9 Survivin反义寡核苷酸对人肝癌细胞的抑制作用

目的:探讨survivin反义寡核苷酸（ASODN）对人肝癌细胞HepG2的抑制作用。方法:采用免疫组织化学法检测肝细胞癌（HCC）组织中survivin的表达。采用脂质体介导survivin ASODN体外转染人肝癌细胞株HepG2，Western blot检测细胞survivin蛋白的表达，FCM检测细胞的凋亡率，观察细胞在软琼脂中的集落形成能力。建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，观察survivin ASODN的体内抑癌作用。 结果:（1）肝癌组织中survivin表达阳性率为75.8％(25/33)，明显高于癌旁组织和正常肝组织(P<0.01);（2）survivin ASODN体外转染可明显下调HepG2细胞survivin蛋白表达，ASODN组HepG2细胞凋亡率明显高于空白对照组和SODN组(P<0.01)，ASODN组HepG2细胞在软琼脂中形成的集落数目明显少于空白对照组和SODN组(P<0.01);（3）ASODN组瘤体生长速度较空白对照组和SODN组明显减慢(P<0.01)，ASODN组瘤体重量较空白对照组和SODN组明显减轻(P<0.05)。结论:Survivin在HCC组织中高表达;survivin ASODN可以诱导HepG2细胞凋亡，在体外实验和动物实验中对HepG2细胞生长都有抑制作用。     

Survivin反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞的抑制作用

我们以骨肉瘤OS 73 2细胞为对象 ,在明确其高表达Survivin基础上 ,尝试通过合成靶向Survivin的反义寡核苷酸(ASODN)转染OS 73 2细胞 ,以封闭Sur vivin表达 ,探讨ASODN对骨肉瘤细胞凋亡 /增殖的影响及其对化疗药物的促进作用。一、材料与方法1.材料 :人骨肉瘤细胞株OS 73 2购自北京积水潭医院骨科研究所。针对Survivin基因翻译起始密码区 ,设计合成ASODN (上海生工公司 ) ,序列为 5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG 3′ ,并设正义 (senseoligonucleotide ,SODN )对照 ,序列为 5′GTTCCTCGACCTTCCGACCC3′ ,两组寡核苷酸均…     

生存素反义寡核苷酸对胃癌细胞的抑制作用

目的研究生存素(Survivin)反义寡核苷酸(ASODN)对胃癌细胞系HS746T的抑制作用。方法应用SurvivinASODN转染胃癌细胞,设空白、脂质体和正义链对照组,100、200和400nmol/L反义链组。电镜下观察细胞超微结构,流质细胞术、四甲基偶氮唑盐(MTT)法、逆转录聚合酶链反应(RTPCR)及Westernblot法检测转染后2～48h细胞凋亡指数(AI),生长抑制率(IR),SurvivinmRNA和蛋白表达的变化。结果转染后反义链组均能够下调SurvivinmRNA含量和蛋白表达,凋亡细胞增多。转染后24h100、200和400nmol/L反义链组AI为14.8%、19.4%及53.8%;IR(%)为45.98±2.99、50.96±3.38、72.79±2.48,反义链组高于其他对照组。结论Survivin反义寡核苷酸能够抑制胃癌细胞增殖。     

反义寡核苷酸对丙型肝炎病毒转染胆管癌细胞的抑制作用

目的　探讨反义寡核苷酸 (ODNs)对丙型肝炎病毒 (HCV)转染胆管癌细胞中HCV的抑制作用。方法　通过半定量逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测HCVmRNA表达的变化 ,观察不同浓度 (0～ 6 .0 μmol/L)的HCV核心区ODNs对体外丙肝病毒感染胆管癌细胞 (QBC939)的抑制作用 ;同时以裸鼠为研究对象进一步观察ODNs对HCV的体内抑制作用。结果　ODNs可有效地进入靶细胞在体外与HCV核心基因杂交结合 ,使HCVmRNA的表达明显降低 ,终浓度为 6μmol/L的ODNs作用下无HCVmRNA表达。动物实验观察ODNs组在裸鼠中的瘤体平均直径小于对照组、PBK HCVC转染组 (P <0 .0 1 ) ,成瘤率 2 5 % (5/ 2 0 )低于PBK HCVC转染组 65 % (1 3/2 0 ) (P <0 .0 5) ,成瘤时间 1 5 .3d较对照组 1 2 .0d、PBK HCVC转染组 1 0 .1d延迟 (P <0 .0 1 )。结论　反义寡核苷酸不失为治疗丙肝病毒感染胆管癌新的途径     

靶向端粒酶催化亚单位基因hEST2反义寡核苷酸对人肝癌细胞生长的抑制作用

目的观察靶向端粒酶催化亚单位基因hEST2反义寡核苷酸对人肝癌细胞生长的抑制作用。方法从Genebank中钓取人端粒酶催化亚单位基因hEST2的mRNA序列，通过计算机模建二级结构辅助设计并合成硫化修饰反义寡核苷酸（癌泰得）。采用人肝癌裸小鼠原位移植模型（HCM—Y89）。实验分为生理盐水组，5-Fu10mg／kg组，癌泰得50mg／kg组、75mg／kg组，癌泰得75mg／kg联合5-Fu10mg／kg组、50mg／kg联合5-Fu10mg／kg组。尾静脉给药，每天1次，连续20d。观察移植瘤质量和抑瘤率、移植瘤体积、AFP浓度和移植瘤组织学。结果（1）5-Fu10mg／kg组的抑瘤率为27．85％，其他各治疗组的抑瘤率均在42．14％～74．29％之间；（2）各治疗组瘤质量、瘤体积和AFP浓度均低于生理盐水组且差异有统计学意义；（3）瘤体积和AFP浓度之间呈直线关系，为显著正相关（r=0．9977）；（4）癌泰得和5-FU治疗人肝细胞癌后，肝癌细胞出现不同程度的凋亡、坏死，同时伴有纤维组织增生。结论癌泰得对肝癌细胞生长具有抑制作用，疗效优于5-FU；与5-FU合用具有协同抗肿瘤效应。     

Survivin反义寡核苷酸对肝门部胆管癌细胞株FRH-0201作用的研究

目的 探讨survivin反义寡核苷酸抑制survivin基因表达对肝门部胆管癌细胞FRH-0201的作用.方法 脂质体介导survivin ASODN转染肝门部胆管癌细胞FRH-0201;倒置相差显微镜观察细胞形态学变化;RT-PCR、Western印迹法检测survivin mRNA及蛋白表达水平;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 survivin反义寡核昔酸作用后肝门部胆管癌细胞FRH-0201 survivinmRNA及蛋白表达水平较未转染组显著下降(mRNA:0.51±0.03 vs 0.82±0.02,P<0.05;蛋白:1.82±0.16 vs 3.08±0.27,P<0.05),细胞出现凋亡形态学变化.细胞凋亡率增高(11.50±1.49%vs 0.39±0.08%,P<0.05).结论 survivin反义寡核苷酸能有效下调survivin基因表达,诱导肝门部胆管癌细胞凋亡.     

脂质体介导c-myc基因反义寡核苷酸对人肝癌细胞的生物学影响

目的 探讨应用脂质体（ＬＲ）介导ｃ－ｍｙｃ基因反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）对人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１（７７２１细胞）的生物学影响。方法 利用１ｍｇ／Ｌ ＬＲ包裹２μｍｏｌ／Ｌ ｃ－ｍｙｃ ＡＳＯＤＮ转染于培养的人肝癌细胞,观察其对瘤细胞的作用。结果 四唑盐比色实验（ＭＴＴ）法测定ＬＲ－ＡＳＯＤＮ组作用４８ｈ对瘤细胞生长抑制率（５５％）较无ＬＲ的ＡＳＯＤＮ组的生长抑制率（１５％）显著提高（Ｐ〈０．     

Survivin反义寡核苷酸转染对肝门部胆管癌细胞FRH-0201侵袭性的影响

目的：观察Survivin反义寡核苷酸转染对肝门部胆管癌细胞FRH-0201侵袭能力的影响。方法：针对Survivin基因序列设计合成反义寡核苷酸,阳离子脂质体包裹转染胆管癌细胞株FRH-0201。观察转染后癌细胞生长增殖情况,酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）含量,侵袭小室检测细胞侵袭能力的改变。结果：反义转染组细胞生长及增殖减缓并趋向凋亡,细胞上清液中MMP-2因子较正义转染组及阴性对照组少,且差异有统计学意义（P〈0.05）,TIMP-2因子较另2组有所增加,且差异有统计学意义（P〈0.05）,Transwell实验中反义转染组穿过小室细胞数目较另2组减少（P〈0.05）。结论：Survivin反义寡核苷酸转染可有效抑制肝门部胆管癌细胞增殖,并降低癌细胞的侵袭能力。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞株侵袭力的抑制作用

目的　探讨乙酰肝素酶 (HPSE)反义寡脱氧核苷酸 (AS ODN )对人乳腺癌细胞株侵袭力的抑制活性。方法　设计合成分别互补于HPSEmRNA 5 '未翻译区和起始密码区的AS ODN1、AS ODN2及相应对照NS ODN1、NS ODN 2 ,在脂质体介导下以 2 5 0nmol/L终浓度转染人乳腺癌MDA43 5细胞 ,以RT PCR和Westernblot分别检测HPSEmRNA和蛋白表达 ,以基质凝胶侵袭实验检测细胞侵袭力。结果　AS ODN 2组的HPSEmRNA相对表达量、蛋白表达量和侵袭细胞数(0 .62± 0 .0 4、12 .70± 1.70、61.0 0± 9.0 0 )与脂质体对照组 (1.60± 0 .0 4、3 6.2 0± 2 .10、178.0 0±17.0 0 )和NS ODN2组 (1.48± 0 .0 3、3 5 .5 0± 2 .3 0、174.0 0± 2 0 .0 0 )相比较均显著降低 (P <0 .0 1) ;而AS ODN 1组与脂质体对照组和NS ODN1组相比较差异均无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　互补于起始密码区的HPSEAS ODN可通过下调HPSE表达显著抑制人乳腺癌细胞株MDA43 5的侵袭力。     

内皮素受体A反义寡核苷酸对人前列腺间质细胞增殖的抑制作用

目的　探讨内皮素受体A反义寡核苷酸 (ETAR ASODN)对人前列腺间质细胞体外增殖活性的抑制作用。　方法　原代培养前列腺间质细胞 ,第 4～ 6代细胞经鉴定后加入不同浓度人工合成的ETAR ASODN片段 ,观察细胞增殖情况 ,放射配基结合实验检测内皮素受体A(ETAR)蛋白合成。　结果　加入 5、10、15 μmol/LETAR ASODN的前列腺间质细胞A540 值分别为 0 .30 4± 0 .0 82、0 .2 96± 0 .0 0 8和 0 .194± 0 .0 6 1,增殖活性均较对照组明显降低 (P <0 .0 1) ,且呈浓度依赖性 (P<0 .0 5 ) ;15 μmol/LETAR ASODN对ETAR蛋白合成有明显抑制作用。 　结论　ETAR ASODN能有效抑制前列腺间质细胞的ETAR蛋白表达及体外增殖活性。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞侵袭力的抑制作用

目的探讨HPSE AS-ODN对人胰腺癌细胞HPSE基因、蛋白表达及体内、外侵袭力的抑制作用。方法用脂质体将HPSE AS-ODN转染Panc-1细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR)和Western印迹法分别检测转染后HPSE mRNA和蛋白表达;Transwell法检测体外侵袭力。建立裸鼠皮下Panc-1肿瘤模型,按10 mg／kg体重瘤体内注射AS-ODN隔日1次×10。治疗结束后断颈处死裸鼠,剥瘤称重,计算抑瘤率。结果 AS-ODN组mRNA和蛋白表达受到明显抑制,体外侵袭细胞数(个／视野)为60．00±9．31,体内平均瘤重(g)为1．860±0．505;对照组和NS-ODN组体外侵袭细胞数分别为253．00±9.35和240．75±9．36,体内平均瘤重分别为2．948±0．483和2．768± 0．615。AS-ODN组与对照组相比差异有统计学意义(P<0．01)。结论 AS-ODN抑制人胰腺癌细胞 HPSE mRNA和蛋白的表达,并降低癌细胞的侵袭力。     

阳离子脂质体介导DNA聚合酶α反义寡核苷酸转染并抑制人肝癌细胞的生长

ＤＮＡｐｏｌα是真核生物细胞ＤＮＡ合成的关键酶，与肿瘤的发生及发展密切相关〔１〕。其在肿瘤细胞中含量增加，酶活性增强，ｍＲＮＡ高表达〔２〕。因此以ｐｏｌαｍＲＮＡ为靶核酸而构建的反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）可进入细胞内与靶ｍＲＮＡ特异互补结合，抑制其翻译，使ＤＮＡｐｏｌα的表达减少，从而抑制了人胃〔３〕、肝、人卵巢及乳腺等癌细胞的增殖。我们选用阳离子脂质体脂染素（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ，Ｌｉｐ）与ＡＳＯＤＮ形成复合物，通过Ｌｉｐ介导使靶细胞快速大量摄入ＡＳＯＤＮ，并躲避细胞内外各种酶的降解，…     

反义寡核苷酸抑制Survivin基因表达对PC-3的体外作用

目的　观察Survivin反义寡核苷酸 (ASODN)PC 3细胞表达Survivin蛋白、细胞凋亡、增殖的影响。方法　设计并合成特异性靶向Survivin的ASODN。PC 3分为 6组 :空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组、2 0 0、40 0和 60 0nmol/LASODN转染组。作用 2 4h后收获各组细胞。观察细胞形态变化及超微结构变化 ,免疫组织化学法和流式细胞术法检测各组细胞Sur vivin表达情况 ,流式细胞术检测各组细胞增殖指数 (AI)和凋亡指数 (PI) ,四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法检测ASODN对细胞的生长抑制率。结果　电镜下可见到典型凋亡样改变 ;各ASODN转染组细胞Survivin表达有不同程度减弱 ;2 0 0、40 0和 60 0nmol/LASODN转染组AI和PI分别为 (8.5 0±0 .79) % ,(13 .78± 0 .5 6) % ,(2 1.3 1± 1.67) %和 (3 7.80± 1.72 ) % ,(2 5 .10± 2 .18) % ,(19.90±0 .97) % ,分别与对照组相比差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,而AI和PI在各对照组间差异无显著性(P >0 .0 5 )。转染后第 3天 2 0 0、40 0和 60 0nmol/LASODN组相对于空白对照组的抑制率分别为60 .0 %、66.0 %、78.6%。结论　SurvivinASODN转染后能下调Survivin蛋白表达 ,诱导PC 3细胞凋亡 ,抑制PC 3细胞增殖。     

整合素连接激酶反义寡核苷酸对胃癌细胞的作用

目的探讨全硫代修饰整合素连接激酶(integrin-linkedkinase,ILK)反义寡核苷酸(antisenseoligonucletide,ASODN)导入胃癌细胞株SGC-7901后对胃癌细胞的作用。方法(1)应用脂质体将ILK的ASODN导入胃癌细胞系SGC-7901,以RT-PCR及Western印迹方法检测作用后胃癌细胞ILK的mRNA和蛋白水平的变化;(2)应用MTS法及流式细胞术评价ILK的ASODN导入细胞后对其体外增殖和凋亡的影响。结果(1)转染后胃癌细胞ILK的蛋白表达水平明显下降,但mRNA水平无明显变化;(2)胃癌细胞生长受到明显抑制,抑制效应具有浓度依赖性,并可明显诱导细胞产生凋亡。结论ILK反义寡核苷酸导入胃癌细胞株SGC-7901后可以降低细胞内ILK的蛋白表达水平,并可体外抑制胃癌细胞增殖,诱导胃癌细胞凋亡。     

Survivin反义寡核苷酸对bcl-2、bax表达的影响

人Survivin基因是经效应细胞蛋白酶受体（EPR-1）cDNA在人类基因组库的杂交筛选中分离出来的，因其具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重生物学特性受到关注。我们以Survivin SAO转染C6胶质瘤细胞，进一步观察对其bcl-2和bax的影响及其相关性。     

索拉非尼对人肝癌细胞生长抑制作用的体外研究

目的：探讨索拉非尼对人肝癌（HCC）细胞体外生长及肿瘤相关基因表达的影响。 方法：用不同浓度（0、5、10、20 μmol/L）索拉非尼作用人HCC细胞（Hep3B2.1-7）24 h后,用CCK-8法观察细胞的增殖情况,并分别用real-time PCR与Western blot检测各组HCC细胞p53、PTEN、TGF-β1的mRNA与蛋白表达。 结果：与0 μmol/L索拉非尼处理组（对照组）比较,其余各浓度索拉非尼处理组HCC细胞增殖均明显降低（均P<0.05）;p53、PTEN的mRNA与蛋白表达明显升高,而TGF-β1的mRNA与蛋白表达明显降低（均P<0.05）,以上作用均呈一定的浓度依赖性。 结论：索拉非尼对HCC细胞体外生长有抑制作用,其作用机制与调控肿瘤相关基因的表达有关。     

Survivin基因siRNA对胃癌细胞生长的抑制作用

目的构建携带沉寂Survivin基因的特异性siRNA的表达质粒，鉴定其在胃癌细胞内对Survivin基因表达的沉寂以及对肿瘤细胞生长的抑制。方法合成Survivin基因特异性siRNA，插入到表达载体pAdGFP中构建成pAdGFP—siRNA。培养人胃癌细胞SGC-7901，转染pAdGFP—siRNA，研究该载体在人胃癌细胞内对Survivin基因表达的抑制作用以及对肿瘤细胞生长的抑制作用。结果转染pAdGFP—siRNA后，胃癌细胞SGC-7901的生长受到明显抑制，抑制率为68．2％。免疫组化检查显示，特异siRNA显著降低了癌细胞Survivin基因的表达。结论siRNA技术能够沉寂Survivin基因的表达，抑制癌细胞的生长，改善治疗效果。     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞的抑制作用

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸(ASODN)对骨肉瘤细胞的抑制作用。方法设计合成VEGF ASODN,按不同浓度转染骨肉瘤OS-732细胞,设正义(SODN)和空白对照组进行比较。观察细胞生长状态,Western blot检测VEGF蛋白表达,MTT法测定细胞生长抑制率(IR),流式细胞仪检测细胞凋亡。结果与SODN、对照组比较,ASODN组细胞中VEGF表达显著降低(P<0.05),IR(分别为10μmol/L组34.21%,20μmol/L组39.50%)显著增高(P< 0.05),上述效应呈浓度依赖性;镜下观察ASODN转染细胞代谢衰退,当转染浓度至20μmol/L时,其凋亡率AI值(18.25±0.40)%显著高于对照组(5.20±0.28)%和SODN组[(6.41±0.10)%, P<0.01]。结论ASODN能够特异性封闭骨肉瘤细胞VEGF基因表达;并可抑制细胞增殖,诱导其凋亡。     

bcl-2反义寡核苷酸对肾癌细胞株的生长抑制作用

我们以肾癌细胞株为对象 ,以阳离子脂质体Lipofectin为转染载体 ,通过转染bcl 2mRNA的反义寡核苷酸 ,研究反义基因对肾癌细胞株的生长抑制作用及剂量效应关系。一、材料和方法1.细胞株 :肾癌细胞株ACHN、RCZ、RCW、Caki 1和OS RC 2。用推荐的培养液培养。在细胞对数生长期收获并用于后续实验。2 .寡核苷酸 :分别设计bcl 2mRNA翻译起始端 (ODNs AS1,5’ TCTC CCAGCGTGCGCCAT 3’)和编码区(ODNs AS2 ,5’ AATCCTCCCCCAGTT CACCC 3’)互补的反义寡核酸 ,及相对应的正义寡核苷酸 (S1、S2 ) ,合成、硫代修饰及纯化…