基于iTRAQ蛋白质组学技术筛选类风湿关节炎湿热瘀阻证血清标志物

目的筛选类风湿关节炎(RA)湿热瘀阻证差异蛋白,为进一步研究证候机制及临床辨治提供依据。方法以RA湿热瘀阻证与RA非湿热瘀阻证以及健康对照组各30例,收集血清标本,采用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术(iTRAQ)进行定量标记,再以超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-QE-MS)进行分析检测。所得质谱数据选用Thermo Proteome Discoverer 2.1软件进行蛋白的检索和鉴定,并以Western Blot对筛选蛋白进行验证。结果共得出RA湿热瘀阻证差异蛋白72个,其中上调蛋白25个,下调蛋白47个,RA非湿热瘀阻证中得出上调差异蛋白1个,下调蛋白11个。湿热瘀阻证上调蛋白中有6个蛋白(SAA1、AGP1、HP、AGP2、SAA4、CRP)表达与急性期炎症直接相关;有3个蛋白(ACTB、FGA、FGG)表达与血小板聚集、凝血、纤维蛋白凝块形成相关。与健康对照组比较,湿热瘀阻证组差异蛋白富亮氨酸α2糖蛋白(LRG1)表达水平差异有统计学意义(P0.05);与非湿热瘀阻证组比较,湿热瘀阻证组LRG1蛋白表达差异亦有统计学意义(P0.05)。结论 RA湿热瘀阻证与疾病的活动性存在重要联系。LRG1蛋白可作为RA湿热瘀阻证血清学标志物的价值之一。     

iTRAQ多重化学标记串联质谱技术在蛋白质组学中的应用

i TRAQTM是2004年美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation,ABI)最新推出的一种多肽体外标记试剂,该技术可对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究,具有较好的定量效果、较高的重复性,并且弥补了DIGE及ICAT的不足,正迅速被广大学者所接受。主要从i TRAQ实验原理、实验流程、i TRAQ与其他定量蛋白质组学方法的比较等3个方面进行简要总结。     

基于iTRAQ技术的肾阳虚不育小鼠睾丸差异蛋白表达研究

目的应用iTRAQ技术研究肾阳虚证小鼠睾丸的差异蛋白表达,探讨肾阳虚引起雄性不育的机制。方法选用20只6周龄雄性昆明小鼠,随机分为空白对照组及肾阳虚证组,每组10只,肾阳虚组予氢化可的松25 mg/(kg·d)腹腔注射,空白对照组予生理盐水0.2 mL/d腹腔注射10 d。提取睾丸总蛋白,利用iTRAQ技术对两者进行蛋白质组质谱检测,并通过筛选差异蛋白、GO富集以及Pathway信号通路富集等生物信息学方法分析两组间小鼠睾丸的差异蛋白表达。结果与空白对照组相比,肾阳虚组小鼠睾丸表达的差异蛋白共87个,其中27个上调,60个下调;显著富集于生物过程中"生殖"或"生殖过程"或"精子生成"的差异蛋白18个;主要集中在核糖体通路、PPAR信号通路及钙离子信号通路中信号转导分子的活性改变。GO与Pathway共富集于Rps5、Rps19、Rps28、Rpl11、Rplp1、Rplp2核糖体蛋白。结论肾阳虚证可能通过调节核糖体蛋白的表达进而影响细胞增殖、凋亡、分化及信号转导,或下调表达对精子有保护作用的分子,或影响睾丸脂质代谢及激素水平,从而引起睾丸中生精细胞的发育异常,最终导致精子活性改变及男性不育。     

基于iTRAQ技术研究丹参酮ⅡA对高脂血症大鼠肝脏蛋白质的影响

目的应用相对和绝对定量同位素标记技术(iTRAQ)研究丹参酮ⅡA对高脂血症大鼠肝脏蛋白质组表达的影响,探讨丹参酮ⅡA对肝脏保护的作用。方法 24只SD大鼠随机分为空白对照组、高脂血症组和丹参酮组,每组8只。空白对照组每日给予普通大鼠饲料喂饲。高脂血症组和丹参酮组给予高脂饲料喂饲,4周后丹参酮组予丹参酮ⅡA磺酸钠10 mg/(kg·d)腹腔注射,空白对照组、高脂血症组给予等体积的磷酸盐缓冲生理盐水腹腔注射。用药8周后检测大鼠血脂、肝功能情况以及肝脏组织形态学变化。分离提取肝脏总蛋白,以iTRAQ试剂标记后进行质谱检测并以软件分析差异表达的蛋白质,用Western blot方法验证部分差异蛋白的表达趋势。结果与空白对照组比较,高脂血症组血清TC、TG、LDL-C、ALT、AST水平升高(P0.01),HDL-C水平降低(P0.01);与高脂血症组比较,丹参酮组血清中ALT、AST水平降低(P0.05)。iTRAQ技术分析发现:丹参酮组肝脏中CES1、Apoa1、Acots2、3-KAT及细胞色素P450家族Cyp3a2、Cyp3a18、Cyp4a3、Cyp2b2、Cyp2c23这9个差异蛋白表达量上调,Tkt及eNT表达下调。Western blot验证差异蛋白CES1、Apoa1、Acots2变化趋势与蛋白质组结果相一致。结论丹参酮ⅡA可能通过促进胆固醇逆向转运、脂肪酸氧化,改善肝脏代谢功能,减少肝脏脂质沉积,达到其肝脏保护作用。     

iTRAQ多重化学标记串联质谱技术在生命科学领域中的应用

同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术—利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团,经高精度质谱仪串联分析,可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量,是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术,正迅速被广大学者所接受。主要从iTRAQ实验技术概要、iTRAQ多重化学标记串联质谱技术在生命科学领域中的应用、问题与展望等三个方面进行简要总结。     

二至丸对SAMP8小鼠行为学及海马蛋白质组表达的影响

目的观察二至丸对阿尔茨海默病（AD）模型SAMP8小鼠行为学和海马组织蛋白质表达的影响，探讨二至丸治疗AD可能的作用机制。方法6月龄雄性SAMP8小鼠40只随机分为二至丸低浓度组、中浓度组、高浓度组及模型组，每组10只，另选择10只6月龄雄性SAMR1小鼠作为正常组。二至丸低、中、高浓度组分别予0.15、0.3、0.6 g/mL二至丸灌胃；正常组、模型组予等体积生理盐水灌胃，每天干预1次，连续干预8周。干预结束后，采用水迷宫对各组小鼠进行行为学测试，同时筛选最佳有效剂量浓度组进行后续实验。水迷宫实验结束后，采用iTRAQ蛋白质组学筛选差异表达蛋白，对差异蛋白进行生物信息学分析，包括GO功能注释分析、KEGG通路分析以及STRING-DB网络构建。运用Western Blot方法验证部分差异蛋白的表达水平。结果与正常组比较，模型组逃避潜伏期延长（P<0.01），穿越平台象限次数和停留在原平台象限的时间缩短（P<0.01）。与模型组比较，二至丸中、高浓度组逃避潜伏期缩短（P<0.05），穿越平台象限次数和停留在原平台象限的时间延长（P<0.05）。根据水迷宫实验结果，选取最佳有效剂量即二至丸中浓度组进行后续实验。与模型组比较，二至丸中浓度组有46个差异蛋白，其中15个蛋白上调，31个蛋白下调；正常组有192个差异蛋白，其中25个蛋白上调，167个蛋白下调；二至丸中浓度组与正常组均有表达并且表达趋势相同的差异蛋白有20个，其中10个蛋白上调，10个蛋白下调。这些蛋白质参与多种生物学途径，包括代谢通路、糖酵解/糖异生通路、程序性坏死通路等，涉及二至丸中浓度组和正常组均重复的KEGG通路有69条，差异蛋白之间彼此相互联系构成网络。通过Western Blot验证Hp和Vdac2在中浓度组的表达比模型组减弱（P<0.05）。结论二至丸能改善SAMP8小鼠学习记忆能力，调节其海马组织中多种蛋白质的表达，主要涉及代谢、糖酵解/糖异生、程序性坏死等相关通路蛋白，这可能是二至丸治疗AD的作用机制。     

基于iTRAQ技术探讨家系早发冠心病血瘀证与ITLN1差异蛋白的相关性研究

目的筛选家系早发冠心病血瘀证患者血浆差异蛋白,探讨其对疾病发病的影响,为临床早期诊断提供潜在危险标志物。方法从101例冠心病患者中筛选出典型家系早发冠心病血瘀证患者、家系早发冠心病非血瘀证患者各3例并匹配健康对照组2例,采用同位素标记相对与绝对定量(iTRAQ)技术检测各组血浆蛋白表达情况,通过组间比较分析得出家系早发冠心病血瘀证血浆差异蛋白谱,根据差异蛋白特性及疾病病理特点筛选出疾病早期诊断的潜在危险标志物,以Western blot验证筛选出的蛋白。结果通过iTRAQ技术共得到差异蛋白84个,其中家系早发冠心病血瘀证组与健康对照组之间差异蛋白共32个,包括上调蛋白22个、下调蛋白10个。经GO功能和KEGG富集分析,家系早发冠心病血瘀证血浆差异蛋白生物学功能多与角质化、角质化包膜及表皮结构组成部分有关,其相关通路主要与金黄色葡萄球菌感染、补体系统、血小板激活等相关。验证结果表明,与健康对照组比较,家系早发冠心病血瘀证组差异蛋白内凝集蛋白1(ITLN1)表达水平有统计学意义(P<0.01)。结论根据差异蛋白特性及疾病病理特点筛选出的ITLN1可作为家系早发冠心病血瘀证早期诊断的潜在危险标志物。     

基于中医方证代谢组学研究男仕胶囊治疗肾阳虚证的药效物质基础及作用机制

该研究利用中医方证代谢组学技术研究男仕胶囊治疗肾阳虚证大鼠内源性代谢物的变化,探索与肾阳虚证密切相关的代谢物、代谢通路,鉴定男仕胶囊治疗肾阳虚证的药效物质及作用机制。检测大鼠血清常规生化指标以及观察组织形态,基于中医方证代谢组学技术平台,对大鼠血液和尿液进行多变量模式识别分析,研究肾阳虚证生物标记物及男仕胶囊的治疗作用;在男仕胶囊治疗肾阳虚证有效基础上分析其入血成分与肾阳虚证生物标记物群的相关性,确定其发挥治疗作用的潜在药效物质基础。结果确定了11个与肾阳虚证大鼠模型相关的代谢标记物,涉及类固醇激素的生物合成、色氨酸代谢和酪氨酸代谢等途径。发现男仕胶囊具有调节类固醇激素的生物合成、色氨酸代谢和酪氨酸代谢的作用;PCMS相关分析发现咖啡酸、2-羟基-1-甲氧基蒽醌、1-羟基,2-甲氧基蒽醌、阿魏酸葡萄糖醛酸、木犀草苷、甜菜碱、伞形花内酯和去乙酰基车叶草苷酸为男仕胶囊治疗肾阳虚证的药效物质基础。研究发现男仕胶囊中的木犀草苷、甜菜碱、伞形花内酯等成分通过改善激素合成途径、酪氨酸代谢中激素合成与释放途径以及亚油酸代谢中亚油酸合成途径等,从整体上纠正扰动的代谢轮廓,体现了男仕胶囊治疗肾阳虚证的多途径、多靶点、整体调节的特点。中医方证代谢组学技术为解决基于临床有效性的中药创新药物发现提供方法学支撑。     

基于同位素标记相对和绝对定量技术的联合用药抗肝纤维化作用的蛋白质组学研究

目的以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、牛磺酸和染料木素3种具有不同抗纤维化作用的药物组成联合用药,应用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术研究联合用药对肝纤维化大鼠治疗作用的蛋白质基础及分子机制。方法将SD大鼠分为对照组、模型组和联合用药组,模型组和联合用药组大鼠分别ig 50%CCl4溶液,对照组给予花生油,连续14周。于第9周开始联合用药组进行ig给药(牛磺酸200 mg/kg+EGCG 30 mg/kg+染料木素20 mg/kg)治疗,连续6周。采集大鼠血清和肝组织样本,肝组织进行HE染色观察病理变化,模型组和联合用药组血清样本组内等量混合后去除高丰度蛋白,i TRAQ试剂标记后应用液相色谱分离,经质谱鉴定,进行相对定量及生物信息学分析,用ELISA法对有代表性的血清差异蛋白Txn1进行验证。结果质谱鉴定出置信度在95%以上的蛋白质共359个,其中差异表达的蛋白有78种,上调的蛋白有51种,下调的有27种。与模型组相比,差异蛋白Txn1在联合用药组血清中的量明显升高(P0.05)。结论联合用药能通过对多个蛋白质、多途径的综合调节达到抗肝纤维化的效果,其中对抗氧化防御系统和血液凝固级联活化途径的调节可能是联合用药抗肝纤维化作用的分子机制。     

结合血清代谢组学与支持向量回归机揭示右归丸调节肾阳虚证的代谢标志物群及其作用机制

目的:寻找右归丸(Youguiwan,YGP)治疗肾阳虚证(KYDS)的血清代谢标志物群,并进一步探索右归丸中不同药性的中药(补阳药、补阴药、补血药)对代谢标志物的调节作用。方法:利用核磁共振氢谱(1H-NMR)技术对右归丸治疗的KYDS大鼠进行血清代谢组学研究,并结合模式识别来分析血清代谢物的变化情况,从而寻找右归丸治疗KYDS的代谢标志物。同时,利用支持向量回归机(SVR)建立数学模型,分析和预测了右归丸中不同药性中药的药量变化对代谢标志物的影响,探索右归丸中不同药性的中药起调节作用的代谢物,研究右归丸的作用机制。结果:找出了22个代谢标志物,包括氨基酸代谢(亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、酪氨酸、牛磺酸),糖代谢(乳酸、乙酸和β-葡萄糖),能量代谢(甘油、肌酸、肌醇),菌群代谢[甜菜碱/氧化三甲胺(TMAO)],脂类代谢[极低密度脂蛋白(VLDL),低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)]及糖蛋白[N-乙酰糖蛋白(NAG)]。SVR分析后发现补阳药主要对HDL和甜菜碱/TMAO起作用,补阴药主要对LDL/VLDL,亮氨酸和NAG起作用;补血药主要对肌酸、谷氨酸、乳酸、甲硫氨酸、肌醇和甘油起作用。结论:基于1H-NMR的血清代谢组学能够发现肾阳虚证的代谢标志物群,与SVR结合能进一步揭示右归丸中不同药性中药调节肾阳虚证的作用机制。     

基于iTRAQ技术筛选齐顺保利尔治疗过敏性紫癜前后的血清差异蛋白

目的：过敏性紫癜（HSP）是蒙古族医学治疗的优势病种之一,作为治疗HSP的主要方药,齐顺保利尔（QSBLE）临床效果显著,但其作用机制尚不明晰。基于此,本研究拟筛选患者用药前后血清中差异表达蛋白质,探讨QSBLE治疗HSP的分子作用机制。方法：以患者自身为对照,搜集6～45岁HSP患者30例,分别在每天12:00和24:00口服QSBLE,依据年龄调整剂量,疗程1周。测定所有入组患者治疗前后的蛋白尿、血尿和皮肤紫癜分布。随机选择10例经QSBLE治疗后临床症状明显缓解的患者的血清开展蛋白质组学分析。采用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）联合液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对HSP患者用药前后血清蛋白进行分析,对差异蛋白进行生物信息学分析并构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。结果：从血清中鉴定出378个蛋白,其中差异表达蛋白18个,较治疗前水平上调的蛋白有15个,下调的蛋白有3个。生物信息学分析表明,差异蛋白主要涉及适应性免疫应答、免疫应答、免疫球蛋白产生、吞噬作用等生物过程;以生物过程、通路和蛋白构建PPI网络,免疫球蛋白重常数γ1(IGHG1)、免疫球蛋白λ链7-4...     

基于iTRAQ技术结合2D-LC-MS/MS研究黄连对CYP450同工酶表达的影响

黄连是临床常用药材,在中医药中被广泛应用,具有清热燥湿、泻火解毒之功,中药成分比较复杂,细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)同工酶是药物的主要代谢酶,研究黄连对CYP450酶的影响具有很重要的临床意义。实验选用大鼠肝脏组织,差速离心法分离肝微粒体,BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量,应用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术结合2D-LC-MS/MS筛选差异蛋白。黄连一共鉴定出30个CYP450同工酶,7个表达上调,8个表达下调,15个没有发生变化。iTRAQ技术结合2D-LC-MS/MS可以全面研究CYP450酶,但黄连有必要进一步在体外水平对其进行评价,预防潜在的临床药物相互作用。     

基于代谢组学的肾阳虚证本质研究设想

20世纪50年代开始的肾阳虚证现代研究在取得诸多成果的同时也出现很多问题，如何克服“还原论”方法在处理复杂系统问题方面遇到的挫折，成为中医证候研究面临的问题之一，引入具有全面、系统特点的代谢组学思想和方法是解决办法之一。代谢组学具有的在体观察、代谢产物检测以及根据时间变化动态观测的方法与中医学“整体观念”的特点和“司外揣内”的思维模式有相通之处。而且与传统中医学的“四诊”相比，可以引入科学技术的最新方法，使其更具优势。在此基础上，采用临床和实验研究结合的方式，运用色谱与质谱联用等方法来获取指纹谱，应该可以更清晰准确地描述肾阳虚证存在的裹些特定的代谢组分模式。     

基于绝对和相对定量同位素标记技术研究桃核承气汤延缓肾间质纤维化的机制

目的 研究桃核承气汤延缓肾间质纤维化(renal intersitial fibrosis,RIF)的分子机制.方法 30只SPF级健康wistar雄性大鼠,随机分为假手术组、模型组、药物组,每组10只;假手术组游离单侧输尿管,模型组及药物组采用单侧输尿管梗阻方法建立RIF模型.假手术组、模型组、药物组自术后第一天开始...     

柴胡疏肝散对 SH–SY5Y 细胞内 miR–124 表达 及其相关蛋白调控作用的研究

〔摘 要〕 目的：探索中药柴胡疏肝散对人神经母细胞瘤细胞（SH–SY5Y）内微小 RNA124（miR–124）的调控作用 以及相关蛋白表达的影响,进一步阐明柴胡疏肝散调控神经细胞的具体作用机制和途径。 方法：培养 SH–SY5Y 细胞,转 染 pCDNA3.1–miR–124 质粒,并予柴胡疏肝散干预,提取细胞蛋白并酶解,同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ） 标记,采用高效液相色谱串联质谱法（LC–MS/MS）鉴定蛋白,软件 Proteome Discoverer1.3 处理数据,并进一步进行 生物信息学分析,Western blot 验证差异表达蛋白。 结果：SH–SY5Y 细胞经转染 miR–124 质粒后 miR–124 表达显著上 升,而转染 miR–124 质粒细胞在柴胡疏肝散处理后,miR–124 表达显著下降。表明对于 SH–SY5Y 细胞柴胡疏肝散可以 下调 miR–124 表达。蛋白质组分析共鉴定出肽段 15487 个,蛋白 3707 个。免疫印迹检测差异蛋白 NudE 神经发育蛋白 1（NDE1）,在 miR–124 过量表达时 NDE1 蛋白表达量显著上升,而在柴胡疏肝散与 miR–124 共同作用时该蛋白表达量 显著下调,说明柴胡疏肝散可通过下调 miR–124 表达,进而恢复 NDE1 的正常表达。 结论：本研究表明柴胡疏肝散可能经 miR–124 调控下游相关蛋白表达以及信号通路,从而影响神经细胞的发育、增殖和分化等功能。