HCVC蛋白调控肝门部胆管癌细胞中NF-кB活性的研究

目的　探讨丙型肝炎病毒核心蛋白 (HCV C)在肝门部胆管癌细胞中对核转录因子 κB(NF- κB)的调控作用。方法　利用稳定表达 HCV C蛋白的 QBC939细胞株 (QBC939HCV C+) ,通过 NF- κB报道基因分析法、凝胶迁移率分析 (EMSA)检测 HCV C蛋白增强肝门部胆管癌细胞 NF- κB的 DNA结合活性和反式激活活性。 RT-PCR、Western blot检测 HCV C蛋白对核转录因子 κB抑制蛋白 α(IκBα) m RNA及 P5 0、P6 5、IκBα蛋白表达及 IκBα蛋白磷酸化的影响。结果　 1EMSA结果显示 QBC939HCV C+细胞系中 NF- κB相对信号密度明显比 QBC939细胞高。 2将 p NF- κB- lun表达质粒转染稳定表达 HCV C蛋白胆管癌细胞系中 ,通过单光子检测仪检测荧光素酶活性 ,结果显示 QBC939HCV C+细胞中活化 NF- κB为 12 .8倍 ,而 QBC939细胞中 NF- κB为 2 .6倍。 3RT- PCR显示IκB m RNA在 QBC939HCV C+细胞和 QBC939细胞中的表达无明显差异 ;Western blot结果显示稳定表达 HCV C蛋白的 QBC939HCV C+细胞株的胞核中的 P5 0、P6 5蛋白高水平表达 ,而未转染 HCV C蛋白的 QBC939细胞仅检测出极低水平的 P5 0、P6 5蛋白。在 QBC939HCV C+细胞胞浆中 IκBα蛋白低水平表达 ,QBC939细胞高水平表达 ,但 IκBα蛋白磷酸化水平则相反。结论　 HCV     

HCVC蛋白调控肝门部胆管癌细胞中NF-κB活性的研究

目的 探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV C)在肝门部胆管癌细胞中对核转录因子κB(NF-κB)的调控作用。方法 利用稳定表达HCV C蛋白的QBC939细胞株(QBC939HCV C ),通过NF-κB报道基因分析法、凝胶迁移率分析(EMSA)检测HCVC蛋白增强肝门部胆管癌细胞NF-κB的DNA结合活性和反式激活活性。RT-PCR、Western blot检测HCV C蛋白对核转录因子-κB抑制蛋白α(IκBα)mRNA及P50、P65、IκBα蛋白表达及IκBα蛋白磷酸化的影响。结果 ①EMSA结果显示QBC939HCV C 细胞系中NF-κB相对信号密度明显比QBC939细胞高。②将pNF-κB-lun表达质粒转染稳定表达HCVC蛋白胆管癌细胞系中,通过单光子检测仪检测荧光素酶活性,结果显示QBC939HCV C 细胞中活化NF-κB为12．8倍,而QBC939细胞中NF-κB为2．6倍。③RT-PCR显示IκB mRNA在QBC939HCV C 细胞和QBC939细胞中的表达无明显差异;Western blot结果显示稳定表达HCVC蛋白的QBC939HCV C 细胞株的胞核中的P50、P65蛋白高水平表达,而未转染HCVC蛋白的QBC939细胞仅检测出极低水平的P50、P65蛋白。在QBC939HCV C 细胞胞浆中IκBα蛋白低水平表达。QBC939细胞高水平表达,但IκBα蛋白磷酸化水平则相反。结论 HCVC蛋白通过增加IκB降解激活的NF-κB在肝门部胆管癌的发生中起重要作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对HePG2细胞增殖和细胞周期的影响

目的 观察核心蛋白对细胞增殖和细胞周期调控的影响。方法 观察表达HCV核心蛋白的细胞株HePG2-C和作为对照的细胞株HePG2-CMV的细胞形态;绘制细胞生长曲线;检测细胞周期;用流式细胞仪、免疫组化染色检测PCNA,P16,P27,P53;半定量RT－PCR检测P16,P27,P53mRNA。结果 转染重组质粒PBK－HVCC的HePG2-C细胞与转染空载体PBK－CMV的HePG2-CMV细胞相比细胞形态未见明显变化。生长曲线显示HePG2 细胞在转染PBK-HCVC和空载体PBK－CMV后,生长速度无明显变化。检测转染空载体的细胞HePG2-CMV 81.3%进入G0／G1期,7．7％进入S期;而转染PBK－HCV C的细胞HePG2-C73%进入G0／G1期,13．7％进入S期。在进一步分子机制的探讨中发现HePG2-C细胞PCNA、P53表达显著增加,P16、P27表达显著降低。 同样的变化也发生在转录水平。结论 HCV核心蛋白可能通过调节某些基因的转录与表达,增加细胞DNA合成,扰乱细胞周期,进而参与致癌过程。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对核转录因子stat3活性的调控作用

目的:探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白对核转录因子stat3活性的调控作用。方法:将表达HCV核心蛋白的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-core转染人源肝细胞系QSG7701,建立稳定表达HCV核心蛋白的细胞株QSG7701-core,利用免疫细胞化学、Western blot及凝胶电泳迁移实验（EMSA）等方法检测stat3的磷酸化及DNA结合活性。结果:在表达HCV核心蛋白的QSG7701细胞中,stat3的磷酸化水平明显低于空白质粒转染组和未转染组,而总stat3的表达水平3组无明显差别;核内磷酸化的stat3阳性信号明显减弱; stat3的DNA的结合活性明显低于空白质粒转染组和未转染组。结论:在人源永生化肝细胞系中HCV核心蛋白的表达可能具有抑制stat3的磷酸化和DNA结合活性的作用,从而抑制JAK/ stat3信号转导通路活化,这可能是HCV干扰素治疗效果不佳的原因之一。     

丙型肝炎病毒核心蛋白生物学功能研究进展

目的：概述丙型肝炎病毒核心蛋白的主要生物学功能。方法：查阅并参考国外近年20多篇相关献资料。结果：综述了丙型肝炎病毒核心蛋白T、B细胞表位及对细胞周期的影响。结论：核心蛋白是丙型肝炎病毒疫苗研究的靶区域,与病毒持续性感染、肝细胞肝癌的发生密切相关,对其深入研究有助于探讨丙型肝炎病毒的致病机制及其防治。     

丙型肝炎病毒核心蛋白活化NF—κB介导的信号传导途径

目的：研究丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV core protein)致病作用的细胞内信号传导途径。方法：将入HCV核心蛋白cDNA克隆至载体pCNX2上,经基因测序及转染Cos-7细胞后检测核心蛋白表达等方法选出构建成功的pCN2-core重组质粒,用该质粒分别与环AMP反应分子（CRE）,血清反应因子（SRF）,血清反应分子（SRE）,活化蛋白－1（AP－1）及核转录因子κB（NF－κB）重组表达质粒共转染Hela细胞,通过检测转染后细胞内荧光素酶活性确定与核心蛋白作用的因子。结果：HCV核心蛋白可激活NF－κB介导的信号传导途径,且随着pCXN2-core转染量的增多,NF－κB被活化的程度也升高,两者呈剂量存关系。结果：HCV核心蛋白通过活化NF－κB介导的细胞内信号传导途径发挥其致病作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对人源肝细胞生物学行为的影响

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对人源肝细胞生物学行为的影响及其相关机制。方法表达HCV核心蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1-core转染人源永生化肝细胞QSG7701,建立稳定表达HCV核心蛋白的细胞株——QSG7701／core,利用生长曲线、平板克隆实验和流式细胞术等方法检测HCV核心蛋白对细胞细胞生物学行为的影响;细胞免疫组织化学检测其对活化的caspase-3蛋白表达的影响;利用Western印迹从磷酸化和非磷酸化水平检测核心蛋白对丝裂原蛋白激酶(MAPK)的影响;运用报道基因和凝胶电泳阻滞迁移实验(EMSA)等方法检测转录激活因子1(AP-1)、核因子κB(NF-κB)等转录因子活性的改变。结果HCV核心蛋白可明显抑制人源永生化肝细胞QSG7701的增殖和凋亡;同时下调MAPK通路激酶磷酸化水平和AP-1、NF-κB等转录因子的活性。结论HCV核心蛋白对MAPK通路和AP-1、NF-κB等转录因子的活性的负调控可能是其抑制增殖和凋亡的主要机制,并在病毒持续感染和病变慢性化以及肝癌(HCC)发生过程中起重要作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白的研究进展

肝细胞癌(HCC)自上世纪90年代已成为我国仅次于肺癌位列第二位的癌症杀手,而丙型肝炎病毒(HCV)携带的慢性感染则成为产生HC的主要危险因素之一。统计发现,高达80%的急性HCV患者会最终转化为慢性肝炎,进而恶变成肝硬化,致肝癌的几率明显上升。HCV属黄病毒科丙型肝炎病毒属,由宿主和病毒的信号肽酶剪接成3个结构蛋白和6个非结构蛋白,其中3个结构蛋白为HCV核心蛋白。有大量研究证实,核心蛋白潜在癌基因是HVV形成的重要促进因素。由于癌基因变异积     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6的反式调节基因研究

目的：筛选、克隆新基因HCBP6转染肝癌细胞后的反式调节基因，探索HCBP6基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法：应用酵母双杂交技术和生物信息学(bioinfonnatics)技术，筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的基因。构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3．1(-)-HCBP6，应用抑制性消减杂交技术对重组表达质粒pcDNA3．1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究，将富集的二次PCR产物与T／A载体连接，并转化大肠杆菌进行文库扩增，随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析。结果：消减文库扩增后得到30个阳性克隆，菌落PCR分析显示，其中24个克隆含有200—1000bp插入片段。对插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得11种蛋白编码基因。结论：应用SSH技术成功筛选了HCBP6对肝癌细胞的反式调节基因，本实验结果对初步探索新基因的功能提供重要的信息，为进一步阐明HCV核心蛋白与HCBP6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据。     

丙型肝炎病毒核心蛋白与转位蛋白相互作用的研究

目的 本文为了探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白（core)在肝肿瘤中起作用的分子机制,研究核心蛋白是否与肿瘤相关蛋白的相互作用。方法 应用酵母双杂交系统3构建HCV核心蛋白诱饵质粒,转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。筛选出30个克隆,对既能在四缺营养缺陷培养基上生长（SD／-Trp-Leu-His-Ade),又能在涂有x-α-gal的四缺培养平皿上长出蓝色菌落,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌后测序,进行生物信息学分析。发现一个可以引起染色体转位的基因即与肿瘤发生有关的基因转位蛋白基因（Translin)同源。为了进一步证实转位蛋白基因所表达蛋白能与HCV核心蛋白相互作用,网织红细胞裂解物进行体外翻译、蛋白之间的免疫共沉淀。结果 结果显示,转位蛋白不但在酵母双杂交中能与HCV核心蛋白相互作用,而且在体外翻译后也能相互作用。结论 HCV核心蛋白可以和转位蛋白相互作用,推测此蛋白可能在HCV致癌中起一定作用,部分解释了HCV引起肿瘤的发病机制。     

Expression of nuclear factor kappa B in hepatitis C virus core gene transfect ed cholangiocarcinoma cells

Objective To establish an experimental model for exploring the role of hepatitis C virus (HCV) in the development of cholangiocarcinomaMethods Recombinant plasmids of HCV- C gene were constructed by molecular cloning techniques and identified by PCR and restriction enzyme mapping. The plasmids were then transfected into QBC939 cells (a cholangiocarcinoma cell line) by Lipofection. After selection with G418, resistant colonies were obtained and analyzed by immunocytochemistry and Western blotting. The morphology was observed by transmission electron microscopy (TEM). The expression of NF- κB was detected by immunocytochemistry.Results Recombinant plasmid was shown by PCR and restriction enzyme mapping to carry the target gene. Moreover, it could efficiently express HCV- C protein in QBC939 cells. HCV- like particles were found in the cytoplasm by TEM, which were spherical with a diameter of 50-80 nm and possessed an outer membrane. Moreover, NF- κB activation could be shown in HCV core- transfected cells.Conclusion Expression of the HCV- C gene in cholangiocarcinoma cells was achieved. Transfected tumor cells (QBC939- HCVc) could be used as a model to study the effect of HCV on the development of cholangiocarcinoma.     

HCV核心和截短的包膜蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性

目的:构建含HCV全长核心基因和截短的包膜蛋白E2基因的重组杆状病毒表达载体,研究其表达和抗原性.方法:以含HCV全长cDNA克隆的pGEM-HCJ4质粒为模板,PCR扩增全长的HCV核心抗原基因和截短的E2基因片段,插入转座载体pFastBacHTa构建重组转座质粒pFB-CE2t,转化DH10Bac大肠杆菌,获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-CE2t,以之转染昆虫Sf 9细胞进行外源基因的表达,并对其抗原性进行ELISA检测.结果:SDS-PAGE和Western blot分析表明Bacmid-CE2t在Sf 9细胞表达了HCV C-E2蛋白,并能利用细胞内蛋白酶将其裂解为单独的C蛋白和截短的E2蛋白.纯化后的蛋白能分别与HCV C蛋白、E2蛋白单抗以及慢性丙型肝炎患者血清反应.结论:HCV核心蛋白和截短的E2蛋白在昆虫细胞中成功表达并具有抗原性.     

乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因融合表达蛋白对肝癌细胞胰岛素样生长因子1受体表达的影响

目的 建立HBV X-HCV C融合蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞胰岛素样生长因子-1的影响.方法 双酶切质粒pXT1 -X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达.流式细胞仪、蛋白印迹检测IGF-1受体蛋白表达.结果 质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达.表达融合蛋白的细胞的胰岛素样生长因子-1受体活性较转染空载体的细胞及单独表达HBV X、HCV C蛋白的细胞明显升高.结论 HBV X-HCV C融合蛋白能显著上调胰岛素样生长因子-1受体活性,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用.     

乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因融合表达蛋白对肝癌细胞端粒酶活性的影响

目的建立HBV X-HCV C融合蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞端粒酶活性的影响.方法双酶切质粒pXT1-X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达.PCR-ELISA法检测端粒酶活性.结果质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达.表达融合蛋白的细胞的端粒酶活性较转染空载体的细胞及单独表达HBV X、HCV C蛋白的细胞明显升高.结论HBV X-HCV C融合蛋白能显著上调端粒酶活性,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用.     

Cloning and sequencing of core gene cDNA of Chinese hepatitis C virus

A hepatitis C virus(HCV)cDNA fragment,534bp in length and designated asQ534,was obtained by PCR amplification with self-designed primers.Q534 was cloned in-to Hinc Ⅱ site of pUC18 and the recombinant plasmid pQ534 was then selected from thebacterial transformants.The sequence analysis indicated that Q534 was a cDNA fragmentof HCV core gene,and located in HCV genome from positions 320 to 853 incorrespondence with Chiron's prototype sequence.The homologies between Q534 and theprototype at the levels of nucleotides and amino acids were 90.0% and 97.6%,respectively.The homologies of Q534 with Japanese HCV-J and HCV-BK strains were 96.6% and97.0% at the nucleotide level,and 98.2% and 98.8% at the amino acid level.In terms ofthe sequence,this Chinese HCV isolate should belong to HCV group Ⅱ.     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的表达载体构建及在酵母中的表达

目的：为探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心（core）蛋白的功能，在真核生物酵母细胞中表达HCV核心蛋白基因。方法：用多聚酶链反应（PCR）的方法在HCV全长质粒pBRTM／HCV为膜板扩增HCV核心蛋白基因，克隆到pGEM－T载体中，双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HCV核心蛋白基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示了HCV核心蛋白在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在，分子量22000ku左右。结论：HCV核心蛋白在酵母中表达成功。     

用T7噬菌体展示技术筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白

目的 用T7噬菌体筛选系统筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白.方法 应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到HCV的核心蛋白作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索.结果 经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与HCV核心蛋白相互作用的蛋白为:Smad interacting-protein 1(SIP1).结论 T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨核心蛋白的致病、致癌机制提供重要依据.     

HCV核心基因转染对QBC939细胞凋亡及细胞周期的影响

[目的]研究丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)对肝门部胆管癌细胞(QBC939)细胞凋亡及细胞周期的影响.[方法]将包含HCV-C基因的真核表达质粒pcDNA HCV-C和空载体,利用脂质体介导将其转染QBC939,经G418筛选获得稳定转染HCV-C的QBC939细胞(QBC939 HCV-C ),RT-PCR和免疫荧光法检测HCV-C蛋白表达,MTT法检测QBC939 HCV-C 细胞、空白质粒转染QBC939(QBC939pcDNA)细胞和未转染QBC939细胞生长增生率;流式细胞术(FACS)检测3组细胞凋亡率和细胞周期,以及QBC939 HCV-C 细胞经Fas抗体诱导凋亡后的细胞周期变化.[结果]①QBC939 HCV-C 细胞增殖率显著高于空白质粒转染QBC939和未转染QBC939细胞增殖率;②细胞未经Fas抗体诱导凋亡时,QBC939 HCV-C 细胞S期(20.1%±1.8%)高于未转染QBC939细胞S期(14.2%±3.6%),QBC939 HCV-C 细胞凋亡率(5.0%±0.7%)低于无HCV-C转染QBC939细胞凋亡率(9.2%±0.7%);③QBC939 HCV-C 细胞经Fas抗体诱导凋亡时,细胞S期低于未经诱导凋亡细胞S期.[结论]HCV-C蛋白具有抑制QBC939细胞凋亡和促进细胞增殖作用.