到1∶1.28×105,抗HBcAg抗体滴度小于1∶4×103。结论:融合基因PEP-3-HBcAg在大肠杆菌中可获得高效表达,表达的融合蛋白可以诱导小鼠产生高滴度和高特异性中和抗体,从而为高表达EGFRvIII恶性肿瘤基因工程疫苗的研究奠定基础。     

HPV31和52 L2融合蛋白的原核高效表达及免疫效果评价

目的 高效表达HPV31和52型L2融合蛋白疫苗,并评价其免疫效果.方法 根据GenBank上公布的HPV31、52型L2蛋白11-200位氨基酸序列,设计合成两个型别L2该区域对应的优化密码子基因融合序列,并将其克隆至原核表达载体中.利用原核表达系统表达HPV31和52 L2融合蛋白,纯化目的蛋白后免疫小鼠,用血清抗体检测及HPV假病毒体外中和试验评价融合蛋白疫苗的免疫效果.结果 HPV31和52 L2融合蛋白在原核表达体系中呈高效表达,表达量约占全菌20％.融合蛋白加铝佐剂免疫小鼠后,血清中能检测到高滴度的总抗体及一定水平的中和抗体和交叉中和抗体.结论 HPV31和52 L2融合蛋白能够刺激机体产生广谱中和抗体,为高危型广谱HPVL2蛋白疫苗研发提供了实验室依据.     

表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗诱导特异性抗肿瘤免疫应答

目的:探讨表达钙网蛋白(Calreticulin,CRT)和HPV E2融合蛋白的肿瘤疫苗在小鼠体内诱导的抗肿瘤免疫应答.方法:转染重组质粒得到高表达CRT、E2和CRT-E2融合蛋白的肿瘤细胞,作为肿瘤疫苗隔周两次腹腔注射免疫小鼠,17天后观察成瘤率,检测NK细胞杀伤活性、特异性T细胞增殖能力、CIL活性以及睥淋巴细胞分泌IFN-γ水平,并观察荷瘤小鼠生存期.结果:高表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗免疫小鼠后,其成瘤率明显低于其他实验组,NK细胞杀伤活性、特异性T细胞增殖能力、CTL活性和脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平均显著高于其它实验组(P＜0.01),生存期也明显延长(P＜0.01).结论:小鼠体内实验显示,表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗能够诱导特异性CD8+T细胞免疫应答和NK细胞活性,显著抑制了肿瘤生长.     

脑外伤小鼠海马血管内皮生长因子表达的变化

目的探讨脑外伤小鼠海马血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的变化。方法 40只Balb/c小鼠随机分为2组,假手术组(10只)和脑外伤组(30只)。脑外伤组依据脑外伤的不同时间点再分6h、1d、3d三个小组,每组10只。免疫组化和Western blot检测各组小鼠海马VEGF蛋白的表达。RT-PCR方法检测各组小鼠海马VEGF mRNA的表达变化。结果免疫组化和Western blot结果发现,脑外伤组小鼠海马VEGF蛋白表达量明显高于假手术组(<0.05);RT-PCR结果也发现,脑外伤组小鼠海马VEGF mRNA表达量明显高于假手术组(<0.05)。结论脑外伤小鼠海马VEGF表达明显升高。     

含APPβ裂解位点肽及Aβ1-15的嵌合型HBcAg颗粒抗原的制备及其免疫原性分析

目的:构建含APPβ位点裂解肽ABCSP、β-淀粉样肽氨基段15肽(Aβ1-15)及删除了c/e1表位的截短型HBcAg基因的原核表达质粒pET/c-ABCSP-Aβ15-c,并在大肠杆菌中表达,观察融合蛋白C-ABCSP-Aβ15-C形成的病毒样颗粒,检测其免疫原性,为多表位AD基因工程疫苗的研究奠定基础。方法:PCR扩增含APPβ位点裂解肽ABCSP、β-淀粉样肽氨基段15肽(Aβ1-15)的基因,连接于HBcAg的1～71的3’端,再将HBcAg的88～144位氨基酸的基因片断连接于Aβ1-15的基因的3’端,构建重组质粒pUC/c-ABCSP-Aβ15-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET-28a(+)中,构建表达质粒pET/c-ABCSP-Aβ15-c,IPTG诱导表达。用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色,观察重组基因的表达。透射电镜观察融合蛋白形成的病毒样颗粒。融合蛋白经腹腔注射免疫昆明小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗-ABCSP、抗-Aβ抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、DNA序列测定证实,重组基因位于表达质粒之中,其大小、序列与理论设计相符。诱导表达后,SDS-PAGE显示,在细菌裂解液的上清和沉淀中均可见到表达蛋白条带,且以沉淀中为多,约占沉淀总蛋白的40%。纯化后的融合蛋白形成电镜下可观察到的病毒样颗粒。昆明小鼠经融合蛋白免疫5次后,其血清中抗-ABCSP抗体的滴度可达1∶5 000,抗-Aβ抗体的滴度可达1∶10 000,检测不到抗-HBc抗体。结论:c-ABCSP-Aβ15-c融合基因在大肠杆菌中可高效表达,表达的融合蛋白具有较强的免疫原性。     

空肠弯曲菌PEB1 DNA和PEB1蛋白联合免疫小鼠的效果评价

目的初步检测抗空肠弯曲菌感染外膜黏附蛋白(PEB1)核酸疫苗与蛋白疫苗联合免疫诱导小鼠免疫应答水平。方法通过灌胃免疫的方法,将制备的核酸疫苗pcDNA3.1(-)-PEB1及蛋白疫苗PEB1采用核酸初次免疫-蛋白加强免疫及分别单独免疫的方法免疫雌性BALB/c小鼠,以PBS及空质粒pcDNA3.1(-)对照,检测各组小鼠体液免疫应答及细胞免疫应答水平。末次免疫后第28天,对各组小鼠灌胃攻击空肠弯曲菌,评价疫苗保护率。结果免疫后第56天,核酸蛋白联合免疫组小鼠脾淋巴细胞刺激指数(SI)为2.625±0.275,脾细胞培养上清中IFN-γ含量为(258.92±13.472)pg/mL。血清IgG抗体滴度为(2.507±0.124)μg/mL,胃和小肠黏膜冲洗液sIgA抗体滴度为(80.351±5.769)ng/mL,脾细胞培养上清中IL-4(377.47±14.560)pg/mL水平均明显高于各对照组(P0.05)。小鼠攻击试验显示:核酸蛋白免疫组的疫苗保护率为91.53%。结论PEB1核酸蛋白联合免疫组诱导的免疫应答水平和疫苗保护率高于单独核酸疫苗免疫组和单独蛋白疫苗免疫组。     

VEGF/bFGF复合多肽疫苗对雌性小鼠的毒性及其生殖的影响

目的:初步探究血管内皮生长因子(VEGF)/碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)复合多肽疫苗(VEGF/b FGF complex peptide vaccine,VBP3)对雌性小鼠的毒性及其生殖的影响。方法:通过镍离子亲和层析柱纯化VBP3蛋白,将纯化获得的VBP3免疫雌性BALB/c小鼠,酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测小鼠血清抗体效价和特异性,监测亲本小鼠体重,测定亲本小鼠脏器重量并对小鼠脏器进行HE染色观察;将免疫小鼠与未免疫雄性小鼠交配后,测定F1代小鼠存活率、体重、相关脏器重量,并对相关脏器进行HE染色观察。结果:间接ELISA检测结果显示免疫小鼠血清中抗VEGF、抗b FGF抗体滴度分别为1∶3 000、1∶20 000,且免疫组F1代小鼠能检测出低滴度的抗b FGF抗体,但抗VEGF抗体不能检出。在小鼠生产率实验中,免疫组与对照组崽鼠数目未见明显差异,但免疫组F1代小鼠存活率较对照组降低(P0.05)。在亲本小鼠中,免疫组小鼠各脏器重量与对照组比较均未有差异,而在F1代小鼠中,2个组别的小鼠肝脏重量存在差异,但其它脏器重量未有差异;HE染色显示,在亲本小鼠中,2个组别小鼠的各脏器形态未有明显差异;在F1代小鼠中,免疫组F1代小鼠的肝脏与对照组相比存在形态差异。结论:VEGF/b FGF复合多肽疫苗未对亲本小鼠主要脏器造成直接损伤,但对亲本小鼠的生殖及F1代小鼠健康具有一定的影响。     

重组人血管内皮抑素联合放疗对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长及VEGF表达的影响

目的:研究重组人血管内皮抑素(rh-Endostatin,YH-16,恩度)对不同放射剂量治疗的Lewis肺癌小鼠肿瘤生长及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:制作Lewis肺癌细胞接种肿瘤的动物模型,并将60只模型小鼠随机分为5组:A,空白对照组(不予任何治疗);B,小剂量多次放疗组(1Gy/f,隔日一次,共4次);C,大剂量单次放疗组(4Gy/f,共1次);D,小剂量多次放疗联合恩度组(放疗前4天起每天右侧腹股沟区皮下注射恩度0.1ml,共15天,放射剂量为1Gy/f,隔日一次,共4次);E,大剂量单次放疗联合恩度组(放疗前4天起每天右侧腹股沟区皮下注射恩度0.1ml,共15天,放射剂量为4Gy/f,共1次)。分别给予上述处理后计算抑瘤率,并用免疫组化SP法测定各组VEGF的阳性表达率。结果:与C、E组比较,B、D组的抑瘤作用及VEGF表达下降明显(P<0.05),尤以D组抑瘤更强(P<0.05)、VEGF下降最多(P<0.05)。结论:放疗前使用恩度可使Lewis肺癌小鼠对放疗的敏感性增加,其机制可能与下调VEGF的表达有关。     

小鼠GITRL融合蛋白的表达、纯化及免疫原性的研究

目的:构建含小鼠GITRL基因原核表达载体,经转化E.coli以表达GITRL融合蛋白,纯化蛋白并制备相应的抗血清.方法:将GITRL-pMD18-T重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切回收目的基因,与原核表达载体PET32a连接,应用电转法转化BL21(DE3)菌.阳性克隆经鉴定后用IPTG诱导GITRL蛋白表达,经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot进行特异性鉴定,CD4+CD25+T细胞免疫抑制试验验证其生物学功能.采用弗氏完全佐剂常规免疫方案,制备抗GITRL抗血清,抗血清的效价和特异性测定采用双向琼脂免疫扩散法.结果:经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在40 kD处呈现单一蛋白条带,该蛋白具有阻断CD4+CD25+T细胞免疫抑制功能的作用,双向免疫扩散结果显示兔抗小鼠GITRL抗血清效价为1∶16.结论:成功构建GITRL原核表达质粒,制备和纯化的GITRL融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,制备并获得特异性抗血清,可用于GITRL融合蛋白生物学活性的进一步研究.     

金水鲜胶囊联合放射治疗对 Lewis 肺癌小鼠肿瘤生长和血管内皮生长因子表达影响的研究简

目的观察金水鲜胶囊联合放射治疗（简称放疗）对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法建立Lewis肺癌移植瘤小鼠模型,随机分为6组,即空白对照组、金水鲜组、放疗组、先金水鲜后放疗组、先放疗后金水鲜组和同时金水鲜＋放疗组,每组6只。放疗剂量为2Gy,金水鲜制成悬液后灌胃给药。游标卡尺测量瘤体长短径变化。绘制肿瘤生长瞳线：采用实时聚合酶链反应（real-time PCR）和免疫组织化学法检测瘤体VEGF的表达。结果肿瘤体积在接受处理后明显减小。与空白对照组相比,先金水鲜后放疗组、先放疗后金水鲜组和同时金水鲜＋放疗组肿瘤体积减小最为明显（分别为303.209mm^3±14.445mm^3,284.758mm^3±21.891mm^3,303.228mm^3±2.335mm^3）,差异有统计学意义（P〈0.05）。先金水鲜后放疗组、先放疗后金水鲜组和同时金水鲜＋放疗组与空白对照组或放疗组比较,VEGF表达阳性率降低（分别为12.97％±O.82％,15.13％±1.31％。13.62％±0.83％）,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论金水鲜胶囊与放疗联用对Lewis肺癌小鼠有抑制肿瘤的作用.其机制可能是下调VEGF的表达。