Location and expression of human cystatin B genein mammalian cell lines

目的 用基因克隆方法 构建带FLAG-tag的人cystatin B真核表达载体,用其转染COS-7和HEK 293 T细胞观察cystatin B在增殖细胞内的定位;转染HEK 293 T细胞检测其表达.方法 设计带FLAG-tag的引物,以人cystatin B全长cDNA序列的质粒为模板,PCR法扩增cystatin B全长序列,然后插入pCDNA 3中构建pCDNA 3-cystatin B-FLAG(CSTBF)质粒;脂质体法转染至COS-7、HEK 293 T细胞,荧光显微镜下观察其在细胞内定位;转染至HEK 293 T细胞,提取细胞总蛋白进行Western blot.结果 正确构建了pCDNA 3- cystatin B-FLAG质粒;定位实验表明在COS-7和HEK 293 T细胞中,cystatin B主要分布在细胞核内,核膜处更集中,胞浆内也有广泛分布;Western blot结果 表明该质粒能在细胞中有效表达.结论 该研究结果 为了解cystatin B在细胞内与其他蛋白质相互作用及功能提供了一定的基础.     

人MT2A基因在哺乳动物细胞株中的定位与表达

目的 用基因克隆方法构建带FLAG-tag的人金属硫蛋白2A(MT2A)真核表达载体,用其转染HEK 293T,COS-7细胞观察MT2A在增殖细胞内的表达和定位.方法 设计带FLAG-tag的引物,以人MT2A全长cDNA序列的质粒为模板,PCR法扩增MT2A全长序列,然后插入pCDNA 3.1中构建pCDNA 3.1-MT2A-FLAG质粒;将构建的质粒转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测;脂质体法转染至COS-7细胞,荧光显微镜下观察MT2A表达的蛋白在细胞内定位.结果 正确构建了pCDNA 3.1-MT2A-FLAG质粒;其在HEK 293T细胞中能有效地表达;免疫荧光实验表明在COS-7细胞中,MT2A主要分布在细胞质内.结论 该研究结果为了解MT2A 在细胞内与其他蛋白质相互作用及功能提供了一定的基础.     

哺乳动物细胞中EB病毒诱导基因3的定位及表达

目的构建带有FLAG-tag的人野生型EB病毒诱导基因3(EBI3)真核表达载体,用其转染COS-7和HEK 293T细胞,观察EBI3在哺乳动物细胞中的定位和表达情况。方法设计带有FLAG-tag的引物,以含人EBI3全长cDNA序列的质粒为模板,以PCR方法扩增出EBI3全长序列,然后插入真核表达载体pCDNA3.1中,构建pCDNA3.1-EBI3-FLAG质粒。将重组质粒转染至COS-7细胞,荧光显微镜下观察其在胞内的定位情况;转染至HEK 293T细胞,提取细胞总蛋白进行Western blot。结果正确构建pCDNA3.1-EBI3-FLAG质粒;荧光定位实验表明在COS-7细胞中,EBI3蛋白主要分布在细胞质中,且较集中分布于靠近核膜的位置。Western blot结果表明该质粒能在细胞中有效表达。结论 EBI3在COS-7细胞中有表达,且主要分布在胞质内,该研究结果为了解EBI3在细胞内与其他蛋白质相互作用及功能奠定了一定基础。     

Human COX6B1 was transfected foR expression and location of the preliminary study in mammalian cell lines

目的 构建带FLAG标签的人野生型细胞色素氧化酶亚基COX6B1表达载体,转染至HEK 293T、COS7细胞观察COX6B1蛋白在细胞内表达与定位.方法 以含人COX6B1全长cDNA序列的质粒为模板,通过上游带有FLAG标签的引物,PCR方法扩增出COX6B1全长序列,然后插入真核表达载体pCDNA3.1中构建pCDNA3.1-FLAG-COX6B1表达载体.将构建的质粒转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测;转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位.结果 成功构建了pCDNA3.1-FLAG-COX6B1表达载体,其在HEK 293T细胞中能有效地表达;在COS7细胞中呈斑点状分布,且主要在胞质内分布,细胞核中未见其明显表达.结论 COX6B1在HEK 293T、COS7细胞中均有表达,且主要分布在胞质内,这为进一步了解COX6B1的功能提供了一定的基础.     

人phb1基因在哺乳动物细胞株中的转染定位和表达

目的 构建带Flag标签的phb1真核表达载体,将其转染至COS7细胞中观察phb1蛋白在细胞内的定位,并转染至HEK293T细胞检测其表达.方法 以含人phb1全长cDNA序列的质粒pLenti6-phb1为模板,用PCR方法扩增phb1全长序列,连接至T载体,构建pUCm-T-phb1,Kpn Ⅰ和EcoR I双酶切后插入真核表达载体pCDNA3中,将重组表达质粒pCDNA3-Flag-phb1转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位.转染至HEK2931、细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测.结果 经测序鉴定,成功构建了真核表达载体pCDNA3-Flag-phb1,转染后荧光显微镜观察phb1在COS7细胞中主要定位于胞质;经Western blot检测phb1基因在HEK293T细胞中能够有效表达.结论 实验结果为进一步了解phb1的功能打下了基础.     

人COX6B1在哺乳动物细胞株中转染表达与定位的初步研究

目的构建带FLAG标签的人野生型细胞色素氧化酶亚基COX6B1表达载体,转染至HEK 293T、COS7细胞观察COX6B1蛋白在细胞内表达与定位。方法以含人COX6B1全长cDNA序列的质粒为模板,通过上游带有FLAG标签的引物,PCR方法扩增出COX6B1全长序列,然后插入真核表达载体pCDNA3.1中构建pCDNA3.1-FLAG-COX6B1表达载体。将构建的质粒转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测;转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位。结果成功构建了pCD-NA3.1-FLAG-COX6B1表达载体,其在HEK 293T细胞中能有效地表达;在COS7细胞中呈斑点状分布,且主要在胞质内分布,细胞核中未见其明显表达。结论 COX6B1在HEK293T、COS7细胞中均有表达,且主要分布在胞质内,这为进一步了解COX6B1的功能提供了一定的基础。     

人Prohibitin 2哺乳动物细胞株的转染表达与定位的初步研究

目的 构建带FLAG标签的人类野生phb2 (prohibitin 2)表达载体,将其转染至HEK 293T细胞检测其表达,转染至COS7细胞观察phb2蛋白在细胞内的定位.方法 以含有人phb2全长cDNA序列的质粒为模板,通过带有FLAG标签上游引物,用PCR方法扩增phb2全长序列,然后插入真核表达载体pCDNA3中构建pCDNA3-FLAG-phb2表达载体,将构建的质粒转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测;转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位.结果 成功构建了pCDNA3-FLAG-phb2表达载体,转染表明此表达载体在HEK 293T细胞中能够有效表达,在COS7细胞中phb2呈斑点状主要在胞质内分布,细胞核中未见到明显的表达.结论 实验结果为进一步了解phb2的功能提供了一定的基础.     

人FKBP3在哺乳动物细胞系中的转染表达与定位

以含cDNA序列的质粒为模板,下游引物带有FLAG标签,PCR扩增,插入pcDNA3.1,成功构建C端带FLAG标签的人野生型肽基脯氨酰顺反异构酶FKBP3的哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-FKBP3-FLAG.转染HEK 293T细胞,Western blot检测;转染COS-7细胞,荧光显微镜观察.FKBP3在HEK 293T、COS-7细胞中均有表达,且定位在COS-7细胞的细胞质和细胞核,胞质分布较多,为进一步研究FKBP3的相互作用蛋白和功能奠定了一定的基础.     

PAM14的细胞转染表达和定位

目的构建带GFP标签的PAM14表达载体,将其转染至HEK293T细胞检测其表达,转染至COS7细胞观察PAM14蛋白在细胞内的定位。方法以含人PAM14全长cDNA序列的质粒pACT2-PAM14为模板,用PCR方法扩增PAM14全长序列,然后插入带GFP标签的载体pCDGFP中构建表达载体pCDGFP-PAM14,将构建的质粒转染至HEK293T细胞,提取总蛋白,进行Western-blot检测;转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位。结果成功构建了表达载体pCDGFP-PAM14,此表达载体在HEK 293T细胞中能够有效表达,转染表明PAM14在COS7细胞主要在核内表达,胞质内也有少量表达。结论实验结果为进一步了解PAM14的功能提供了一定的基础。     

人β4GalTⅡ基因在哺乳动物细胞株中的表达与定位

目的：运用基因克隆技术构建人源β1,4-半乳糖转移酶Ⅱ（β4GalTⅡ）真核表达质粒,并将其转染到 COS7细胞中,观察蛋白在细胞内的定位,同时转染到 HEK 293T 细胞中检测其表达。方法分别设计带 FLAG 标签和 GFP 标签的β4GalTⅡ基因的特异性引物,以含人β4GalTⅡ全长 cDNA序列为模板,定向构建到 pcDNA3．1（＋）及 pCDGFP 真核表达载体中,构建重组表达质粒。通过酶切和测序鉴定阳性重组质粒,利用 Lipofectamine 2000分别转染 COS7、HEK 293T细胞,免疫荧光显微镜观察重组蛋白在细胞内的定位,West-ern blot 法鉴定重组蛋白的表达。结果成功构建 pcD-NA3．1-β4GalTⅡ-FLAG 和 pCDGFP-β4GalTⅡ重组表达载体,定位实验表明：β4GalT Ⅱ-FLAG 和 GFP-β4GalT Ⅱ二者在COS7细胞中均主要定位在细胞核周围,并有明显的块状染色,胞核中未见明显分布;Western blot 法检测显示重组β4GalTⅡ蛋白在 HEK 293T 细胞中稳定表达。结论获得了人β4GalTⅡ的真核表达质粒,并能在 COS7和 HEK 293T 细胞中表达,为进一步研究β4GalTⅡ的功能及其与其他蛋白的相互作用奠定了一定基础。     

孕酮诱导的蜕膜蛋白Depp在哺乳细胞株的转染表达与定位

目的 将孕酮诱导的蜕膜蛋白Depp基因构建到pCDGFP表达载体中,分析其在哺乳细胞株中的表达和定位情况.方法 用PCR方法扩增Depp全长序列,插入真核表达载体pCDGFP中,将构建好的质粒转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位;转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,利用GFP抗体进行Western bl...     

肌营养不良蛋白及其衍生物的表达与定位的研究

目的 研究肌营养不良蛋白( DG)及其衍生物α-DG、β-DG在真核细胞内的表达与定位. 方法 构建pcDNA3. 1-DAG1-FLAG、pcDNA3. 1-DAG1α-FLAG 和 pcDNA3. 1-DAG1β-FLAG 3个真核表达质粒,并分别转染至HEK 293T细胞中;提取总蛋白, Western blot检测表达情况;分别转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察细胞定位情况. 结果 成功构建了带有DAG1、DAG1α、DAG1β 基因的真核表达载体,且在HEK 293T细胞中都能有效表达,在COS7 细胞中主要分布于细胞质. 结论 DG 及其衍生物 α-DG、β-DG 在 HEK 293T、COS7细胞中均有表达,主要分布在细胞质内,为进一步了解DAG1的功能提供了细胞学基础.     

人E2F1蛋白的表达及与Sedlin蛋白共定位研究

目的 研究人E2F1 蛋白在真核细胞内的表达及其与 Sedlin 蛋白的共定位. 方法 构建 pcDNA3. 1-E2F1-FLAG真核表达质粒,然后瞬时转染至 HEK 293T 细胞内, Western blot法检测E2F1蛋白的表达;瞬时单转E2F1-FLAG和共转E2F1-FLAG+Sedlin-绿色荧光蛋白( GFP)至非洲绿猴肾细胞( COS7 )内,免疫荧光制片,荧光显微镜下观察E2F1-FLAG在细胞内的定位及其和Sedlin的共定位. 结果真核表达质粒 pcDNA3. 1-E2F1-FLAG 构建成功,且在HEK 293T细胞中能够成功表达,在COS7 细胞中主要定位在细胞核,且与Sedlin共定位于细胞核. 结论 人E2F1 在HEK 293T、COS7细胞中都能够正常表达,且与 Sedlin蛋白存在共定位现象,为进一步了解人E2F1的功能及其蛋白质相互作用提供了一定的细胞学基础.     

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.     

FKBP25缺失突变体在细胞中的表达与定位

目的研究FKBP25缺失突变体蛋白在细胞内的表达和定位。方法以人 FKBP25全长 cDNA序列的质粒为模板, PCR方法分别扩增出FKBP25缺失突变体序列,然后插入真核表达载体pcDNA3.1中,通过Western blot方法和免疫荧光方法检测其在细胞株中的表达和定位。结果成功构建了FKBP25缺失突变体的真核表达载体,经Western blot检测FKBP25缺失突变体在HEK 293T细胞中能够有效表达,免疫荧光显微镜结果显示 FKBP25缺失突变体在COS7细胞中分布于细胞核和细胞质。结论 FKBP25缺失突变体在HEK 293T、COS7细胞中能够表达,为了解FKBP25缺失突变体的功能提供了一定基础。     

SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的：构建信号调节蛋白α-绿色荧光蛋白（SIRPα-GFP）真核表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达SIRPα-GFP融合蛋白的细胞系,研究SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞的膜定位。方法：将SIRPα质粒和带有GFP的表达载体分别用限制性内切酶MluⅠ和SgfⅠ进行双酶切,将SIRPα基因克隆到pLenti-GFP载体中,构建pLenti-SIRPα-GFP质粒;将pLenti-SIRPα-GFP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒pLenti-SIRPα-GFP进行DNA测序;采用Lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-SIRPα-GFP质粒转染到HEK293T细胞中,通过荧光显微镜观察SIRPα-GFP在稳定转染HEK293T细胞中的表达,采用Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP融合蛋白的表达。结果：酶切鉴定和DNA测序,重组质粒pLenti-SIRPα-GFP构建成功。荧光显微镜检测,SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞膜上表达。Western blotting法检测,SIRPα蛋白在pLenti-SIRPα-GFP质粒转染的HEK293T细胞中成功表达。结论：成功构建了pLenti-SIRPα-GFP质粒。通过在HEK293T细胞中转染pLenti-SIRPα-GFP质粒,成功制备了稳定表达SIRPα-GFP的细胞系。SIRPα-GFP蛋白定位于HEK293T细胞的细胞膜上。     

稳定表达人血红素加氧酶-1细胞系的建立及其功能鉴定

目的 构建稳定表达人血红素加氧酶-1(HO-1)的细胞系,探讨内源性过表达HO-1对抗细胞氧化损伤的作用。方法 PCR扩增HO-1基因并将其克隆至改造的慢病毒载体pLentiLox3.7中,构建携带目的基因的重组质粒。用重组质粒转染HEK293T细胞,并用Western blot检测HO-1的表达。将重组质粒与慢病毒辅助质粒(plp1、plp2、VSVG)共同转染HEK293T细胞,包装有活力的慢病毒。用携带HO-1的慢病毒感染HEK293T细胞,筛选出能稳定表达目的基因的单克隆,并行Western blot检测HO-1的表达。将过氧化氢加入正常的及过表达HO-1的HEK293T细胞和人脐静脉内皮细胞,检测细胞内活性氧的含量。结果 成功筛选出能稳定表达HO-1的单克隆细胞系并扩大培养,Western blot检测其HO-1的表达明显升高。加入过氧化氢后,过表达HO-1的HEK293T细胞和人脐静脉内皮细胞内的活性氧明显减少。结论 成功构建了能稳定表达人HO-1的细胞系,内源性过表达HO-1能够对抗细胞的氧化损伤。     

人通用转录因子GTFIIF2表达与定位

目的构建不同标签的人通用转录因子 IIF多肽2(GTFIIF2)表达载体,观察其细胞内的表达和定位。方法设计GTFIIF2的引物,以全长cDNA序列为模板,利用聚合酶链式反应技术扩增 GTFIIF2全长序列,构建 pcDNA3.1-FLAG-GTFIIF2和 pCDGFP-GTFIIF2质粒,利用 Western blot法和免疫荧光法检测其在细胞表达与定位;构建GST-GTFI-IF2质粒,转化到BL21菌株,用IPTG诱导剂诱导融合蛋白表达,用SDS-PAGE分析诱导表达情况。结果免疫荧光法检测GTFIIF2蛋白集中分布在COS7细胞核中,在细胞质没有分布;pcDNA3.1-FLAG-GTFIIF2和pCDGFP-GTFIIF2质粒能够在HEK293T细胞中有效表达;GST-GTFIIF2在BL21菌株中很好的诱导表达。结论 GTFIIF2在 COS7细胞、HEK293T细胞和BL21感受态细胞中能有效表达,为更好地了解GTFIIF2蛋白在细胞内的功能提供一定的研究基础。     

过表达DLL3促进人胃癌细胞的增殖

目的构建人全长DLL3的真核表达质粒,并分析上调和下调DLL3对人胃癌细胞增殖的影响。方法采用PCR扩增人全 长DLL3 基因并克隆至真核表达载体pCMV-Tag4中,通过酶切及测序鉴定后,瞬时转染HEK293T细胞,并以转染pCMV-Tag4 质粒和无转染HEK293T细胞分别为阴性对照和空白对照,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot鉴定人全长DLL3基因 的表达;进一步通过qRT-PCR和Western blot检测人DLL3在人正常口腔上皮细胞GES-1和AGS等3株胃癌细胞中的表达差异; 当人DLL3/pCMV-Tag4 瞬时转染3 株胃癌细胞后,利用MTT检测DLL3 过表达后胃癌细胞的增殖;同时,特异性人DLL3 siRNA 转染人胃癌细胞MGC803 和MKN45,利用MTT检测DLL3 下调后胃癌细胞的增殖。结果成功构建了人全长DLL3/ pCMV-Tag4重组质粒,转染HEK293T细胞24 h后,qRT-PCR和Western blot表明DLL3在mRNA和蛋白水平上的表达显著高于对 照组;MTT细胞增殖实验显示：过表达DLL3促进胃癌细胞的增殖,下调DLL3后抑制胃癌细胞的增殖。结论成功构建了人全长 DLL3/pCMV-Tag4 真核表达质粒并在HEK293T细胞中获得表达,过表达DLL3促进胃癌细胞的增殖,下调DLL3抑制胃癌细胞的 增殖,本研究为以DLL3为新靶点对胃癌进行靶向治疗提供新思路。     

补体成分 C3及其缺失突变体蛋白的表达及与 CLIC1蛋白共定位的研究

目的：研究补体成分 C3及其缺失突变体 C3（1-840）、C3（824-1663）在真核细胞内的表达及与氯离子通道蛋白（CLIC1）的共定位。方法构建 pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG、pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG 三个真核表达质粒（缺失突变体根据 C3的结构域及其裂解断裂位置设计）,并分别转染至 HEK 293T 细胞中, Western blot 检测表达情况;上述质粒分别瞬时单转至 COS7细胞和分别与 GFP-CLIC1共转至 COS7细胞内,观察共定位情况。结果成功构建带 FLAG 标签的 C3基因及其两个缺失突变体[C3（1-840）、C3（824-1663）]的真核表达载体, Western blot 结果显示它们在 HEK 293T 细胞中均能成功表达;免疫荧光显示它们在 COS7细胞中均主要分布于细胞质,且三个真核表达载体中只有 C3（824-1663）与 CLIC1有共定位。结论补体 C3及其缺失突变体 C3（1-840）和 C3（824-1663）在 HEK 293T、COS7细胞中均能高效表达,且主要分布在细胞质内,C3（824-1663）与 CLIC1蛋白有共定位。