恙虫病立克次体弱毒株分离方法的研究

江苏省于1986年发现秋冬型恙虫病的流行,并从病原学和血清学得到证实。但用病人、鼠、螨标本接种小白鼠,鼠的症状和病变不明显,且难以检出恙虫病立克次体。1990年以来,我们在分离恙虫病立克次体方法上作了以下改进:多次用环磷酰胺和稀释液处理接种标本的小白鼠;增加稀释液的成分;把握好小白鼠的传代时机等。结果从病人外周血、鼠和小盾纤恙螨中均分离到恙虫病立克次体,说明该方法对分离恙虫病立克次体弱毒株是有效的。     

不同细胞系制备甲型肝炎病毒抗原效果的比较

甲型肝炎（ＨＡＶ）以在原代人胚肾细胞、原代非洲猴肾细胞、人成纤维细胞（人胚肺二倍体细胞）和传代猴胚肾细胞（Ｖｅｒｏ、ＦＲｈｋ４）等细胞中进行增殖和传代。但为了满足ＨＡＶ临床诊断所需，大量扩增ＨＡＶ，应用原代细胞和二倍体细胞是难以做到的。因此，我们选用ＦＲｈｋ４和Ｖｅｒｏ２个传代细胞系增殖传代的特性进行了比较，而且对常规传代细胞培养法和转鼓培养法生产ＨＡＶ抗原进行了比较，从而形成了稳定的细胞传代毒种及收获保存方法，达到获得大量ＨＡＶ抗原的目的。结果如下。（一）材料和方法１．ＨＡＶ龙甲－１株从急性甲…     

应用L929细胞从患者血液分离立克次体

作者收集临床疑似立克次体病患者血液标本２０份，应用Ｌ９２９细胞分离立克次体，用ｍＩＦ法鉴定出恙虫病立克次体３株，斑疹伤寒立克次体２株，斑点热立克次体７株。恙虫病立克次体感染的细胞悬液用ＰＣＲ技术均检出恙虫病立克次体ＤＮＡ。在国内首次应用细胞培养方法从患者血液直接分离立克次体成功。     

恙虫病病原体分类学位置及我国实验诊断研究

１恙虫病病原体的分类学位置恙虫病病原体具有立克次体属许多共同的表型特征：例如,与革兰氏阴性杆菌接近,失去部分代谢功能,生存于脊椎动物和节肢动物体内的活细胞内寄生增殖,通过节肢动物传染人,引起发热和发疹。因此,长期以来列为立克次体属的一个种,称为恙虫病...     

恙虫病立克次体蛋白抗原及其编码基因研究进展

恙虫病立克次体（Rickettsiatsutsugamushi）是恙虫病（Scrubtphus）的病原体,专性活细胞内寄生,革兰氏阴性,恙螨是其传播媒介。在分类地位上,恙虫病立克次体原属于立克次体科立克次体属,但由于其在许多生物学和遗传特性方面不同与其他立克次体,1995年将其另立一属一东方体属（Orientia）,称为恙虫病东方体（Orientiatsutsugamushi）[1]。近十多年来,新的技术方法尤其分子生物学方法不断引入恙虫病立克次体的研究,使病原学研究更加系统深入广泛。现对其蛋白抗原与其编码基因的研究综述如下。1恙由病立克次体的多胜组成纯化的恙虫…     

恙虫病并发肝损害的临床观察与研究

为探讨恙虫病与肝损害的临床关系,作者从１９８４年６月以来,对本院所收治的恙虫病病例中有肝损害的进行了临床观察研究,现将有肝损害的３７例回顾性分析总结报道如下。１　临床资料１１　病例选择　诊断参照传文献［１］,对①有野外接触史;②突然发热并发现特异性焦痂或溃疡;③淋巴结肿大、皮疹、肝脾肿大;④外斐氏反应ＯＸｋ１∶８０以上;⑤查恙虫病立克次体阳性者,具备这５项中的３项可为恙虫病诊断;⑥在恙虫病诊断成立同时有肝损害表现,ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｃ－ＩｇＭ和ＨＡＶ－ＩｇＭ均呈阴性,以观察对象的３７例中排除病…     

用Vero—E6细胞直接从野鼠脏器中分离恙虫病立克次体

近年来流行病学和血清学调查显示恙虫病分布较广、疫源地不断扩大、长江以北逐年增多。由于传统的病原分离和增殖方法有一定的限制，以及对弱毒株又无法从动物分离方法中获得，至使有的毒株丢掉。近年国内用L929细胞从病人血液分高立克次体已被证实。本文报告从野外疫区捕获的大林姬鼠等9种野鼠，用Vero－E6细胞直接分离到恙虫病立克次体9株。结果报告如下。材料与方法一、试验材料（一）标本来源：1992～1994年的5～6月间，在吉林省珲春市、黑龙江省密山市、辽宁省宽甸县调查点上，采用d笼法捕获活野鼠，带回实验室，以同生境，同种鼠3～…     

云南省恙虫病立克次体血清学分型研究

云南省恙虫病立克次体血清学分型研究雷亚民,冯锡光云南省流行病防治研究所陈渊民,张海莲国内许多省份对恙虫病立克次体的抗原型已有许多报道［１、３］。我省７０年代就证实了有广泛的恙虫病自然疫源地,有４０多个县在病原学上已得到证实,占全省面积的３０％。但此后...     

恙虫病立克次体实验感染地里纤恙螨经卵传递的研究

地里纤恙螨成虫腹内人工接种恙虫病立克次体Karp株首次获得成功。在接种立克次体悬液量极微(0.1μl以下)的成虫感染率达41.2％;接种后的恙螨成虫4个月后其活存率为83.7％;成虫在第一年内能保持较好的生殖能力。经人工接种的恙虫病立克次体Karp株,能在恙螨体内增殖,并经卵传递至子代。     

维生素E对老年小鼠脾细胞转化反应及心,脑脂褐质含量的影响

目的探讨维生素Ｅ对老年小鼠细胞免疫功能及心、脑脂质过氧化反应的影响。方法３月龄幼年小鼠和１８月龄老年小鼠各饲以含维生素Ｅ（ＶｉｔＥ）５００×１０－６和３０×１０－６饲料８周后，测定血清ＶｉｔＥ水平、脾细胞转化反应和心、脑脂褐质含量。结果饲以含５００×１０－６ＶｉｔＥ饲料的老年小鼠脾细胞对刀豆蛋白Ａ（ＣｏｎＡ）和脂多糖（ＬＰＳ）的反应及血清ＶｉｔＥ水平均较饲以含３０×１０－６ＶｉｔＥ饲料者显著增高（Ｐ值＜０．０１）；心、脑组织中脂褐质含量则明显降低（分别为Ｐ值＜０．０１及０．０５）。结论膳食中补充较高剂量ＶｉｔＥ后，能显著提高老年小鼠血清ＶｉｔＥ水平，增强脾细胞转化反应，并明显抑制心、脑脂质过氧化，减少脂褐质形成     

汉坦病毒和恙虫病东方体复合感染的实验研究

目的了解汉坦病毒(HV)和恙虫病东方体(Ot)在宿主体内能否共生及其共生特征。方法采用HV和Ot先后交替、重复感染实验鼠,20 d后取鼠脏器切片和刮片用IFAT和Giemsa染色观察其感染率和脏器分布;并用Vero-E6细胞体外培养法研究HV、Ot在宿主细胞内的共生特征。用RT-PCR和PCR进行基因鉴定。结果HV和Ot先后交替、重复感染的各组实验鼠中,均可发现两种病原体的复合感染,其中HV和Ot单纯感染组的阳性率均显著高于HV、Ot先后和同时感染组。5组感染Vero-E6细胞培养检测结果发现:先后、同时和单纯实验感染的5组细胞中,HV和Ot先后、同时接种感染组在细胞传至第3代时检测均见有HV和Ot的双重感染,阳性率随传代次数增加而增加。而HV和Ot单纯分别感染组细胞传第2代时即可检测到HV和Ot,阳性率亦随传代次数的增加而增加。在传代培养中单纯感染组的阳性率均显著高于先后和同时感染组。用PCR和RT-PCR进行了基因鉴定得到一致的结果。结论研究结果提示HV和Ot可重复感染宿主动物,在同一宿主细胞内的感染初期有相互抑制作用,这对HV和Ot的流行病学有一定的理论意义。     

蝙蝠呼肠孤病毒感染BHK-21和Vero-E6细胞形态发生的比较观察

目的通过对蝙蝠呼肠孤病毒在BHK-21和Vero-E6细胞形态发生的比较研究,筛选出该病毒的最佳宿主细胞。方法将感染呼肠孤病毒XJV株的BHK-21和Vero-E6细胞用戊二醛、锇酸固定,制成超薄切片,用透射电镜观察。同时测定病毒滴度。结果XJV在2种细胞中的适应程度不同,XJV更适于在BHK-21细胞中增殖。XJV在2种细胞中的形态发生不同,在BHK-21细胞中形成的包涵体呈典型的晶格状排列,在Vero-E6细胞中形成的包涵体呈杂乱的球状。XJV用BHK-21和Vero-E6细胞育传5代,病毒滴度分别为105.5TCID50/ml和104.5TCID50/ml。结论BHK-21细胞是蝙蝠呼肠孤病毒XJV株的最佳宿主细胞。     

汉滩病毒S基因在Vero-E6细胞中的分段表达

目的　体外研究汉滩病毒 (HTNV)S基因及其 5’端、3’端表达的意义 ,为核蛋白T细胞表位的研究奠定基础。方法　设计 2套引物 ,用PCR方法从PBV2 2 0 -S2 2原核质粒中扩增出S基因全读码框 (37- 132 6bp)及S基因 5’端 (37-5 0 1bp) ,S基因 3’端 (5 0 2 - 132 6bp)用TA克隆将其克隆入 pcDNA3 1/V5 -His -TOPO载体中 ,成功构建 pcDNA3 1-S及pcDNA3 1-S -N、pcDNA3 1-S -C真核表达载体 ,并通过脂质体转染至Vero -E6细胞中 ,进行了瞬时表达。 结果　间接免疫荧光成功检测到 pcDNA3 1-S及pcDNA3 1-S -N、pcDNA3 1-S -C在Vero -E6细胞中的表达。 结论　pcDNA3 1-S及 pcDNA3 1-S -N、pcDNA3 1-S -C真核表达载体有较高的转染效率 ,目的基因能在宿主细胞中表达 ,有利于研究HTNV -S基因在T细胞表位研究中的意义。     

新型冠状病毒在Vero-E6细胞中的增殖特征分析

目的 了解新型冠状病毒(2019-nCoV)在Vero-E6细胞中的增殖特征,为病毒的分离培养、抗病毒药物研究以及疫苗研制等工作提供基础。方法 将2019-nCoV做半对数系列稀释,测定病毒的半数组织培养感染剂量(TCID₅₀);以1.74×10^-4TCID₅₀/cell的病毒量感染Vero-E6细胞,在病毒吸附后第0~6 d分别收集病毒培养上清,测定上清中病毒感染滴度和病毒核酸拷贝数;测定病毒储存液冻融/非冻融、不同细胞悬液浓度、病毒吸附后洗涤/不洗涤等不同实验条件下的TCID₅₀。 结果 2019-nCoV感染Vero-E6细胞后,48 h内培养上清中的病毒TCID₅₀和病毒核酸拷贝数到达或接近峰值,平均复制周期约为3.29 h;48 h后上清中病毒核酸拷贝数维持在较高水平但病毒感染滴度逐渐下降。病毒储存液的冻融、细胞浓度以及病毒吸附后洗涤等培养条件可轻微影响病毒TCID₅₀。 结论 2019-nCoV感染Vero-E6细胞在早期增殖迅速,感染后期病毒感染滴度逐渐下降,但病毒核酸拷贝数在上清中维持在较高水平。     

浙江省传染性非典型肺炎冠状病毒分离株ZJ01的细胞病变与增殖滴度

目的　观察分离自浙江省 1例早期SARS患者的病毒ZJ0 1株在Vero、Vero E6及RD细胞上进行适应 ,以及在上述几种细胞中ZJ0 1株的增殖滴度。方法　病毒增殖采用观察细胞病变及荧光染色法进行。结果　证实ZJ0 1病毒株对Vero、Vero E6及RD等细胞均敏感 ,但在几种细胞中的增殖滴度有较大的差别 ,其中以Vero E6感染滴度最高可达 10 6.0～ 7.0 ,Vero和RD细胞的增殖滴度在 10 3 0～ 4.0 。结论　本文认为SARS病毒ZJ0 1株对上述细胞均敏感 ,其中以Vero E6细胞滴度最高。     

云南大理地区恙虫病血清学诊断及病原体基因序列分析

目的 对云南大理地区恙虫病做血清学诊断及病原体基因序列分析。方法 采用间接免疫荧光方法(IFA)检测不明原因发热患者血清中的恙虫病东方体(Ot) IgG抗体,用巢式PCR(nPCR)法扩增患者血液中的Ot groEL与sta56基因并对扩增基因做序列分析。结果 19例不明原因发热病例中恙虫病患者8例,其中血清Karp型4例、Kato型3例、Karp和Kato混合型1例;3例确认恙虫病的血样本扩增到groEL基因片段, 其序列同源性为100%,基因序列做系统进化树显示该Ot与Karp和Kato株在同一分支上。从Karp和Kato混合血清型病例血样本扩得sta56基因片断,序列分析显示该Ot与台湾分离株在同一分支上。结论 这些云南大理的恙虫病患者由恙虫病东方体Karp或Kato血清型感染;个别患者可能Karp+Kato混合血清型感染,Karp+Kato混合血清型菌株可能在遗传进化上与某些台湾Ot株关系密切。     

Adaptive property of hantaviruses during their isolation from cultured VERO-E6 cells in relation to the type of the ecological host

As a result of virological studies, 185 lung tissue specimens from 4 rodent species caught near Khabarovsk were isolated and fixed in the passages of cultured Vero-6 cells of 68 hantavirus strains. The capacity of the strains to adapt to the cells was assessed by using the adaptive index involving the mean rates of successful isolation, its duration, hantavirus antigen titer in the material used for infection. The strains of hantavirus serotypes were noted for the highest adaptive properties, which are ecologically associated with rodents of the family Mus, such as field and East-Asiatic mice. Lower adaptive capacities were established for the strains of hantavirus serotypes, which are ecologically related to rodents of the family Cricetidae, such as large and large-toothed redback voles. The differences found in the adaptive capacities of hantavirus strains cultured in Vero-E6 cells reflect the degree of specialization of some hantavirus serotypes to particular host rodent species during their long-term coevolution.     

靶向Rab9 GTPase基因shRNA体外抑制麻疹病毒Edmonston株复制的研究

目的构建靶向Rab9 GTPase基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,观察shRNA对Rab9 GTPase表达和麻疹病毒Edmonston株体外复制的抑制效应。方法按照shRNA的设计要求和Rab9 GTPase基因序列构建靶向Rab9 GTPase基因shRNA表达载体,表达载体经酶切鉴定和序列分析后通过脂质体法转染Vero-E6细胞,然后感染麻疹病毒Edmonston株,通过RT-PCR和Western blot检测转染细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达水平;通过标准蚀斑试验检测病毒滴度,观察shRNA对麻疹病毒Edmonston株复制的抑制效应。结果靶向Rab9 GTPase基因的shRNA可特异性抑制Vero-E6细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达,最大抑制率分别为(86.3±0.7)%和(87.6±0.7)%;蚀斑试验检测Rab9 GTPase基因表达沉默后对麻疹病毒Edmonston株体外复制抑制率达90%以上,且抑制效应至少可持续32 d。结论靶向Rab9 GTPase基因的shRNA能特异性抑制Rab9 GTPase表达和麻疹病毒Edmonston株...     

恙虫病东方体目视LAMP现场化检测方法的建立

目的 建立基于“染料-蜡丸”的目视LAMP检测恙螨中恙虫病东方体的方法,为恙虫病的防治提供新工具。方法 选择Ot GroEL 基因作为检测靶序列,在线设计并合成LAMP引物。构建rOt-GroEL 重组质粒作为阳性对照。建立基于SYBR Green I的“染料-蜡丸”目视LAMP,并联合便携式LAMP仪使其利于现场应用。结果 新设计的引物针对Ot GroEL 基因的237 bp靶区域,所构建的重组质粒rOt-GroEL 测序结果正确。在便携式LAMP仪上运用“染料-蜡丸”目视LAMP法,其检测下限为1×102 拷贝质粒。结论 成功建立了一种可与便携式LAMP仪联合使用的检测恙螨体内恙虫病东方体的“染料-蜡丸”目视LAMP法。     

恙虫病东方体Karp株56kDa与47kDa外膜蛋白基因的嵌合和嵌合基因在大肠杆菌的表达

目的　将恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株的 5 6kDa和 4 7kDa外膜蛋白基因嵌合 ,并使嵌合基因在大肠杆菌细胞内表达 ,产生双抗原融合蛋白。方法　采用PCR方法 ,从OtKarp株基因组DNA中扩增 5 6kDa蛋白基因片段 ,将该片段分别与原核表达载体pQE30及 4 7kD蛋白基因重组质粒 pQE30 / 4 7连接 ,构建 pQE30 / 5 6及pQE30 / 5 6 - 4 7重组质粒 ;用IPTG诱导转入大肠杆菌内的重组质粒的目的基因表达。结果　SDS -PAGE显示 ,pQE30 / 5 6转化的大肠杆菌产生一约 4 5kDa的融合蛋白和 pQE30 / 5 6 - 4 7转化大肠杆菌产生一约 90kDa融合蛋白 (5 6 - 4 7融合蛋白 ) ,免疫印迹分析显示两融合蛋白均与OtKarp株感染鼠血清产生特异性反应 ,5 6 - 4 7融合蛋白分别与 4 7kDa、5 6kDa重组蛋白免疫的小鼠血清产生特异性反应 ,以及 5 6 - 4 7融合蛋白免疫血清与 5 6kDa和 4 7kDa重组蛋白反应。结论　OtKarp株的 5 6kDa与 4 7kDa外膜蛋白基因嵌合后在大肠杆菌细胞内实现了表达 ,表达的融合蛋白具有 5 6kDa和 4 7kDa外膜蛋白的抗原特性。