脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景：慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率。 目的：构建并鉴定脯氨酰羟化酶 RNA干扰慢病毒载体。 方法：针对脯氨酰羟化酶2基因序列设计RNA干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pGCSIL-GFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA干扰慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。 结果与结论：PCR和DNA测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP载体。说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA干扰慢病毒载体。     

Schwann细胞转染Ha-Ras对β1，4-半乳糖基转移酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ表达的影响

目的：研究原代Schwann细胞转染持续激活型原癌基因Ha-Ras后β1，4-半乳糖基转移酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ，(β-1，4-galactosyltransferaseⅠ，Ⅱ。Ⅴ；β-1,4-GalT-Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ)表达变化。方法：构建Ha-Ras表达质粒和分离纯化大鼠Schwann细胞，将Ha—Ras表达质粒转染到Schwann细胞中。采用Northern Blot方法分析转染细胞中Ha-Ras转染情况和转染后β-1，4-GalT-Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ的表达变化。结果：原代Schwann细胞转染持续激活型Ha-Ras后，β-1，4-GalT-Ⅰ随转染时间延长而表达增高，而β-1，4-GalT-Ⅱ及Ⅴ及的表达无变化。结论：β-1，4-GalT-Ⅰ随Schwann细胞转染时间Ha-Ras延长而表达增高，提示原代细胞表面的β-1，4-GalT-Ⅰ可能与Ha-Ras影响原代细晌增殖的信号途径相关。     

脊髓损伤过程中β-1,4半乳糖基转移酶的表达研究

目的 探讨β-1,4半乳糖基转移酶(β-1,4-GalT)在横断性脊髓损伤后的时空表达变化以及细胞定位情况.方法 将42只成年SD大鼠随机分为假手术组和T9横断伤8 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d组,每组6只.采用实时定量PCR测定损伤后各时间段β-1,4-GalT在脊髓中的表达变化;采用原位杂交与免疫荧光标记方法检测β-1,4-GalT在脊髓中的分布以及伤后的定位改变.结果 脊髓横断损伤后,β-1,4-GalT-Ⅴ在损伤上、下段表达高峰分别出现在损伤后8 h和1 d,之后逐渐下降,至伤后14 d降低至假手术组水平.增高的mRNA主要分布于损伤周围的细胞中及脊髓后角浅层的感觉神经元中.荧光原位杂交结果显示,β-1,4-GalT-Ⅴ主要分布于巨噬细胞和小胶质细胞以及病理状态下的少突胶质细胞.同时β-1,4-GalT-Ⅴ mRNA在损伤后大量表达于富含P物质和IB-4的脊髓后角浅层的感觉神经元中.结论 脊髓损伤后β-1,4-GalT在基因和细胞水平呈现明显的时空变化,并且与巨噬细胞和小胶质细胞以及病理状态下的少突胶质细胞存在共定位.该酶可能参与了损伤后的继发性损伤,即伤后早期的炎性反应,并可能与脊髓损伤后的神经病理性疼痛有关.     

Schwann细胞转染Ha-Ras对β1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ,Ⅱ,Ⅴ表达的影响

目的:研究原代Schwann细胞转染持续激活型原癌基因Ha-Ras后β1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ,Ⅱ,Ⅴ(β-1,4-galactosyltransferase Ⅰ,Ⅱ,Ⅴ;β-1,4-GalT-Ⅰ,Ⅱ,Ⅴ)表达变化.方法:构建Ha-Ras表达质粒和分离纯化大鼠Schwann细胞,将Ha-Ras表达质粒转染到Schwann细胞中.采用Northern Blot方法分析转染细胞中Ha-Ras转染情况和转染后β-1,4-GalT-Ⅰ,Ⅱ,Ⅴ的表达变化.结果:原代Schwann细胞转染持续激活型Ha-Ras后,β-1,4-GalT-Ⅰ随转染时间延长而表达增高,而β-1,4-GalT-Ⅱ及Ⅴ的表达无变化.结论:β-1,4-GalT-Ⅰ随Schwann细胞转染时间Ha-Ras延长而表达增高,提示原代细胞表面的β-1,4-GalT-Ⅰ可能与Ha-Ras影响原代细胞增殖的信号途径相关.     

小鼠TNF-α基因RNAi慢病毒载体的构建及体外研究

目的为探讨TNF-α在C型Niemann-Pick病（NPC）神经变性中的作用,构建携带小鼠TNF-α-siRNA的慢病毒载体并进行体外研究。方法设计3个TNF-α-siRNA序列和1个无关对照序列,克隆到酶切的pSIH1-H1-copGFP siRNA载体;重组质粒转染293T细胞,通过实时定量PCR检测筛选出干扰效果最佳的TNF-α-siRNA;筛选出的pSIH-siRNA、pSIH-negative分别与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生成慢病毒;慢病毒感染BV-2细胞和星形胶质细胞,采用RT-PCR以及Elisa检测TNF-α-siRNA的沉默效果。结果成功构建携带TNF-α-siRNA的慢病毒载体,滴度达2×10^8ifu／L;慢病毒感染BV-2和星形胶质细胞,表达GFP且可下调TNF-α表达。结论TNF-α-siRNA能明显下调TNF-α的表达,为研究和治疗神经变性疾病以及TNF-α相关疾病提供了有力的工具。     

Schwann细胞转染Ha-Ras对 β_1 ,4-半乳糖基转移酶I,II,V表达的影响

目的 :研究原代Schwann细胞转染持续激活型原癌基因Ha Ras后β1,4 半乳糖基转移酶I,II ,V(β 1,4 galactosyltransferaseI ,II ,V ;β 1,4 GalT I,II,V)表达变化。方法 :构建Ha Ras表达质粒和分离纯化大鼠Schwann细胞 ,将Ha Ras表达质粒转染到Schwann细胞中。采用NorthernBlot方法分析转染细胞中Ha Ras转染情况和转染后β 1,4 GalT I,II,V的表达变化。结果 :原代Schwann细胞转染持续激活型Ha Ras后 ,β 1,4 GalT I随转染时间延长而表达增高 ,而 β 1,4 GalT II及V的表达无变化。 结论 :β 1,4 GalT I随Schwann细胞转染时间Ha Ras延长而表达增高 ,提示原代细胞表面的 β 1,4 GalT I可能与Ha Ras影响原代细胞增殖的信号途径相关。     

人EGFL7基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建人类表皮生长因子域7（EGFL7）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法将靶向EGFL7基因的短发夹结构RNA（shRNA）表达序列连接到包含U6启动子及绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中,获得重组质粒,命名为pGCL-GFP-vshEGFL7,经多聚酶链反应（PCR）和测序鉴定后,与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0通过lipofectamine 2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,测定其滴度。结果PCR扩增和测序结果证实EGFL7shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为4.8×107TU/ml。结论成功构建人EGFL7基因shRNA慢病毒载体。     

miR-221基因干扰慢病毒载体的构建及其有效靶序列的筛选与表达检测

目的 构建携带人miR-221 基因的miRNA 干扰慢病毒载体并寻找其有效靶序列,为胶质瘤的研究提供一种新的方法.方法 合成含干扰序列的双链DNA oligo 直接连入酶切后的RNA 干扰载体上.将产物转入细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR 鉴定,阳性克隆即为目的 基因RNA 干扰慢病毒载体质粒.再将目的 基因与目的 载体分别进行双酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转入细菌感受态细胞,再对PCR 鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确即为融合蛋白过表达质粒载体,然后将两种质粒共转染入293T 细胞,用western bolt 法检测其有效敲减靶序列.结果 重组质粒经测序鉴定证明各转录模板完整、正确插入到相应质粒中,共转染后发现编号为PscSI576 的靶点干扰效果最好.结论 本实验成功构建了人miR-221 基因的RNA 干扰慢病毒载体,并找到了有效的干扰靶序列.     

大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定*☆

背景：最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达。 目的：构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率。 方法：选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体通过lipofectamineTM 2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩。采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度。将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96 h提取细胞总蛋白,采用Western blot检测NG2的表达。 结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi。包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011 TU/L。Western blot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%(P < 0.05)。结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

携带DREAM基因小分子干扰RNA重组质粒的构建☆

背景：DREAM是一种多功能蛋白,在细胞中不同位置与不同靶蛋白结合,体外细胞培养和动物实验均证明DREAM参与了许多疾病的发病机制。 目的：构建携带DREAM基因的小分子干扰RNA重组质粒。 方法：设计并合成shRNA对应的两条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,转化感受态E.coli DH5α,获得阳性克隆进行PCR和测序鉴定。 结果与结论：经PCR、酶切及测序证实,重组质粒pDC316-EGFP-DREAM-shRNA-U6片段大小为473 bp,其中插入的片断序列和位点与预期完全一致,说明pDC316-EGFP-DREAM-shRNA-U6重组质粒构建成功。     

小鼠E1A激活基因阻遏子RNA干扰表达载体的构建

背景：血管平滑肌的增殖是动脉粥样硬化及支架内再狭窄发生的重要机制，小鼠E1A激活基因阻遏子（Cellular repressor of E1A-stimulated genes，CREG）可以抑制血管平滑肌的增殖，成为心血管领域新的治疗靶点。 目的：构建小鼠CREG小分子RNA干扰真核表达载体，下调小鼠细胞中CREG基因的表达。 设计、时间及地点：观察性实验，于2007-04/10在解放军沈阳军区总医院心血管研究所完成。 材料：小鼠成纤维母细胞系（NIH3T3）由美国新泽西州Robert Wood Johnson医学院病理实验科李少华教授馈赠。 方法：应用RNA干扰在线设计工具设计4对可与小鼠CREG基因cDNA结合的短发夹RNA。通过化学合成法合成并克隆至pEN_mH1c载体中，与目的载体pDS_hpEY进行LR重组得到4种表达不同shCREG片段的表达载体pDS_shCREGs。应用LipofectamineTM 2000将pDS_shCREGs转染至小鼠NIH3T3细胞，G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。 主要观察指标：应用反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印迹分别检测CREG的沉默效率。 结果：经酶切和DNA测序证实，4种重组pDS_shCREG载体中插入片段的序列正确。反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印迹证实，4种稳定转染细胞中的CREG表达水平均有不同程度的下降，稳定转染pDS_shCREG1的细胞克隆中CREG基因mRNA和蛋白表达分别降低了87%和70%。 结论：成功构建小鼠CREG基因真核干扰表达载体，使体外培养NIH3T3细胞中CREG蛋白表达明显降低。     

沉默Toll样受体4基因表达的RNAi慢病毒载体的构建******

背景：Toll样受体4 (toll-like receptor4,TLR4)是介导内毒素/脂多糖应答的主要受体,在由内毒素诱导的炎性反应的信号通路中发挥着重要作用。 目的：构建人TLR4基因的RNA干扰慢病毒载体,并观察其对人脐静脉内皮细胞TLR4在蛋白水平的沉默效应。 方法：利用Invitrogen在线软件设计人TLR4基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核苷酸后克隆到线性载体pENTRTM/H1/TO的黏性末端,并进行DNA测序。得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组反应,从而获得干扰TLR4基因真核表达的慢病毒载体。在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助复合体和TLR4基因的真核表达慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人脐静脉内皮细胞,检验其干扰TLR4基因表达的有效性。 结果与结论：实验成功构建TLR4基因真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8.7×106 U/mL。免疫印迹杂交结果表明,所获得的慢病毒感染人脐静脉内皮细胞TLR4基因在蛋白水平的表达显著降低。实验成功构建了人TLR4基因慢病毒RNA干扰表达载体,并验证了其在人脐静脉内皮细胞上的有效性。     

人KiSS-1基因克隆及其慢病毒载体的构建**★

背景：慢性病毒载体技术是目前转基因中最有效和最成功的方法，技术操作简便。 目的：克隆转移抑制基因KiSS-1基因不含信号肽的表达序列，构建人KiSS-1基因的慢病毒表达载体。 设计、时间及地点：开放性实验于2006-09/2007-12在福建师范大学发育学院实验室完成。 材料：载体pNL-IRES2-EGFP由福建师范大学发育学院实验室保存。 方法：从人正常胎盘组织中提取总RNA，经反转录-聚合酶链反应得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列，并将其克隆到慢病毒载体pNL-IRES2-EGFP中，构建其表达质粒pNL-IRES2-EGFP-KiSS-1。 主要观察指标：KiSS-1目的基因片段的克隆，重组表达质粒pNL-IRES2-EGFP-KiSS-1的酶切鉴定及测序。 结果：经酶切鉴定和基因序列测定，证实重组入载体pNL-IRES2-EGFP的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列。 结论：成功构建了重组质粒pNL-IRES2-EGFP-KiSS-1。     

大鼠GLUT3基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带大鼠葡萄糖转运体3（GLUT3）基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，为研究GLUT3的生物学功能提供工具。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法获取大鼠GLUT3基因全长cDNA片段，将其克隆至穿梭质粒pShuttle中构建穿梭质粒pShuttle-GLUT3，经酶切后与线性化的腺病毒骨架质粒pAdeno-X体外连接并转化大肠杆菌DH5α，构建重组腺病毒质粒pAd-GLUT3，酶切线性化重组腺病毒质粒后转染293细胞包装成重组病毒颗粒，重组腺病毒在293细胞中反复扩增数代后，分别用聚合酶链反应（PCR）及免疫印记法（western blot）的方法从基因和蛋白表达水平鉴定重组的腺病毒。结果经DNA测序和PCR分析显示GLUT3 cDNA序列正确。成功筛选出重组腺病毒质粒pAd-GLUT3后在HEK293细胞中成功包装出重组病毒，包装后冻融细胞行PCR及western blot检测表明重组腺病毒包装成功。结论本研究成功构建了携带大鼠GLUT3基因的复制缺陷型重组腺病毒载体。     

构建携带重组人胰岛素基因慢病毒表达载体及其病毒包装

背景：腺病毒载体作为脂肪组织工程转基因载体,在应用中存在转导细胞免疫排斥及炎症反应等问题。应用慢病毒作为载体转染干细胞尤其是应用含胰岛素基因的慢病毒载体转染干细胞可避免腺病毒载体的诸多问题。 目的：实验拟构建含有人重组胰岛素(insulin)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行病毒颗粒包装。 方法：应用聚合酶链反应方法获得目的基因,在目的基因上、下游分别加上BamHⅠ,AscⅠ两个酶切位点,进行T载体克隆,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得重组质粒。用限制性内切酶酶切,将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行测序。抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。 结果与结论：通过聚合酶链反应获得长度为347 bp带有BamHⅠ和AscⅠ序列的目的基因。pMD18-T 载体和慢病毒表达载体pLenti6.3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6.3 -insulin-IRES-EGFP构建与预期相匹配,成功包装慢病毒颗粒。     

人神经生长因子β亚基慢病毒载体的构建*

背景：糖尿病神经源性膀胱的发病与神经生长因子缺乏有关,β亚基是构成神经生长因子(NGF)3种亚基中惟一具有生物活性的亚基,慢病毒载体是基因治疗的理想载体。 目的：构建过表达人神经生长因子β亚基(β-NGF)基因的慢病毒载体。 方法：通过目的基因的获得,载体质粒双酶切,载体质粒与目的基因的连接将人β-NGF基因克隆到慢病毒载体质粒pGC-FU中,构建重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF。观察人β-NGF基因的克隆情况,并进行重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF的PCR鉴定和测序。 结果与结论：构建的重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF进行PCR实际获得的产物与预计PCR产物大小一致,即初步判断为构建成功的重组质粒。所获得的β-NGF基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。说明pGC-FU-β-NGF中携带有正确的β-NGF基因。结果证实,实验成功构建了携带人β-NGF基因的重组慢病毒载体质粒。     

小鼠IL-10重组腺病毒载体的构建及对树突状细胞的基因修饰

目的 构建mIL-10腺病毒重组体Ad-mIL-10,获得mIL-10基因修饰的树突状细胞。方法 根据IL-10基因序列及腺病毒载体的多克隆位点,合成包括酶切位点的基因序列,连接到pMD18-T载体并测序鉴定。用基因工程的方法将小鼠IL-10基因克隆到BD Adeno-XTM腺病毒载体,于人胚肾293细胞中包装、扩增病毒并测定IL-10蛋白表达,转染到体外培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞。结果 成功构建小鼠Ad-mIL-10重组腺病毒载体并高包装、扩增成功,测定高表达IL-10蛋白,体外成功培养小鼠骨髓来源的小鼠树突状细胞并顺利转染Ad-mIL-10。结论 用基因工程方法构建小鼠Ad-mIL-10重组腺病毒载体并转染小鼠骨髓来源的树突状细胞是可行的,为进行相关的基因治疗的可能性提供了更充足的理论依据。     

BDNF基因重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-BDNF的构建与鉴定

目的构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因重组逆转录病毒表达载体。方法根据 BDNF基因已知序列,设计合成一对引物并导入HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点;从大鼠海马组织提取总 RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得编码BDNF的基因片段,与克隆载体pMD 18-T Simple连接构建pMDT-BDNF质粒;经HindⅢ、BamHⅠ双酶切,获得BDNF基因片断再克隆至逆转录病毒载体 pLEGFP-N1中构建重组质粒pLEGFP-BDNF。结果限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组子,测序结果证实与已知序列吻合。结论构建的重组逆转录病毒表达载体 pLEGFP-BDNF含有序列正确的大鼠BDNF基因,可以作为今后治疗老年性痴呆动物模型转基因实验的基因来源。