TRAIL对耐药相关基因SIRT1的作用

目的 观察肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TRAIL)在食管癌细胞中的表达及产生的凋亡作用.方法 构建真核表达载体pcD-NA3.1(+)-TRAIL利用脂质体瞬时转染人食管癌细胞EC9706,并设立转染空载体组和未转染组作为阴性对照;48 h后用RT-PCR和免疫细胞化学方法分别检测其在食管癌细胞中mRNA和蛋白水平的表达;流式细胞技术检测转染重组质粒24、48 h后对食管癌细胞产生的凋亡效应;用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测SIRT1 mRNA和蛋白表达水平.结果 重组真核表达载体peDNA3.1(+)-TRAIL中TRAIL基因能大量表达且对食管癌EC9706细胞产生凋亡效应,并能显著抑制耐药基因SIRT1的mRNA和蛋白水平的表达.结论 TRAIL可抑制食管癌细胞中SIRT1基因表达.     

RNA干扰对喉鳞癌Hep-2细胞增殖及VEGF-C mRNA表达的影响

目的观察载体介导的RNA干扰（RNAi）技术对人喉鳞癌Hep-2细胞增殖及其血管内皮生长因子C（VEGF-C）mRNA表达的影响。方法选择针对人特异性VEGF-C的小RNAi（siRNA）靶序列mRNA,分别设计、合成含有19 nt干扰序列的寡核苷酸（同时随机组合出一条对照序列）,将两两互补的寡核苷酸经退火后所形成的序列克隆到pSuper-neo载体中构建重组体。脂质体法转染重组体至喉鳞癌Hep-2细胞,经G418筛选获得阳性克隆。用流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR检测其VEGF-C mRNA。结果转染VEGF-C靶向siRNA载体的Hep-2细胞生长减慢,S期细胞显著减少,VEGF-C表达水平明显下降。结论VEGF-C靶向RNAi重组体可显著抑制Hep-2细胞增殖及其VEGF-C mRNA的表达。     

RNA干扰对喉鳞癌Hep-2细胞增殖及VEG-C mRNA表达的影响

目的 观察载体介导的RNA干扰(RNAi)技术对人喉鳞癌Hep-2细胞增殖及其血管内皮生长因子C(VEGF-C)mRNA表达的影响. 方法 选择针对人特异性VEGF-C的小RNAi(siRNA)靶序列mRNA,分别设计、合成含有19 nt干扰序列的寡核苷酸(同时随机组合出一条对照序列),将两两互补的寡核苷酸经退火后所形成的序列克隆到pSuper-neo载体中构建重组体.脂质体法转染重组体至喉鳞癌Hep-2细胞,经G418筛选获得阳性克隆.用流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR检测其VEGF-C mRNA. 结果 转染VEGF-C靶向siRNA载体的Hep-2细胞生长减慢,S期细胞显著减少,VEGF-C表达水平明显下降. 结论 VEGF-C靶向RNAi重组体可显著抑制Hep-2细胞增殖及其VEGF-C mRNA的表达.     

siRNA沉默TPX2基因对食管癌细胞EC9706的增殖和TPX2基因表达的影响

目的:研究TPX2基因特异性小干扰RNA(small RNA interference,siRNA)对食管鳞癌EC9706细胞基因表达的抑制作用及对食管癌细胞生长的影响.方法:以食管鳞癌EC9706细胞为研究对象,利用Lipofectamine2000介导TPX2 siRNA分组转染EC9706细胞24,48,72,96 h(实验组),并设立阴性对照组和空白对照组.RT-PCR检测siRNA转染前后TPX2 mRNA的表达水平的变化:Western blot检测转染前后EC9706细胞中TPX2蛋白表达水平的变化;MTT法检测瞬时转染TPX2 siRNA对EC9706细胞增殖的影响.结果:导入有效siRNA后,PT-PCR及Western blot结果显示.TPX2 siRNA可使EC9706细胞中TPX2 mRNA水平及蛋白表达水平下降,至72 h时表达量最低,与空白对照组相比分别为0.31±0.08和0.39±0.12,差异有统计学意义(P<0.05);MTT实验显示细胞的生长增殖受到明显抑制,与对照组相比抑制率可达35.4%(P<0.05).结论:siRNA可以有效抑制EC9706细胞中TPX2的表达,并降低EC9706细胞的增殖能力.     

VEGF-C基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和表达

目的:利用质粒pSilencer3.1-H_1构建针对人血管内皮生长因子-C(VEGF-c)基因的表达载体,测序鉴定并观察在胃癌细胞中的表达.方法:根据质粒pSilencer3.1-H_1要求设计两对小干扰RNA靶序列,退火形成互补的双链,通过与线性化的pSilencer3.0-H_1相应位点连接、转化大肠杆菌,扩增、纯化得到所需质粒,酶切电泳及测序鉴定后转染胃癌细胞株SGC-7901,Western blot检测转染前后VEGF-C基因的蛋白表达.结果:经酶切和测序鉴定,针对VEGF-C基因的siRNA表达载体构建成功.转染胃癌细胞株SGC-7901后,Western blot检测显示VEGF-C基因蛋白表达明显降低,pSilencer3.1-VEGF-C1组抑制效果明显,其抑制率为81.2%,与阴性对照组相比差异具有显著性(P<0.05).结论:成功构建了针对人VEGF-C基因的siRNA表达载体和稳定转染的胃癌细胞株SGC-7901.     

半乳糖凝集素1表达下调对食管鳞癌细胞增殖的影响

目的探索半乳糖凝集素1(Galectin-1)表达下调对食管鳞癌细胞增殖的影响。方法利用细胞转染技术将Galectin-1 siRNA和对照siRNA转染到食管鳞癌EC9706细胞中,细胞分为三组,即未处理组、对照siRNA组和Galectin-1 siRNA组,利用RT-PCR、Western印迹分析Galectin-1基因和蛋白的变化;利用CCK-8试剂盒检测下调Galectin-1的表达对细胞增殖的影响。结果 Galectin-1 siRNA组与未处理组和对照siRNA组相比,Galectin-1 mRNA及蛋白表达明显降低。Galectin-1 siRNA组中的EC9706细胞的增殖明显受到抑制(P<0.05)。结论转染Galectin-1 siRNA后能明显下调食管鳞癌EC9706细胞中Galectin-1 mRNA和蛋白的表达;Galectin-1表达的下调能明显抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖。     

Survivin靶向RNA干扰对人结肠癌HCT116细胞生长影响的研究

目的设计和构建survivin特异性的siRNA真核表达载体,观察survivin siRNA重组体对人大肠癌HCT116细胞株生长的影响,为大肠癌的基因治疗提供理论依据。方法针对survivin mRNA序列设计合成编码siRNA的DNA模板,构建2个survivin RNAi真核表达载体;实验分为survivin siRNA重组质粒转染组、空载体组和HCT116组,转染大肠癌细胞HCT116细胞,采用RT-PCR法检测survivin mRNA的表达,观察重组质粒对转染的HCT116细胞survivin基因表达的影响;用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测量细胞生长情况;用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果测序表明survivin干扰序列完全正确,RT-PCR结果显示2条survivin siRNA真核表达质粒均能有效抑制survivin mRNA的转录表达。MTT比色法检测显示,与阴性对照组及未转染组细胞比较,干扰组细胞增殖率明显下降（P〈0．05）。流式细胞术检测的转染重组质粒组细胞凋亡率高于脂质体对照组和空质粒对照组（P〈0．05）。结论成功构建了survivin干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人大肠癌细胞survivin mRNA表达,并抑制结肠癌细胞生长,促进其凋亡。     

DNA聚合酶β过表达对食管癌EC9706细胞的影响

目的:观察过表达的DNA聚合酶β对食管癌EC9706细胞系的影响.方法:运用PCR方法,从质粒pcDNA3.1-polβ中扩增出野生型和突变型的DNA聚合酶β基因,作为目的片段,定向克隆至pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体,获得野生型和突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-polβ.分别将野生型和突变型的pEGFP-C3-polβ转染EC9706细胞,荧光显微镜观察其定位,绘制生长曲线,测定细胞周期.结果:DNA序列分析证实了重组载体中的DNA聚合酶β序列正确,荧光显微镜结果显示野生型的DNA聚合酶β表达以细胞核为主,突变型的DNA聚合酶β则表达在整个细胞中,明显与野生型的DNA聚合酶β的核定位不同.而且,野生型的细胞生长较对照组缓慢(P＜0.05),野生型的还能抑制EC9706细胞的生长和使S期细胞减少(22.11±0.12 vs 44.86±0.03,P＜0.05),而突变型的则不能促进EC9706细胞的生长,S期细胞增殖不明显(P＞0.05).结论:过表达的野生型食管癌DNA聚合酶β可以降低EC9706细胞的增殖.     

GCSsiRNA载体构建及其对转染人胃癌细胞SGC7901/VCR的作用

根据siRNA设计原则,针对人葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)mRNA序列设计并合成编码siRNA的寡核苷酸序列,并将其克隆入小干扰RNA表达载体,构建重组质粒。将重组质粒转人耐长春新碱的胃癌细胞株(SGC7901/VCR),通过RT-PCR、免疫细胞化学等方法检测转染细胞GCS的表达水平,以生长曲线观察细胞生长情况。结果构建的GCSsiRNA表达载体释放出的片段与预期结果一致;转染SGC7901/VCR细胞后,可使细胞中GCSmRNA及其蛋白表达受抑制,细胞生长减慢。提示GCSsiRNA载体的成功构建及其对GCS表达和细胞生长的抑制,使其可能成为肿瘤基因治疗的一种新手段。     

转染kiss-1基因对人食管癌EC9706细胞裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:研究转染kiss-1基因对人食管癌EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤的作用,探讨其在食管癌基因治疗中的可行性和特异性.方法:在食管癌细胞系EC9706中转染kiss-1基因,经G418筛选,建立稳定高表达Kiss-1蛋白的细胞系.稳定表达该基因的细胞为转染kiss-1基因组,转染空质粒细胞及未处理细胞为对照组,建立裸鼠荷瘤模型;监测肿瘤生长变化,HE染色观察肿瘤病理学变化,RT-PCR、Western blot方法检测kiaa-1 mRNA和蛋白变化.结果:转染kiss-1基因组肿瘤生长受到显著抑制:HE染色显示转染kiss-1基因组及转染空质粒纽肿瘤组织内坏死均较空白对照组多;RT-PCR、Western blot结果表明转染kiss-1基因组裸鼠肿瘤组织kiss-1 mRNA和蛋白表达均显著升高,三组间比较差异具有统计学意义(F=72.685,24.807,均P<0.05).结论:转染kiss-1基因能抑制人食管癌EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤的形成,且能有效上调kiss-1 mRNA和蛋白的表达,可为食管癌的基因治疗提供新的靶点、开辟新的思路.     

VEGF-C and COX-2 expression in papillary thyroid cancer

In papillary thyroid cancer (PTC), age appears to be the most important single prognostic factor. Another characteristic feature is the lack of association between survival and lymph node metastases. Earlier, we found that expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) is higher in older PTC patients, in agreement with the finding that older patients have a worse prognosis. Recent findings suggest that COX-2 can up-regulate vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) expression. Here, we investigated whether expression of VEGF-C differs between young and older PTC patients and whether expression of VEGF-C and COX-2 are correlated. Our retrospective study comprised 106 PTC patients selected by age: those under 35 or over 55 at diagnosis. Paraffin-embedded tissue samples were analysed by immunohistochemistry for VEGF-C protein expression. Furthermore, we investigated by quantitative RT-PCR and enzyme immunoassay the relationship between VEGF-C and COX-2 expression in papillary thyroid cancer cells (NPA cells). VEGF-C expression was significantly increased with age. In the tumours from older lymph node-positive (N1) patients, VEGF-C expression was significantly higher than in the tumours from young N1 patients. Moreover, all patients who died of cancer or who developed distant metastases were old, and most tumours from these patients (4 of 5) expressed VEGF-C and had had nodal metastases at the time of primary operation. Immunohistochemically, expression of COX-2 and VEGF-C correlated strongly. In cell culture, this correlation was not so clear, because the COX-2 selective inhibitor, NS-398, did not reduce VEGF-C expression. However, as both COX-2 and VEGF-C were induced by the tumour promoter phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), the same factors may control them both.     

OPN和VEGF-C在胃癌中的表达及其临床意义

目的:评价骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)在胃癌中表达及与临床病理参数之间相关性,进一步探讨二者的共表达在胃癌淋巴结转移中的机制.方法:收集复旦大学附属中山医院手术切除胃癌组织标本及患者相关临床资料,对纳入研究的93例胃癌原发灶标本采用免疫组织化学染色法(EnVision二步法),检测OPN与VEGF-C蛋白的表达.结果:93例胃癌组织中OPN与VEGF-C的阳性表达率分别为64.5%(60/93)和69.9%(65/93),在非肿瘤性胃黏膜中均未见其阳性表达;OPN和VEGF-C的表达与胃癌浆膜侵犯、TNM分期以及淋巴结转移呈明显相关(P<0.05).蛋白之间的相关性分析显示,OPN与VEGF-C之间存在正相关(r=0.493,P<0.01).结论:联合检测OPN与VEGF-C有助于阐述胃癌发生发展、浸润转移的机制,OPN可能通过上调VEGF-C的表达促进胃癌的淋巴结转移.     

血管内皮生长因子C通过调控神经系统黏附分子-1促进食管癌发展的研究

目的 探讨血管内皮生长因子C (VEGF-C)在食管癌发展中的作用,并研究VEGF-C与神经系统黏附分子-1(CNTN-1)的关系.方法 运用实时定量PCR分析食管癌标本和相应的癌旁组织中VEGF-C/VEGFR的mRNA的表达水平,并构建VEGF-C过表达和基因沉默载体,转染食管癌细胞株TE-1,检测转染前后CNTN-1的表达差异,并运用染色质免疫沉淀(ChIP)法测定细胞转染前后转录因子C/EBP与CNTN-1启动子的相对结合量,以研究VEGF-C是否通过调控CNTN-1基因转录参与食管癌进展.结果 VEGF-C及VEGFR mRNA、CNTN-1 mRNA在肿瘤组织中高表达,且二者之间存在明显相关性.转染VEGF-C过表达载体的TE-1细胞中CNTN-1 mRNA表达显著增强,而转染了两种shRNA载体的细胞,CNTN-1 mRNA水平均降低(P＜0.01).ChIP测定结果发现在CNTN-1上有C/EBP的结合位点,转染VEGF-C过表达载体后,TE-1细胞中C/EBP与CNTN-1启动子的相对结合量显著增高(P＜0.05).结论 食管癌组织中VEGF-C及其受体呈高表达,与食管癌发展相关；VEGF-C可通过影响C/EBP对CNTN-1的转录活性来影响肿瘤细胞TE-1的生长和转移.     

肺腺癌VEGF-C的表达与MVD、MLVD及淋巴转移的关系

目的 探讨肺腺癌血管内皮生长因子-C(VEGF-C)表达与微淋巴管密度(MLVD)、微血管密度(MVD)及淋巴转移之间的关系.方法 RT-PCR法检测36例肺腺癌组织中VEGF-C mRNA的表达,并以免疫组化法检测肺癌组织VEGF-C蛋白的表达、MLVD及MVD.结果 VEGF-C mRNA在肺腺癌组织中的表达比正常肺组织相对较高(P<0.01).VEGF-C蛋白表达在肿瘤周边部位显著高于肿瘤中心部位(P=0.015);其表达与肿瘤分化程度无关,与肿瘤的TNM分期有关,Ⅲ～Ⅳ期显著高于Ⅰ～Ⅱ期(P=0.026).在VEGF-C蛋白阳性组,MVD高于阴性组(P=0.020),MLVD显著高于阴性组(P=0.008),淋巴结转移增多(P=0.039).结论 VEGF- C mRNA在肺腺癌组织中高表达,VEGF-C蛋白表达与肺腺癌血管生成及淋巴管生成和淋巴结转移关系密切.     

CD147基因沉默对甲状腺乳头状癌细胞中VEGF-C表达的影响

目的观察CD147基因沉默对甲状腺乳头状癌细胞株K1中血管内皮生长因子C（VEGF-C）表达的影响,筛选有效的小干扰RNA（siRNA）序列。方法设计合成3对不同的CD147 siRNA,分别转染人K1为实验组（S1、S2、S3组）,同时设不加干预者为正常组,siRNA阴性对照进行干预为阴性对照组。RT-PCR、ELISA法分别测定各组CD147 mRNA及其蛋白。筛选能有效沉默CD147 mRNA及其蛋白的siRNA序列。RT-PCR、Western blot法分别测定CD147表达沉默后K1细胞中的VEGF-C mRNA及其蛋白。结果 S1组CD147 mRNA及其蛋白表达量与正常组、阴性对照组相比,P均〉0.05。S2、S3组与正常组、阴性对照组相比,P均〈0.05。S2、S3组的siRNA序列可有效沉默CD147的表达而S1组不能。S2、S3组CD147 mRNA的表达抑制率分别为67.8%和72.5%;CD147蛋白表达抑制率为31.7%和35.4%。S2、S3组K1细胞中VEGF-C mRNA表达抑制率分别为66.4%和56.6%;其蛋白表达抑制率分别为51.9%和41.6%。结论筛选出了能有效沉默CD147基因表达的siRNA序列。CD147基因沉默后可降低K1细胞中VEGF-C的表达,可能影响肿瘤细胞的淋巴结转移能力。     

环氧化酶-2 血管内皮生长因子-C的表达与胃癌淋巴结转移的关系

目的探讨胃癌组织中环氧化酶-2(COX-2)、血管内皮生长因子-C(VEGF-C)表达的相互关系及其在淋巴结转移过程中的作用和可能机制.方法 收集武汉大学人民医院1999-01～2003-02手术标本.应用免疫组化法检测42例胃癌组织和20例癌旁组织中COX-2及VEGF-C的表达水平.结果 (1)胃癌组织中COX-2、VEGF-C阳性表达率分别为59.5%、64.3%显著高于癌旁非癌组织的10%(P<0.05).(2)COX-2、VEGF-C蛋白的表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.05或P<0.01),与胃癌的分化程度、远处转移无关(P>0.05).(3)COX-2、VEGF-C表达呈正相关(r=0.425,P<0.01).结论 胃癌组织中COX-2、VEGF-C表达均增高并且呈正相关.两者在胃癌淋巴结转移中有协同效应,共同促进胃癌的淋巴转移.     

胃癌组织VEGF-C和CXCR4的表达与淋巴结转移的关系

目的:探讨胃癌组织VEGF-C和CXCR4的表达与淋巴道转移的关系以及两者的相关性.方法:用半定量RT-PCR方法检测50例胃癌组织和相应癌旁组织中VEGF-C和CXCR4的表达水平.结果:在淋巴结转移阴性组(pN_0)胃癌组织(n =12)中VEGF-C的表达指数为0.28±0.09,与pN_1组(0.34±0.08,n=35)比较差别有显著意义(P<0.05);VEGF-C和CXCR4在pN_1组中的表达指数(0.34±0.08,0.3 1±0.08)与pN_2 pN_3组(0.40±0.10,0.43±0.14)比较差别均有显著意义(P<0.05、P<0.01);在淋巴结转移阳性的胃癌组织(n=38)中VEGF-C和CXCR4的表达指数(0.36±0.10,0.35±0.12)高于无淋巴结转pN。组(0.28±0.09,0.26±0.09,n=12),差别有显著意义(P<0.01,P<0.05).VEGF-C和CXCR4在pN_0组中的表达指数(0.28±0.09,0.26±0.09)与相应癌旁组织比较(0.21±0.12,0.20±0.11)差别均无显著意义.经Spearman等级相关分析VEGF-C和CXCR4在胃癌组织中表达之间存在显著相关性(r_s=0.34l,P<0.05).结论:VEGF-C和CXCR4的表达指数随胃癌淋巴结转移的增加而增加,两者之间存在一定相关性,对预测淋巴结转移有重要的临床价值.     

Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) expression in pT2 gastric cancer

BACKGROUND/AIMS: The purpose of this study was to determine whether the vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein expression was related to the clinicopathologic features of patients with pT2 (primary tumor invasion of muscularis propria or subserosa) gastric cancer. METHODOLOGY: The expression of VEGF-C protein was investigated retrospectively in 102 patients with pT2 gastric cancer. Immunohistochemical staining of the paraffin sections was performed using a polyclonal antibody to VEGF-C. RESULTS: Normal gastric mucosa was not immunoreactive with an anti-VEGF-C antibody. Among the 102 tumors examined, 27 (26.5%) showed high expression of VEGF-C protein. No staining was observed in the normal tissue surrounding the tumor. There were no significant differences in age, gender, or histological types. With regard to the clinicopathological characteristics, significant differences were observed in depth of tumor invasion (muscularis propria vs. subserosa; p<0.05), lymph node metastasis (p<0.001), and stage grouping (p<0.001). The prognosis for VEGF-C-positive patients was worse than that for VEGF-C-negative patients in terms of overall survival, and VEGF-C expression was an independent prognostic indicator (p=0.023) by multivariable analysis. CONCLUSIONS: Determination of VEGF-C expression is important in predicting nodal metastasis and poor clinical outcome in pT2 gastric cancer patients.