产肠毒素脆弱类杆菌聚合酶链反应检测

背景:产肠毒素脆弱类杆菌(ETBF)能导致家畜、儿童和成人腹泻,已引起广泛关注,但国内尚未见相关报道。目的:通过ETBF聚合酶链反应(PCR)检测,调查不同人群粪便标本中ETBF的阳性率。方法:建立ETBFPCR检测,评估其敏感性和特异性,并检测正常对照组和腹泻组的ETBF阳性率。结果:PCR的敏感性为1×104CFU/ml,常见肠道正常菌群和致病菌均为阴性。正常对照组(475例)和腹泻组(498例)的ETBF阳性率分别为3.6%和6.4%(P=0.042)。其中成人对照组和成人腹泻组的阳性率分别为2.3%和5.7%(P=0.047),儿童对照组和儿童腹泻组的阳性率分别为5.1%和7.3%(P=0.33)。结论:ETBFPCR检测具有较好的敏感性和特异性,ETBF可能为腹泻的致病因素之一。     

PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素C基因的研究

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素C的快速敏感PCR方法。方法根据金黄色葡萄球菌肠毒素C基因编码序列,设计1对PCR引物来特异性扩增靶基因片段,片段长度为600 bp,通过对1株金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株和5株非金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株进行检测来评价该方法的特异性;对金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株做一系列10倍稀释后进行PCR检测,并对其进行敏感性分析,对PCR扩增产物进行电泳和测序鉴定。结果1株金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株PCR扩增反应呈阳性,5株非金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株PCR扩增反应为阴性;通过基因测序证实了PCR产物的特异性;PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素C基因的检测下限为1.5×10^2cfu/ml。结论本研究建立了一个快速、特异、敏感的金黄色葡萄球菌肠毒素C基因PCR检测方法。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B对人鼻黏膜上皮细胞的促炎作用

目的探讨金黄色葡萄球菌肠毒素B（staphylococcus aureus enterotoxin B，SEB）对原代培养的人鼻黏膜上皮细胞释放促炎因子和（或）趋化因子的作用。方法将无血清原代培养的人鼻息肉及下鼻甲上皮细胞分别在SEB1、10、100ns／ml，白细胞介素（intedeukin，IL）1β 20ng／ml及SEB 10ng／ml＋地塞米松13ng／ml等不同条件下孵育，12、24和48h后采用原位杂交方法检测鼻黏膜上皮细胞分泌的IL-5和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granuloyte macrophagc colony stimulating factor，GM-CSF）在mRNA水平的变化。结果①SEB刺激鼻黏膜上皮时，IL-5和GM—CSF mRNA表达增加，在一定范围内呈现时间和剂量依赖性，以10ng／ml、24h时最明显（P〈0．05），且鼻息肉组的表达高于下鼻甲组，差异具有统计学意义（P〈0．05）；②IL-1β 20ng／ml组IL-5和GM-CSF mRNA表达增加不及SEB 10ng／ml组明显，差异具有统计学意义（P值均〈0．05）；③SEB 10ng/ml＋地塞米松13ng／ml组的IL-5和GM-CSF mRNA表达强度较SEB 10ng／ml组弱，差异具有统计学意义（P值均〈0．05）。结论SEB对原代培养的人鼻黏膜上皮细胞具有促炎作用。     

Effective CD8 T cell priming and tumor protection by enterotoxin B subunit-conjugated peptides targeted to dendritic cells

In our previous studies we have shown that bacterial enterotoxin B subunits are effective vehicles to deliver antigen into the MHC class I processing route. Here we have used the non-toxic Escherichia coli heat labile enterotoxin B subunit (EtxB) conjugated to OVA peptide (EtxB–peptide) to address the impact on induction of specific CD8⁺ T cells in vivo. Although incubation of DCs with these EtxB–peptide conjugates as such did not induce DC maturation in vitro MHC class I antigen presentation was much more efficient as compared to peptide alone. Antigen presentation was further enhanced upon DC maturation with the TLR-4 ligand LPS. Injection of matured DCs incubated with EtxB–peptide conjugates lead to strong induction of OVA-specific CD8⁺ T lymphocytes and fully prevented the outgrowth of lethal B16 melanoma in wild type mice. Our data demonstrate that bacterial non-toxic B subunit–peptide conjugates are potent vaccine vehicles for induction of protective CD8⁺ T cell responses.     

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A对活化T细胞端粒长度影响及其相关机制研究

目的:研究超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对T细胞端粒长度的作用及机制。方法:SEA、K562细胞、SEA联合K562细胞以及抗CD3单克隆抗体分别刺激脐带血单核细胞,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测端粒、hTERT及IL-7R表达。结果:SEA组、K562细胞组、SEA联合K562细胞组及抗CD3单抗组活化T细胞的端粒相对长度比值为1.63±0.08、1.06±0.06、3.24±0.61、1.37±0.07;hTERT的表达差异倍数为1.88±0.07、1.95±0.05、3.93±0.23、1.30±0.06;IL-7R表达差异倍数为6.61±0.52、12.81±0.34、17.42±0.50、4.87±0.66;SEA联合K562细胞组均明显高于其他3组(P<0.01),SEA组对端粒长度影响大于单纯K562细胞组。结论:超抗原SEA可以直接刺激T细胞的端粒酶活性及上调表达IL-7R,联合特异性抗原K562细胞株诱导T细胞活化上调效果更明显。     

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B亚单位防治大鼠高危角膜移植免疫排斥反应的研究

目的探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B亚单位(SEB)对大鼠高危角膜移植免疫排斥反应的防治作用机制。方法实验供体为30只Fisher344和4只Lewis大鼠,受体为64只Lewis大鼠。将实验受体大鼠按随机数字表法随机分为4个治疗组和1个对照组,每组12只;同时设4只Lewis大鼠行同种同体移植。治疗组术前分别用02ml不同浓度的SEB(25、50、75、100μg/kg)腹腔注射诱导免疫耐受。对照组用02ml生理盐水腹腔注射。缝线法诱导受体角膜新生血管,然后行穿透性角膜移植术,术后观察记录植片的存活状况并对受体全身免疫状态进行免疫组化染色,流式细胞分析和淋巴细胞增殖能力检测。结果对照组大鼠角膜植片的平均存活时间为(730±067)d,SEB治疗组(25、50、75、100μg/kg)植片存活时间分别为(643±127)d、(1070±250)d、(1250±141)d、(883±194)d。免疫组织化学染色和流式细胞检测显示SEB治疗组大鼠角膜植片中淋巴细胞的浸润以及外周免疫器官中淋巴细胞亚群百分数较对照组明显降低。此外,SEB治疗组中受体淋巴细胞对供体抗原刺激的反应性降低,外周血中白细胞介素(IL)2浓度降低而IL10浓度升高,其中以SEB75μg/kg组作用最明显。结论在一定剂量范围内,SEB可以诱导大鼠免疫耐受形成,减少局部和全身淋巴细胞数量,并有效防治高危角膜移植免     

金葡菌肠毒素B在烫伤脓毒症大鼠早期肠损害中的作用及意义

目的：探讨金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)在烫伤脓毒症大鼠早期肠损害中的作用。方法：雄性Wistar大鼠86只，随机分为正常对照组（n=10）、烫伤对照组（n=10）、烫伤后金葡菌感染组（n=50）和SEB单克隆抗体（单抗）拮抗组（n=16）。留取血样品测定SEB、内毒素、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）水平；同时测定组织内毒素水平及小肠组织二胺氧化酶（DAO）活性。结果：烫伤后金葡菌感染动物血浆SEB、TNF-α和IFN-γ水平均显著高于正常对照组，并于2 h、6 h达峰值（P<0.05或P<0.01），此后降低；而小肠组织DAO活性则持续低于对照组（P<0.05）。相关分析显示，小肠组织DAO活性与血浆SEB水平呈显著负相关（r=-0.4398，P<0.05）。此外，金葡菌攻击后动物血浆及心、肝、肺、肾等组织中内毒素含量亦明显高于正常和烫伤对照组水平（P<0.05）；SEB单抗干预可不同程度抑制血浆及组织内毒素水平的变化，其中伤后2 h肾脏改变显著（P<0.05）。结论：在严重烫伤后金葡菌感染时，金葡菌的重要致病因子－SEB可加重动物小肠粘膜屏障功能损害，促进肠源性内毒素移位并蓄积于局部组织，后者可能与金葡菌致病因子协同作用导致脓毒症的病理生理过程进一步恶化。     

福氏2a志贺氏菌肠毒素基因分型

目的：对福氏２ａ志贺氏菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ,Ｆ２ａ）的志贺氏肠毒素１（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ１,ＳＥＴ１）和志架氏肠毒素２（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ２,ＳＥＴ２）进行基因分型,提高菌痢暴发流行时同源性分析的水平。方法：对一起暴发Ｆ２ａ菌痢在现场流行病学调查的基础上,用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法,检测４３株Ｆ２ａ菌的志贺氏肠毒素１基因（ｓｅｔ１     

超抗原SEB或SEC对T细胞增殖和活化的影响

目的:探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphy lococcal enterotoxinB,SEB)和金黄色葡萄球菌肠毒素C(staphy lococcal enterotoxinC,SEC)在体外对T细胞增殖和活化的影响。方法:不同浓度SEB或SEC在体外刺激T细胞,采用MTT法检测T细胞增殖水平,在流式细胞仪(flowcytometer,FCM)上检测T细胞受不同浓度SEB或SEC刺激后不同时间其早期活化标志CD69的表达水平。结果:SEB或SEC在体外能明显激活T细胞,以浓度为100μg/L时活化T细胞的作用最强,刺激时间以4～8h为佳,而对T细胞的增殖无明显影响。SEB和SEC活化T细胞的作用强度之间无明显差异。结论:以上结果提示,SEB或SEC具有很强的刺激T细胞活化的能力,为其应用于肿瘤免疫治疗提供了一定依据。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A成熟肽基因序列的克隆及抗原性分析

目的 扩增金黄色葡萄球菌 (金葡菌)肠毒素A(SEA)基因并对其进行抗原性分析,为后续抗原性弱化及安全性免疫毒素的构建提供依据.方法 以金葡菌基因组DNA为模板,以SEA编码基因特异区段为引物,采用Touchdown PCR克隆SEA成熟肽编码基因,经菌落PCR筛选出阳性克隆后再进行DNA测序及BL2SEQ比对分析,并应用生物信息学软件对所得基因编码蛋白各区段的抗原性进行分析.结果PCR产物克隆后,菌落PCR挑选得到阳性克隆,DNA测序后进行的BL2SEQ比对显示,所得序列与GenBank中登录的序列之间一致性达100%.SEA成熟肽各区段上的抗原性均值较高,同时,有几个突出高值点分布在不同的区段上.结论 应用特定的生物信息学方法 从理论上确定了SEA成熟肽的高抗原性位点,为后续弱化SEA的抗原性研究提供了依据.