土鳖虫多肽的分离纯化及溶栓活性

目的:对土鳖虫多肽进行分离纯化,并对其溶栓活性进行研究.方法:采用仿生酶解工艺制备土鳖虫复合多肽,以溶栓活性为指标,采用Sephadex G-25,SP Sephadex C-25凝胶柱和RP-HPLC C18半制备色谱柱对复合多肽进行分离纯化,并测定目标多肽组分(Peak b)的溶栓活性、肽含量和相对分子质量.结果:目标多肽组分的溶栓活性为814 430 U·mg-1,肽含量为95.7％,相对分子质量分布在3 211～3 547.结论:利用仿生酶解制备的土鳖虫多肽,经分离纯化后,可得到具有较强溶栓活性的多肽组分.     

雄性土鳖虫中不同分子量多肽活性研究

目的:对雄性土鳖虫不同分子量物质进行活性测定,得到最强活性片段。方法:采用不同截留孔径的超滤、纳滤;DA201-c树脂、葡聚糖G25对样品进行分子量分离,得到不同分子量组分,并采用体外抗凝实验、溶栓实验、平板实验等测定其活性。结果:采用超滤、纳滤得到小于1000 Da、1000～3000 Da、大于3000 Da组分,并通过实验测定得到1000～3000 Da的物质活性最强,再通过DA201-C树脂对活性组分进行极性分离,得到三个洗脱组分:25%乙醇洗脱组分、50%乙醇洗脱组分、75%乙醇洗脱组分。并通过抗凝、溶栓试验得到50%乙醇洗脱组分活性最强。再将50%乙醇洗脱组分经过G25进行分离,得到三个峰位,分别记为FIV1、FIV2、FIV3。经抗凝、溶栓实验测得FIV2活性强。在经过高效液相得出FIV2组分的分子量集中于1000～1500 Da。结论:通过超滤、树脂、尺寸排阻色谱分离得到的活性组分,可以进一步进行分离,为以后的肽段测序奠定基础。     

土鳖虫多肽溶液抗肿瘤作用研究

目的：研究土鳖虫多肽溶液抗肿瘤作用。方法：以H22肿瘤小鼠为动物模型,给药10天后处死,取肿瘤、脾脏、胸腺并称重,计算抑瘤率、脾脏系数和胸腺系数;取肝脏检测MDA水平和SOD活性。结果：土鳖虫多肽溶液对H22肿瘤小鼠的抑瘤率为46．79％,脾脏系数和胸腺系数均较模型对照组升高（P〈0．05）;土鳖虫多肽能使肿瘤小鼠肝脏MDA水平降低和SOD活性升高,与模型组比较有差异（p〈0．05）。结论：土鳖虫多肽溶液对H22肿瘤小鼠有抗肿瘤作用。     

土鳖虫多肽对家兔血瘀模型的影响

目的：观察土鳖虫多肽的活血化瘀作用。方法：高分子右旋糖酐静注造成家兔血瘀模型，观察土鳖虫多肽对血瘀模型家兔血黏度、血小板聚集、血栓形成的影响。结果：土鳖虫多肽明显降低血瘀家兔血黏度、抑制血小板聚集和体外血栓形成。结论：土鳖虫多肽具有明显活血化瘀作用。     

土鳖虫胰酶酶解物抗凝活性部位分离纯化及组成分析

目的:采用溶剂萃取和凝胶柱色谱法对土鳖虫胰酶酶解物进行分离纯化,初步确定其抗凝活性部位及化学成分组成。方法:应用胰酶酶解法制备土鳖虫胰酶酶解物,以APTT(活化部分凝血酶时间)为指标,采用溶剂萃取法,获得抗凝活性部位IV,经凝胶柱色谱法对其进行分离纯化获得胰酶酶解纯化物;采用考马斯亮蓝法对纯化物进行定量分析,通过MALDI-TOF-MS检测分离部分的分子量分布范围。结果:土鳖虫胰酶酶解物部位IV有较强的抗凝活性,其抗凝活性强度与酶解物质量浓度相关;部位IV经Sephadex G-25纯化后,通过考马斯亮蓝法测得其蛋白质量分数5.5%;进一步经Sephadex G-10脱盐的纯化物,采用MALDI-TOF-MS检测,确定为相对分子质量在850～910 Da的3组多肽混合物。结论:采用凝胶柱色谱法分离纯化土鳖虫胰酶酶解物是可行的,抗凝活性组分是<1 000 Da的小分子肽类。     

露峰房抗炎蛋白中多肽成分的分离、纯化及性质研究

 目的:从药用露峰房(Nidus vespae)筛选出的具有较好的抗炎、免疫活性蛋白粗品——NV₃中分离纯化,得到一多肽类化合物,命名为NV-PP-1,并检测其理化性质?方法:以离子交换层析、排阻层析、HPLC等进行分离纯化,并以高效凝胶排阻色谱(HPSEC)、高效毛细管等电聚焦电泳(IEF-HPCE)、亲水性分子排阻液相Protein-Pak^TM60柱、氨基酸分析、DNS-Cl法的N-末端测定检测其理化性质。结果:高效凝胶排阻色谱(HPSEC)及高效毛细管等电聚焦电泳(IEF-HPCE)检测其皆为单峰。亲水性分子排阻液相Protein-Pak^TM60柱测得其分子量为7.079kD。IEF-HPCE确定其PI值为4.08。紫外吸收最高峰为274nm。氨基酸分析表明其含有近56个氨基酸残基,其中谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸较多,还有天冬氨酸等,是一酸性多肽。末端测定表明其N-末端封闭。结论:酸性多肽NV-PP-1是从药用露蜂房抗炎蛋白粗品中首次分离得到的成分。     

土鳖虫多肽对正常和免疫抑制小鼠免疫功能的影响

目的 研究土鳖虫多肽对小鼠免疫功能的影响.方法 土鳖虫多肽灌胃给予小鼠10 d,于最后3d腹腔注射环磷酰胺( 50 mg/kg)制备免疫抑制小鼠.观察胸腺、脾脏指数,碳粒廓清指数和血清白介素-2(IL-2)水平.结果 土鳖虫多肽具有促进胸腺和脾脏发育及保护胸腺和脾脏的作用;土鳖虫多肽可显著提高免疫抑制小鼠单核/巨噬细胞的吞噬功能;提高正常和免疫抑制小鼠血清IL-2含量.结论 土鳖虫多肽可提高正常和免疫抑制小鼠的免疫能力.     

麦冬水溶性多糖OPA的分离纯化及其抗氧化活性研究

目的对麦冬水溶性多糖OPA的分离纯化及其抗氧化活性进行研究。方法从麦冬中提取出水溶性粗多糖OP,粗多糖经DEAE Sepharose CL-6B柱层析分离纯化得到OPA。结果经HPLC和醋酸纤维素薄膜电泳法检验是均一组分多糖,GC分析表明OPA的单糖组成是葡萄糖。超氧阴离子清除实验和羟自由基清除实验鉴定其抗氧化能力。结论表明OPA有较强的羟自由基抑制作用。     

罗汉果根多糖的分离纯化及免疫活性研究

目的 从罗汉果Siraitia grosuenorii根中分离纯化多糖组分,初步分析其结构特征并研究其免疫调节作用。方法 干燥罗汉果根经95%乙醇脱脂,用70 ℃水提醇沉得到粗多糖,再经Cellulose DE-52纤维素阴离子交换柱、Sephadex LH-20凝胶柱分离纯化,得到均一多糖LGP-A。采用高效凝胶渗透色谱法（high performance gel permeation chromatography,HPGPC）与PMP柱前衍生化法测定其相对分子质量和单糖组成;通过傅里叶红外光谱（FT-IR）、核磁共振波谱（NMR）、刚果红实验、扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）等方法对LGP-A的初步结构进行分析。利用CCK法、ELISA试剂盒、中性红实验对RAW264.7细胞的增殖、一氧化氮（NO）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）及吞噬能力进行检测,评价LGP-A的免疫活性。结果 LGP-A的相对分子质量为1.83×10⁶,主要由半乳糖（Galp,51.23%）和阿拉伯糖（Araf,44.68%）组成。红外光谱及核磁波共振波谱对其结构分析证明,LGP-A可能主要含有T-α-L-Araf（A）、→3)-α-L-Araf-(1→（B）、→5)-α-L-Araf-(1→（C）、→3,5)-α-L-Araf-(1→（D）、→3)-β-D-Galp-(1→（E）、→3,6)-β-D-Galp-(1→（F）、→6)-β-D-Galp-(1→（G）和→3)-α-D-Galp-(1→（H）片段。质量浓度在0.625～5.0 μg/mL时,LGP-A能促进RAW264.7细胞的增殖,并能明显促进细胞分泌NO、IL-6和TNF-α,提高细胞吞噬率,表明LGP-A具有显著的免疫调节活性。结论 LGP-A是从罗汉果根中得到的天然均一多糖,其初步结构和活性的研究为罗汉果根资源的开发提供了一定的依据。     

参环毛蚓中溶栓活性蛋白酶的纯化和检测

参环毛蚓Pheretima aspergillum (E．Perrier)为《中华人民共和国药典》2000年版一部中收载的地龙药材来源之一。地龙始载于《神农本草经》，具有通络、利尿、清热、定惊、平喘之功，临床常用于高热神昏、惊厥抽搐、关节痹痛、半身不遂、高血压等。日本学者从赤子爱胜蚓中提取出类似尿激酶的物质，     

黄黑小斑蝥纤溶活性蛋白分离纯化及性质研究

目的以药用斑蝥(Mylabris)为原料,从其中分离纯化得到一种具有纤溶性的蛋白MFP(Fibrinolyric Protein of Myla-bris)。方法采用硫酸铵分段盐分、透析和DEAE-32纤维素离子交换层析等纯化方法进行分离纯化,SDS-PAGE电泳测定其分子量,纤维蛋白平板法测定其纤溶活性。结果该目的蛋白相对分子质量约为95.5 kD,其水解纤维蛋白的相对比活力为14.7 u/mg;该成分在35℃下最稳定,65℃及以上活性丧失,金属离子K+,Na+对其活力无影响,Mn2+,Ca2+对其有明显抑制作用,最适pH为6.0。结论研究分离出的斑蝥活性蛋白确为一种具有纤溶性的蛋白组分,并证明其纤溶作用机理为纤溶酶原激活;体外溶栓实验表明,其对血栓的溶解具有一定作用;溶血实验结果表明,该纤溶活性蛋白溶液无溶血反应。     

梅花鹿角脱盘多肽的分离纯化及对乳腺癌细胞端粒酶活性的影响

目的分离纯化梅花鹿鹿角脱盘多肽;以小鼠乳腺癌细胞系MA782为体外研究对象,初步研究鹿角脱盘多肽对肿瘤细胞端粒酶活性的影响。方法采用酸提醇沉法提取鹿角脱盘多肽,再经Sephadex G-25凝胶过滤层析除盐,BCA法测定的多肽蛋白质含量,TRAP-银染法分析MA782细胞端粒酶活性的变化,再利用相对荧光定量PCR技术检测MA782细胞端粒酶催化亚基TERT基因的表达水平。结果分离纯化出鹿角脱盘多肽粗提物,其蛋白质含量为91.800%;TRAP-银染法检测MA782细胞端粒酶的活性发现,与对照组细胞比较,多肽使细胞端粒酶活性有所下降,典型的重复序列条带数依次减少,多肽处理24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后,MA782细胞中相对端粒酶活力分别为91.4、78.3、66.5、47.8、29.2、20.5,呈时间依赖性;相对荧光定量PCR法分析结果表明,与对照组比较,TERT基因的表达水平降低。结论鹿角脱盘多肽对乳腺癌细胞端粒酶活性有一定的抑制作用,可为深入研究鹿角脱盘多肽抗肿瘤活性提供依据。     

土鳖虫多肽F2-2的体外药效研究

目的：通过体外试验,考察土鳖虫多肽F2-2的抗凝、抗血小板聚集与舒张血管药效。方法：以凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血酶原时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原含量（FIB）、血小板聚集率、纤溶图参数与离体血管环张力等为指标,评价多肽F2-2是否具有活血化瘀的作用。结果：土鳖虫多肽F2-2具有延长家兔血浆APTT/PT/TT、降低FIB、降低血小板聚集率、延长凝血启动时间并降低最大凝固程度以及增加大鼠离体血管环张力的作用。结论：体外实验表明,多肽F2-2是中药土鳖虫的活性组分,有继续研究的价值。     

枳壳多糖CALB-1的提取、分离纯化及免疫调节活性研究

目的从枳壳粗多糖中分离纯化得到精制枳壳多糖(CALB-1),并对其结构和免疫调节活性进行研究。方法采用热水提取法提取获得枳壳粗多糖(CALB),通过阴阳离子交换树脂、离子交换琼脂糖凝胶等方法对CALB进行分离纯化,得到CALB-1。采用高效液相色谱法(HPLC)测定CALB-1的相对分子质量。综合运用红外(IR)光谱、高碘酸氧化、Smith氧化降解、甲基化、扫描式电子显微镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)等方法考察CALB-1的结构及分子形态。采用体外脾细胞增殖实验及在体对小鼠单核细胞吞噬作用的影响实验测定CALB-1的免疫调节活性。结果经HPLC测定CALB-1为均一多糖,其相对分子质量为3.28×107。综合化学手段和IR光谱分析得到CALB-1为多支结构的酸性多糖,其主链主要由阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)和半乳糖(Gal)构成,且主要以1→、1→4键型存在。分子形态考察结果显示CALB-1为非晶态固体。CALB-1具有促进小鼠脾细胞增殖的作用,并可提高免疫低下模型小鼠的廓清指数(K)值和吞噬指数(α)。结论 CALB-1为多支结构的均一相对分子质量的酸性多糖,且具有较好的免疫调节作用,为枳壳多糖进一步的深入研究奠定了理论基础。     

一种蚓激酶活性成分的分离纯化及溶栓活性研究

目的从蚓激酶冻干粉中分离纯化具有溶栓活性的蛋白质。方法用柱层析的方法对蚓激酶冻干粉进行分离;采用SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳进行纯度检查和分子量测定;通过大鼠颈总动脉血栓模型和琼脂糖-纤维蛋白平板法进行体内外溶栓活性的考察。结果蚓激酶冻干粉中分离得到了一种具有溶栓活性的蛋白质。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度检查为单一条带,其分子量为29580Da;通过琼脂糖-纤维蛋白平板法测得其单位活性为79715.51U/mg(以尿激酶为对照);在大鼠颈总动脉血栓模型中,在相同剂量(1mg·kg-)1下,与PBS对照组相比,溶栓蛋白质组的平均栓重显著性减轻(P0.01);与尿激酶对照组比较,但无显著性差异,干重有极显著性差异(P0.01),与蚓激酶冻干粉组比较,湿重有显著性差异(P0.05)、干重有极显著性差异(P0.01)。结论本实验从蚓激酶冻干粉中分离纯化得到了一种溶栓活性很强的蛋白质。     

悬钩子木多糖的分离纯化及免疫调节活性研究

目的 从悬钩子木中分离纯化多糖,初步分析其结构特征并进行免疫调节活性研究。方法 采用热水浸提法提取悬钩子木粗多糖（Rubus sachalinensis polysaccharides,RSP）,再经Cellulose DE-52纤维素离子交换柱、Sephadex G-100凝胶柱色谱进行分离纯化;利用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）鉴定纯度并测定相对分子质量;采用气相色谱分析其单糖组成;采用红外光谱和核磁共振波谱对其结构进行初步分析;采用CCK-8法检测其对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响;利用ELISA试剂盒测定其对白细胞介素-2（IL-2）、γ-干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）释放能力的影响。结果 从悬钩子木中分离纯化得到RSP1-1和RSP1-2 2种多糖,相对分子质量分别为13 227（多分散指数1.15）和9 343（多分散指数1.08）;2种多糖均主要含阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其物质的量比分别是RSP1-1（9.5：7.0：10.3：18.6）和RSP1-2（5.7：11.1：10.3：14.2）;红外光谱及核磁波共振波谱对其结构分析证明RSP1-1可能主要含有α-1,3-Ara、β-1,4-Gal、β-1,3-Glc、β-1,3-Man片段,RSP1-2可能主要含有β-1,4-Gal、β-1,3-Glc、β-1,3-Man片段。质量浓度在5~200 μg/mL时,RSP1-1、RSP1-2和RSP2均可刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖（P<0.05）,并且明显促进淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α（P<0.05）,质量浓度为5 μg/mL时能促进淋巴细胞分泌IL-2（P<0.05）。结论 RSP1-1和RSP1-2均为首次从悬钩子木中分离得到的天然来源的均一多糖。红外光谱及核磁共振波谱进一步表征了其纯度和结构特征。RSP1-1、RSP1-2和RSP2均能不同程度促进脾淋巴细胞的增殖,促进淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α,呈现一定的免疫调节活性。     

土鳖虫提取物体外抗凝血活性研究

目的：比较土鳖虫不同提取物对人血浆的抗凝血活性,探讨其抗凝血机制。方法：测定土鳖虫提取物不同萃取部位对凝血酶原时间（PT）,凝斑酶时间（TT）,活化的部分凝血活酶时间（APTT）,纤维蛋白原凝固时间（FCT）的影响。结果：土鳖虫的乙酸乙酯部位显著地延长人门,APTT,下下和FCT;石油醚部位、正丁醇部位也有抗凝活性,作用较弱。结论：土鳖虫乙酸乙酯提取部分抗凝作用最强,能直接抑制凝血酶催化的纤维蛋白原凝固。     

土鳖虫的醇提条件研究

土鳖虫为节肢动物门昆虫纲鳖蠊科昆虫地鳖Eupolyphaga sinensis Walker或冀地鳖Steleophaga plancyi（Boleny）的雌虫干燥体。全国均有,湖南、湖北、江苏、河南、江苏的产品最佳。《神农本草经》云：“主心腹寒热,血积瘕瘕,破坚,下血闭。”《本草纲目》云：“行产后血积,折伤瘀血,重舌,木舌,小儿腹痛夜啼。”土鳖虫具有破瘀血、续筋骨之功效,用于筋骨折伤,瘀血经闭,瘕瘕痞块。     

海胆壳蛋白的分离纯化及抗肿瘤活性

目的：从光棘球海胆（Strongylocentrotus nudus）中分离纯化具有生物活性的海胆壳蛋白。方法：海胆壳先经丙酮脱脂，然后生理盐水提取、超滤、离心得海胆壳蛋白粗品。粗品经超滤、DEAE—Sepharose Fast Flow及Sephacryl S-400柱层析纯化得海胆壳蛋白SUP-1A。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱鉴定其纯度达90％以上。通过MTT法测定了SUP-1A的体外抗肿瘤活性。结果：从海胆壳中分离纯化得到单一蛋白组分的SUP-1A，MTT法表明SUP-1A对多种肿瘤细胞的增殖都有较强的抑制作用。结论：从海胆壳中分离纯化到一种蛋白组分SUP-1A，其具有较强的体外抗肿瘤活性。