tPA和VEGF165基因共表达质粒对人血管细胞增殖的影响和纤溶作用

目的：观察组织纤溶酶原激活物（tPA）和血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因共表达质粒在血管平滑肌细胞（VSMC）中的表达,并研究表达产物对血管内皮细胞（VEC）和VSMC增殖的影响和纤溶作用。方法：用脂质体转染法将tPA和VEGF165的共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VSMC,逆转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附实验（ELISA）分别从mRNA水平和蛋白质水平检测tPA和VEGF165的表达;纤溶蛋白板法检测转染基因的VSMC培养基中tPA的纤溶活性;取转染pBudCE4.1/tPA-VEGF165质粒的VSMC培养基培养VEC和VSMC,用四甲基偶氮唑盐（MTT法）和流式细胞技术检测转基因VSMC的细胞培养基对VEC和VSMC增殖的影响。结果：pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VSMC后,RT-PCR和ELISA检测发现,tPA和VEGF165在mRNA和蛋白质水平均有表达;转基因培养基有明显促进纤溶和促VEC增殖作用,而对VSMC增殖无作用。结论：tPA和VEGF165基因共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165能在VSMC表达有生物学活性的tPA和VEGF165,为tPA和VEGF165基因转染防治移植心脏内血管狭窄奠定了基础。     

VEGF165真核表达载体的构建及其在鼠膀胱平滑肌细胞的表达

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF165)真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165,转染鼠膀胱平滑肌细胞并检验其生物学活性.方法 将VEGF165 cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(-),构建真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165;并转染入鼠膀胱平滑肌细胞,采用RT-PCR和免疫荧光染色检测VEGF165基因在鼠膀胱平滑肌细胞中的表达,并用MTT法检测转染后细胞上清液中VEGF165的生物学活性.结果 和结论将构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165转染入鼠膀胱平滑肌细胞后,VEGF的表达增高,转染后细胞上清液具有促使内皮细胞增殖的生物学活性.     

VEGF165-tPA双基因真核表达载体的构建和体外表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)双基因的新型真核表达载体pIRES-VEGF165-tPA,并通过转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,验证载体的体外表达情况。方法将目的基因片段VEGF165和tPA插入到真核表达载体pIRES质粒中,体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,通过实时荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白水平的表达。结果成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,测序结果与预期相符;荧光计数显示体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞的转染效率约为(15.6±3.1)%;实时荧光定量RT-PCR和Western blot证实转染pIRES-VEGF165-tPA质粒组细胞在mRNA和蛋白水平的表达均高于各对照组(均P<0.01)。结论成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,并且实现其在人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞中的表达,为进一步探索其在机械瓣膜抗凝方面的作用奠定了基础。     

含绿色荧光蛋白基因重组质粒的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 构建与增强型绿色荧光蛋白(GFP)融合的重组真核表达载体,并转染大鼠血管平滑肌细胞(A7r5),观察其在A7r5中的表达.方法 采用Trizol法快速提取A7r5的总RNA,经RT-PCR获得线粒体融合蛋白2(mfn2)的cDNA,扩增、纯化、回收mfn2基因片段.用HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切扩增的大鼠mfn2基因片段和质粒pEGFP-N1,然后将这2种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌DH5α.将提取的重组质粒进行酶切鉴定和测序.测序正确的重组质粒用脂质体法转染A7r5,24h后观察GFP表达情况,并用RT-PCR、Western blot方法检测mfia2的表达.结果 扩增出了1条约2.2 kb的片段,酶切结果显示重组质粒被切成4.7kb大小的pEGFP-N1载体和2.2kb大小的目的片段.经测序目的片段的序列与GeneBank中大鼠mfn2基因的开放阅读编码框序列完全一致.细胞转染48h后GFP表达量最多,RT-PCR、Western blot方法检测到mfn2在A7r5中高表达.结论 成功构建了含GFP基因重组真核表达载体,并且可以在A7r5中高表达.     

VEGF165和VEGF165b真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人血管内皮生长因子(VEGF)165和VEGF165b真核表达质粒,为VEGF165和VEGF165b功能研究奠定基础.方法:应用RT-PCR方法从人肺腺癌A549细胞中获得并扩增VEGF165 cDNA,双酶切后与真核表达载体pcDNA3.0连接,构建重组质粒pcDNA3.0-VEGF165,酶切、PCR及...     

uPA和VEGF在宫颈鳞癌组织中的表达和临床意义

目的 探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)与血管内皮生长因子(VEGF)在宫颈鳞癌组织中的表达情况及其与病变的临床分期、组织学分级和淋巴结转移等方面的关系,并分析尿激酶型纤溶酶原激活物与血管内皮生长因子之间的相关性.方法 采用免疫组织化学方法分别检测尿激酶型纤溶酶原激活物与血管内皮生长因子在54例宫颈鳞癌、58例宫颈上皮内瘤变和8例慢性宫颈炎组织中的表达,并进行分析.结果 尿激酶型纤溶酶原激活物和血管内皮生长因子在宫颈炎、宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞癌组织中的表达阳性率分别为25％(25％)、65.5％(51.7％)、81.5％(70.4％),均呈逐渐升高趋势,且有显著性差异(P＜0.05).uPA和VEGF在CINⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级组织中有显著性差异(P＜0.05).在宫颈鳞癌组,uPA和VEGF的表达与临床分期和组织学分级无关(P＞0.05),而与淋巴结转移密切相关(P＜0.05).统计学检验显示,尿激酶型纤溶酶原激活物与血管内皮生长因子在宫颈鳞癌中的表达无明显相关性(P＞0.05).结论 尿激酶型纤溶酶原激活物与血管内皮生长因子均可能作为宫颈鳞癌的肿瘤标志物,对肿瘤的发生起促进作用,在宫颈鳞癌的浸润和转移中起重要作用,可作为反映宫颈癌生物学行为的有效指标.     

t-PA基因克隆及pcDNA3.1t-PA真核表达质粒的构建

目的利用基因工程技术克隆组织纤溶酶原激活物(t-PA)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pcDNA3.1t-PA质粒载体.方法采用高效Trizol试剂快速从人肺组织中提取RNA,RT-PCR获得t-PA cDNA,扩增、纯化、回收t-PA基因片段并将质粒pcDNA3.1和t-PA基因片段分别双酶切,前者纯化回收大片段,后者纯化回收1.9kb片段,再将回收的pcDNA3.1大片段与t-PA基因片段(1.9kb)重组.对重组pcDNA3.1t-PA质粒进行单酶切和双酶切鉴定,并测序.结果成功地从胎儿肺组织中克隆了t-PA基因,并构建了以pcDNA3.1为载体的真核表达质粒载体.结论含t-PA基因新型表达质粒构建的成功将为基因防治血管重建术中局部血栓形成奠定基础.     

uPA、Ki-67和VEGF在宫颈癌组织中的表达及相关性研究

目的 探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、增殖细胞核抗原(Ki-67)和血管内皮生长因子(VEGF)在宫颈浸润癌组织中的表达及与临床病理参数的关系.方法 采用免疫组织化学SP法,分别检测uPA、Ki-67及VEGF蛋白在94例宫颈浸润癌(ICC),83例宫颈上皮内瘤样病变(CIN)和23例正常宫颈上皮(NCE)中的表达,并分析其与宫颈癌临床病理学参数间的关系及三者间的相关性.结果 免疫组化方法显示:从NCE到CIN再到ICC,uPA蛋白阳性表达率分别为8.7％、44.6％和71.3％;VEGF蛋白阳性表达率分别为17.4％、43.4％和76.6％;Ki-67蛋白阳性表达率分别为13.0％、34.9％和67.0％;差异均有统计学意义(P＜0.01).uPA和VEGF在ICC中的表达与盆腔淋巴结转移和临床分期有关(P＜0.01);而与年龄和病理学类型、组织学分级无关(P＞0.05);Ki-67在ICC中的阳性表达与临床分期有关(P＜0.01),而与年龄、盆腔淋巴结转移、病理学类型及组织学分级无关(P＞0.05).在宫颈癌组织中,uPA、Ki-67及VEGF蛋白表达两两间均呈显著正相关(r=0.705,P＜0.01;r=0.871,P＜0.01;r=0.628,P＜0.01).结论 uPA、Ki-67及VEGF与宫颈癌的发生、发展密切相关,联合检测这些指标有助于判断宫颈癌的预后及干预治疗.     

急性心肌梗死大鼠血管紧张素Ⅱ对PAI-1和tPA表达的作用及其机制

目的:探讨急性心肌梗死(AMI)大鼠血管紧张素Ⅱ(AngⅡ) 经AngⅡ1型受体(AT1R)激活细胞外信号调节激酶(ERK)对纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)和组织型纤溶酶原激活物(tPA)活性的调节作用.方法:24只健康SD大鼠,按随机数字表法随机分为假手术组(n=8)、AMI组(n=8)和特异性ERK上游激酶...     

构建人血管内皮生长因子cDNA逆转录病毒表达质粒

目的 :构建人血管内皮生长因子 ( VEGF) c DNA逆转录病毒表达质粒。方法 :采用 PCR方法从 pc DNA- VEGF165质粒中扩增 VEGF165基因 ,在序列两端分别引入 Eco R 和 Bam H 限制性内切酶识别位点 ,并克隆到逆转录病毒表达载体 p LXSN质粒中。结果 :酶切鉴定、PCR扩增以及DNA序列分析表明已经将 VEGF165基因全长序列克隆到逆转录病毒表达载体 p LXSN质粒中 ,获得了 p LXSN- VEGF165重组质粒。结论 :成功地构建了人 VEGF c DNA逆转录病毒表达质粒 ,为进一步临床应用 VEGF c DNA转基因治疗奠定了基础     

Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector Containing the hVEGF165 Gene

Thedevelopmentofgene therapieshas renderedits clinical application feasible.Vascular endothelialgrowth factor( VEGF) hasbeen approved to be usedfor clinical trials.VEGF plays an important role inangiogenesis and prevention of restenosis[1-8] ,butthelow efficiency of plasmid vector restricts its clinicalapplication.In this study,the h VEGF165c DNA wassubcloned into p ACCMV .p Lp A and subsequentlythis recombinant was co- transfected into 2 93cellswith p JM1 7to obtain the replication- …     

大鼠血管平滑肌细胞中bFGF及其受体FGFR-1的基因表达

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及其受体FGFR-1在大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的表达情况。方法：建立大鼠血管平滑肌细胞原代培养并鉴定；使用原位杂交检测VSMCs中bFGF及其受体FGFR-1的mRNA表达；用免疫组织化学和Western Blot技术鉴定bFGF蛋白表达情况。结果：通过光镜和免疫组织化学技术从细胞形态和结构上使VSMCs得到鉴定；原位杂交证实大鼠VSMCs表达bFGF及其受体FGFR-1的mRNA；免疫组织化学表明VSMCs的胞核和胞浆中有bFGF蛋白表达，Western Blot显示bFGF有18KDa、22KDa、22．5KDa3种异构体形式。结论：大鼠血管平滑肌细胞表达bFGF及其受体FGFR-1 mRNA，bFGF有多种异构体形式并分布在VSMCs的胞核和胞浆中。     

人血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠骨髓基质细胞的实验研究

目的探讨对大鼠骨髓基质细胞进行重组人血管内皮细胞生长因子(VEGF)165基因修饰的可行性。方法采用全骨髓细胞贴壁培养法获得稳定的大鼠骨髓基质细胞,分别在脂质体LipofectamineTM2000和新型的阳离子聚合物Sofast介导下行pcDNA3.1-VEGF165转染骨髓基质细胞,在倒置显微镜下观察转染后细胞形态和生长情况的变化,通过免疫细胞化学鉴定VEGF在细胞中的表达情况。结果脂质体LipofectaminTM和新型阳离子聚合物Sofast介导转染的阳性细胞率分别为11.34%和11.42%,两者无明显差异。而细胞存活率分别为74.60%和85.88%,后者稍高于前者(P<0.05)。结论真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165可以成功地在骨髓基质细胞中表达,新型阳离子聚合物Sofast的转染效率与传统的脂质体无明显差异,而细胞毒性略小于传统的脂质体。     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体构建

目的获得人血管内皮生长因子（hVEGF165）cDNA,构建其真核表达载体。方法采用PCR技术,从HL60细胞中扩增出hVEGF165 cDNA,将其克隆至pcDNA3真核表达载体上,构建成为pCD-hVGEF165重组质粒。结果经酶切鉴定,克隆的基因片段为人hVGEF165 cDNA;建立了pCD-hVGEF165重组质粒。结论成功地克隆和表达出了人VEGF165基因,为大量制备重组质粒的研究奠定了基础。     

重组人血管内皮生长因子165在Pichia酵母中的表达

目的：采用基因工程方法构建基因工程菌制备人VEGF165蛋白。方法：自人肿瘤组织中获取人VEGF165 cDNA,构建pPIC9K酵母表达载体,采用Pichia酵母真核表达系统表达目的蛋白。结果：SDS-PAGE及Westem-blot结果显示目的蛋白已成功表达。结论：在Pichia酵母中成功表达人VEGF165。     

Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector Containing the hVEGF165 Gene

Summary To construct the recombinant adenovirus vector containing the cDNA for human vascular endothelial growth factor (hVEGF₁₆₅), the cDNA for hVEGF₁₆₅ was subcloned into pACCMV · pLpA. Subsequently, this recombinant pACCMV · hVEGF was co-transfected into 293 cells together with pJM17 to obtain the replication-deficient recombinant adenovirus containing hVEGF gene — Ad-CMV · hVEGF. The VEGF gene expression was detected by using RT-PCR and Western blot in rabbit aorta vascular smooth muscle cells (VSMC) infected with AdCMV · hVEGF. Cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were incubated with the conditioned medium (CM) from above mentioned VSMC infected with AdCMV · hVEGF to observe the effect of VEGF on proliferation of HUVEC. 48 h after the infection with AdCMV · hVEGF, VSMC demonstrated VEGF expression, and the expressed VEGF could stimulate the proliferation of HUVECin vitro. Successfully prepared AdCMV · hVEGF₁₆₅ could express biologically active VEGF in infected VSMC, and stimulate proliferation of HUVEC.     

神经肽Y刺激的大鼠VSMCs增殖中CaN活性及c-fos表达水平的变化

目的观察神经肽Y(neuropeptideY ,NPY)刺激的大鼠血管平滑肌细胞 (VSMCs)增殖中钙调神经磷酸酶 (calcineurin ,CaN)活性及c fos表达水平的变化。方法采用组织贴块法 ,体外原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞 ;NPY刺激培养的大鼠VSMCs增殖 ;CaN特异性抑制剂环孢素A(cyclosporinA ,CsA)阻断NPY刺激的大鼠VSMCs中CaN依赖的信号转导通路 ;观察各因素对CaN活性、细胞增殖活度、核内原癌基因c fos表达水平的变化。结果在一定范围内 ,NPY(10 7～ 10 5mol L)以浓度依赖性方式增加VSMCs的CaN活性 ,同时细胞增殖活度(AMTT值 )增高 ,与对照组相比 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 1或P <0 .0 0 1)。CsA(1μmol L)抑制CaN活性后 ,明显降低NPY(10 6 mol L)刺激的VSMCs增殖活度及核内c fos表达水平 (OD值 ) ,与NPY组相比较 ,差异显著 (P <0 .0 0 1)。结论CaN参与了NPY刺激的VSMCs增殖 ,激活早期立即反应基因的转录表达 ,促进细胞增殖。