94例脑干胶质瘤MRI影像与病理分级的关系分析

目的 探讨脑干胶质瘤的MRI影像学特点及其与病理分级的关系.方法 回顾性分析经手术治疗并有明确病理诊断的94例脑干胶质瘤的临床资料,包括MRI及病理资料,并对相关变量进行统计检验,判断该变量与病理分级的关系.结果 脑干胶质瘤直径大小(P =0.029)、是否跨脑干轴位中线生长(P =0.016)、有无坏死灶(P＜0.000)、囊变(P=0.004)以及对基底动脉包绕(P=0.001)在高、低级别胶质瘤之间的分布差异有统计学意义.结论 脑干胶质瘤是一类异质性肿瘤,术前根据肿瘤直径大小、是否跨脑干轴位中线生长,囊变、坏死及基底动脉包绕,可在一定程度上判断脑干胶质瘤恶性程度,指导判断预后.     

人FAT10蛋白过表达诱导饥饿状态下HEK 293细胞发生凋亡

目的:采用flag标记的人FAT10蛋白研究人FAT10蛋白对HEK293细胞的影响。方法:将FAT10基因片段克隆到载体pcDNA3-flag上,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,用脂质体转染HEK293细胞,用Western blotting方法检测外源性FAT10正常培养状态和饥饿状态下的HEK293细胞中的表达情况;并用XTT法和DNA ladder法观察正常培养和饥饿状态下HEK293细胞的凋亡情况。结果:重组质粒在HEK293细胞中高效表达,但在正常培养状态下和饥饿状态下表达情况不同。饥饿状态下,过表达FAT10的HEK293细胞存活率显著低于对照细胞,并且出现DNA ladder现象。结论:成功构建了带Flag标签的FAT10真核表达质粒,可在HEK293细胞中高效表达;FAT10过表达促进饥饿状态的HEK293细胞发生凋亡。     

用T7噬菌体展示筛选系统筛选与靶蛋白相结合的蛋白

目的 :建立有效的T7噬菌体筛选系统 ,筛选与靶蛋白 (信号分子 )有结合关系的多肽或蛋白。方法 :以p38MAPK、PRAK为靶蛋白 ,分别用不同的介质 (ELISA平板和Ni-NTA亲和树脂 ) ,通过结合 -洗脱 -扩增 3个步骤 ,筛选噬菌体cDNA文库 (T7人肝和 /或人肺cDNA文库 )。结果 :选择第四轮筛选后的洗脱噬菌体单个噬斑克隆 ,经EDTA处理后利用特异性PCR引物扩增插入片断 ,回收PCR产物并进行顺序 ,将获得的序列在美国国立卫生院 (NIH)的GenBank数据库中进行同源序列比较 ,获得若干编码蛋白的序列。在这些蛋白中有激酶、转录因子、细胞骨架…     

利用RNAi技术抑制ARPC2基因表达的研究

目的 构建pSUPER-ARPC2表达载体,并在真核细胞中进行表达,验证ARPC2基因表达是否受到抑制。方法 设计特异性针对ARPC2基因的寡核苷酸序列,退火后利用常规酶切、连接方法将其重组至pSUPER basic载体中。对阳性克隆进行酶切和测序鉴定后,转染HEK293细胞,利用RT-PCR和Western blot检测ARPC2基因的表达情况。结果 构建的pSUPER-ARPC2载体导入HEK293细胞时,ARPC2基因的表达受到抑制,蛋白合成减少。结论 成功构建了ARPC2的RNAi表达载体,并证实其能对ARPC2基因的表达产生抑制作用,为进一步研究ARPC2的生理功能提供了重要的实验材料。     

人eNOS启动子不同序列驱动的红色荧光蛋白载体的构建与表达

目的:为了研究人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)启动子的功能,构建在哺乳动物细胞中表达的人eNOS启动子不同区段驱动的红色荧光蛋白报告基因载体。方法:从重组pDseNOSRed载体上将eNOS启动子的不同长度DNA序列亚克隆至红色荧光蛋白载体pDsRed1-1上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定,将重组载体pDsF1033Red,pDsF494Red和pDsF166Red转染NIH3T3细胞,在倒置荧光显微镜下观察它们在细胞内的表达情况。结果:PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组载体pDsF1033Red,pDsF494Red和pDsF166Red的构建正确,这些载体能在NIH3T3细胞中有效表达。由eNOS启动子不同区段驱动表达的95％以上的红色荧光蛋白均匀分布于整个细胞,转染后48-60h开始出现,96-144h为红色荧光蛋白(RFP)的表达高峰,RFP的荧光在144h最强,168h后红色荧光逐渐消退,21d后仍有很少量红色荧光残留。RFP的表达量和荧光强度明显低于强启动子p_CMVIE驱动的RFP。结论:成功构建了eNOS启动子不同区段驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,它们能在哺乳动物细胞中有效表达,静息状态下呈现弱转录活性,为研究人eNOS启动子不同区及其顺式调控元件的作用提供了实用而又方便的工具。     

pNTAP-PRAK真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的: 构建pNTAP-PRAK真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法: 将人的PRAK亚克隆至串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-PRAK,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用PolyFect脂质体介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-PRAK融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-PRAK的表达及细胞内定位情况。结果: 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-PRAK主要分布在核内。结论: 成功构建pNTAP-PRAK真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对PRAK定位产生明显影响。     

内毒素休克小鼠肝血管靶向性结合肽的初步研究

目的研究肽CLTTWAPAC与内毒素休克BALB/c小鼠肝血管的靶向性结合作用。方法构建pET14b-SBP和pET14b-SBP-CLTTWAPAC原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达纯化蛋白SBP和SBP-CLTTWAPAC。建立内毒素休克小鼠模型,将9只内毒素休克BALB/c小鼠随机均分为3组:①PBS对照组(经尾静脉先后注射灭活空噬菌体、PBS和噬菌体CLTTWAPAC,间隔5min);②SBP对照组(经尾静脉先后注射灭活空噬菌体、SBP和噬菌体CLTTWAPAC,间隔5min);③SBP-CLT-TWAPAC组(经尾静脉先后注射灭活空噬菌体、SBP-CLTTWAPAC和噬菌体CLTTWAPAC,间隔5min)。小鼠左心室灌流后取肝匀浆称重,行噬菌体计数,计算各组肝噬菌体单位重量滴度。结果 PBS对照组与SBP对照组肝噬菌体单位重量滴度差异无统计学意义(435185±57824pfu/gvs468290±74106pfu/g,P0.05),而SBP-CLTTWAPAC组肝噬菌体单位重量滴度(176059±98506pfu/g)显著降低,与两对照组比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 CLTTWAPAC可竞争性抑制噬菌体CLTTWAPAC与内毒素休克小鼠肝血管的结合,进一步证明CLTTWAPAC靶向性结合于内毒素休克小鼠肝血管。     

具有细胞穿透功能的串联亲和层析分离载体的构建与功能鉴定

目的建立基于抗生蛋白链菌素结合肽(SBP)-钙调蛋白结合肽(CBP)分离标签以及细胞穿透肽转录反式激活因子(TAT)和绿色荧光蛋白(GFP)原核表达系统的、具有细胞穿透功能的原核串联亲和层析分离系统。方法应用PCR方法,以pEG-FP-C2载体为模板扩增EGFP序列,以pNTAP载体为模板扩增CBP-SBP序列,采用退火方法得到TAT片段,采用常规酶切、连接方法将EGFP、CBP-SBP和TAT片段依次克隆入pET14b-MCStop载体中,酶切、PCR和测序鉴定无误后,得到pET14b-CBP-SBP-EGFP-TAT重组质粒。将重组质粒转化BL21(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni2+-NTA亲和层析纯化获得融合蛋白,将不同浓度的融合蛋白加入培养的人肝癌细胞株(HepG2)检测融合蛋白的穿细胞膜功能。结果所构建的pET14b-MCS-CBP-SBP-EGFP-TAT融合蛋白表达载体正确,该载体可在大肠埃希菌内高效表达,用Ni2+-NTA纯化获得了相对分子量约40kD的目的融合蛋白。细胞功能实验结果表明融合蛋白能够穿越细胞膜,且具有浓度依赖性。结论成功构建了pET14b-MCS-CB...