小鼠E1A激活基因阻遏子RNA干扰表达载体的构建

背景：血管平滑肌的增殖是动脉粥样硬化及支架内再狭窄发生的重要机制，小鼠E1A激活基因阻遏子（Cellular repressor of E1A-stimulated genes，CREG）可以抑制血管平滑肌的增殖，成为心血管领域新的治疗靶点。目的：构建小鼠CREG小分子RNA干扰真核表达载体，下调小鼠细胞中CREG基因的表达。设计、时间及地点：观察性实验，于2007-04/10在解放军沈阳军区总医院心血管研究所完成。材料：小鼠成纤维母细胞系（NIH3T3）由美国新泽西州Robert Wood Johnson医学院病理实验科李少华教授馈赠。方法：应用RNA干扰在线设计工具设计4对可与小鼠CREG基因cDNA结合的短发夹RNA。通过化学合成法合成并克隆至pEN_mH1c载体中，与目的载体pDS_hpEY进行LR重组得到4种表达不同shCREG片段的表达载体pDS_shCREGs。应用LipofectamineTM 2000将pDS_shCREGs转染至小鼠NIH3T3细胞，G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。主要观察指标：应用反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印迹分别检测CREG的沉默效率。结果：经酶切和DNA测序证实，4种重组pDS_shCREG载体中插入片段的序列正确。反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印迹证实，4种稳定转染细胞中的CREG表达水平均有不同程度的下降，稳定转染pDS_shCREG1的细胞克隆中CREG基因mRNA和蛋白表达分别降低了87%和70%。结论：成功构建小鼠CREG基因真核干扰表达载体，使体外培养NIH3T3细胞中CREG蛋白表达明显降低。

Constructing RNA interference vector carrying cellular repressor of E1A-stimulated genes in mice