体外AGEs诱导培养的视网膜Mller细胞增殖活性和分泌VEGF的改变

目的：探讨体外Mvller细胞在糖基化终末产物（AGEs）作用下增殖活性的变化。 方法：采用本实验室培养及鉴定的新生大鼠Mvller细胞,设置正常生长组和添加AGEs培养组,AGEs浓度在250～1000mg/L范围内逐步递增。MTT法测定AGEs对体外纯化培养Mvller细胞增殖的影响和分泌VEGF的改变。 结果：高浓度AGEs对Mvller细胞有明显的促增殖作用,并且促进Mvller细胞分泌VEGF,并在一定的浓度范围内（250～1000mg/L）细胞增殖活性呈剂量依赖关系。 结论：体外高浓度AGEs可促进Mvller细胞异常增殖和VEGF表达增加,与临床上观察到增殖性糖尿病视网膜病变时胶质细胞反应性增生情况一致,因此可以在体外用高浓度AGEs模拟体内糖尿病环境,观察胶质细胞形态和功能的改变。     

体外AGEs诱导培养的视网膜Mvller细胞增殖活性和分泌VEGF的改变

目的：探讨体外Mvller细胞在糖基化终末产物（AGEs）作用下增殖活性的变化。 方法：采用本实验室培养及鉴定的新生大鼠Mvller细胞,设置正常生长组和添加AGEs培养组,AGEs浓度在250～1000mg/L范围内逐步递增。MTT法测定AGEs对体外纯化培养Mvller细胞增殖的影响和分泌VEGF的改变。 结果：高浓度AGEs对Mvller细胞有明显的促增殖作用,并且促进Mvller细胞分泌VEGF,并在一定的浓度范围内（250～1000mg/L）细胞增殖活性呈剂量依赖关系。 结论：体外高浓度AGEs可促进Mvller细胞异常增殖和VEGF表达增加,与临床上观察到增殖性糖尿病视网膜病变时胶质细胞反应性增生情况一致,因此可以在体外用高浓度AGEs模拟体内糖尿病环境,观察胶质细胞形态和功能的改变。     

SD大鼠Müller细胞的原代培养

目的:原代分离培养SD大鼠Mller细胞,在实验室建立Mller细胞株。方法:采用改良的酶消化法培养新生大鼠的视网膜Mller细胞,免疫组化法进行鉴定。结果:原代培养的Mller细胞胞体狭长,胞浆丰富,经过3~5次传代后逐渐变得胞体宽大,出现微丝和突起。免疫组化显示,95%以上的细胞谷氨酰胺合成酶染色阳性。结论:改良的酶消化法是培养视网膜Mller细胞的简单有效的方法。     

bFGF对兔视网膜Müller细胞表达VEGF的影响

血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是视网膜细胞分泌的两种最重要的血管生成因子。二者有协同作用，bFGF还可以诱导内皮细胞表达VEGF。视网膜Müller细胞是视网膜中分泌VEGF的主要细胞之一，为了进一步探讨Müller细胞在糖尿病视网膜病变（DR）中的作用，本研究观察了bFGF对体外培养免视网膜Müller细胞表达VEGF的影响。     

糖尿病对视网膜Müller细胞功能的影响

视网膜M櫣ller细胞在结构上与视网膜神经元、血管关系密切,其主要功能是调节细胞外间质中的离子浓度、参与谷氨酸代谢、调节视网膜内酸碱平衡、支持视网膜内各种细胞代谢等。在糖尿病视网膜病变中,视网膜M櫣ller细胞功能的损害可引起K 离子通道功能的损害,影响视网膜的血管功能;谷氨酸载体活性的损害和谷氨酰胺合成酶的功能降低,可影响神经元细胞的活性和功能;改变GFAP和occludin的表达与分布,使血-视网膜屏障受到损害;向成纤维细胞转化产生收缩力,参与增生性糖尿病视网膜病变的发生与发展;碳酸酐酶功能受到影响,引起视网膜内酸碱平衡失调。     

神经短肽NAP在缺氧环境中对体外小鼠Müller细胞的保护作用

目的:观察神经短肽NAP对小鼠Mller细胞在缺氧环境中的保护作用。方法:用重组腺相关病毒作为载体,将含NT4-NAP融合基因的rAAV-NAP和含报告基因的rAAV-GFP对体外培养的小鼠Mller细胞进行感染,用MTT法和流式细胞仪检测感染细胞和未感染细胞在缺氧24h时的增殖活性和凋亡率。结果:感染rAAV-GFP的小鼠Mller细胞表达出明显的绿色荧光,缺氧24h时,感染rAAV-NAP的细胞与未感染细胞相比,增殖活性高(A=0.109,P<0.05),两组细胞凋亡率分别为8.13%和18.72%,感染有NAP细胞的凋亡率显著低于正常细胞(P<0.05)。结论:神经短肽NAP可以减轻缺氧对Mller的损害。     

糖尿病视网膜Müller细胞GLAST功能变化的研究进展

糖尿病引起的视网膜神经功能异常可能先于血管损伤,引起这一改变的最主要原因是视网膜细胞外谷氨酸的大量蓄积,持久激活谷氨酸受体以及损伤视网膜神经元。细胞外谷氨酸的蓄积可能与视网膜Müller细胞L-谷氨酸/L-天冬氨酸转运体(GLAST)功能下降有关,致使细胞外的谷氨酸不能及时转运到Müller细胞内。本文就Müller细胞GLAST的作用机制及在糖尿病状态下功能的变化进行综述。     

视网膜再生的细胞来源与Müller细胞去分化机制

视网膜的损害会导致人类严重的视觉障碍.一些非哺乳类脊椎动物的视网膜具有自发旺盛的再生能力,研究显示,该修复过程在不同种属动物中涉及多种来源的再生种子细胞.Müller细胞作为视网膜内主要的支持细胞,在多种动物的研究中均发现它能去分化转变为视网膜神经祖细胞参与损伤修复.近几年来,Müller细胞去分化过程的分子机制与相关信号途径研究取得了新的进展.本文就视网膜再生的细胞来源与Müller细胞去分化机制作一综述.     

兔视网膜Mller细胞的原代培养

目的探索体外培养兔视网膜Mller细胞的有效方法。方法采用酶消化法从乳兔视网膜获取Mller细胞,通过振荡和反复洗涤使之纯化。采用免疫组织化学技术和透射电镜对传代Mller细胞进行鉴定。结果培养24h后即有部分细胞贴壁生长,72h后贴壁细胞进一步增多。通过振荡吹打可使附着于Mller细胞上的神经元脱落。20～25d后细胞接近融合,呈三角形或不规则形。传代后细胞经1周达到融合。培养细胞GFAP阳性率在95%以上。电镜观察显示:细胞内含有线粒体、粗面内质网、核糖体及8～10nm的中间丝。结论利用酶消化法可成功分离兔视网膜Mller细胞,通过振荡和吹打洗涤,可使之纯化。     

高糖对视网膜Müller细胞VEGF,EPO和EPOR mRNA表达的影响

目的:观察高糖条件下VEGF mRNA,EPO mRNA和EPORmRNA在体外培养的Mller细胞中的表达情况。方法:胰蛋白酶将新生小鼠视网膜组织吹打消化后,制成单细胞悬液,体外培养Mller细胞,RT-PCR测定高糖条件下视网膜Mller细胞VEGF,EPO和EPOR基因的表达。结果:成功获得视网膜Mller细胞,传代后90%以上的细胞呈兔抗鼠谷氨酰胺合酶(GS)染色阳性。Mller细胞VEGF mRNA,EPO mRNA和EPOR mRNA在高糖条件下表达升高,且呈浓度依赖性(P<0.05),但糖浓度50mmol/L组较40mmol/L组差异无统计学意义,无明显时间依赖性。结论:Mller细胞在高糖条件下VEGF,EPO,EPOR的表达增加。     

兔视网膜挫伤后Müller细胞Vimentin表达的变化

目的：探讨兔视网膜挫伤后Müller细胞波形蛋白（Vimentin）表达的变化 方法：通过3J能量自由落体方式制作兔眼挫伤性视网膜病变模型,于伤后1/8,1,3,7,14d时处死动物取材,免疫组化染色和计算机图像分析仪检测视网膜挫伤后Müller细胞Vimentin的表达和分布。 结果：视网膜挫伤后1d Vimentin开始阳性表达增强,7d达到高峰,14d略有下降。随着视网膜挫伤时间的延长,Vimentin的免疫染色范围也逐渐向外扩展,3d时免疫染色达外界膜,7d时视网膜全层都有表达,二组比较,各时段差别均P〈0.01,存在统计学差异。 结论：视网膜挫伤后Müller细胞Vimentin反应动态增强。     

全反式视黄酸对体外培养大鼠Müller细胞生长的影响

目的:观察全反式视黄酸(All-trans retinoic acid,RA)对体外培养大鼠Müller细胞生长的影响。方法:用不同浓度的RA作用于培养的Müller细胞,利用相差显微镜、MTT法、细胞计数法、流式细胞仪检测RA对Müller细胞形态、生长状况及其凋亡的影响。结果:RA在低浓度(<0.1μM)时对Müller细胞的抑制作用不明显。当RA在高浓度(1μM、10μM、100μM)时产生明显抑制作用,细胞形态出现显著变化,48h较24h更明显。细胞计数显示20μM的RA作用48h后引起细胞数目明显减少。流式细胞仪检测结果显示不同浓度的RA(5μM、10μM、20μM)均可诱导Müller细胞凋亡,20μM的RA作用48h时细胞凋亡率最高(P<0.01),凋亡指数为(35.87±7.40)%。结论:RA能抑制Müller细胞的增殖、促进其凋亡,并具有浓度和时间依赖性。     

花色苷对高糖、高胰岛素下Müller细胞合成VEGF的影响

目的观察高糖、高胰岛素培养下Mller细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的合成与分泌,以及花色苷对其合成、分泌VEGF的影响。方法对大鼠视网膜Mller细胞进行原代培养。用50mmol.L-1葡萄糖和不同浓度的胰岛素处理Mller细胞24h,分为高胰岛素组(3kU.L-1胰岛素)、低胰岛素组(3U.L-1胰岛素)和对照组(不含胰岛素)。分别用121.1μmol.L-1、22.8μmol.L-1、0μmol.L-1花色苷对各组细胞进行干预。48h后用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定上清液中VEGF的含量,免疫细胞化学测定Mller细胞中VEGF的表达。结果相比对照组,高胰岛素处理Mller细胞后上清液与细胞中的VEGF表达均增加;低浓度和高浓度花色苷均可使该组细胞与上清液中的VEGF表达减少,与未加入花色苷的Mller细胞相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。经2种浓度花色苷分别处理后,高胰岛素组与对照组上清液和细胞中的VEGF表达差异均无统计学意义(均为P>0.05),2种浓度之间差异亦无统计学意义(均为P>0.05)。结论高浓度胰岛素在短期内即可使Mller细胞合成、分泌VEGF增加,花色苷能有效逆转该过程。     

大鼠视网膜Mller细胞受刺激后具有神经干细胞的特性

目的:研究并验证成年哺乳动物视网膜中Mller细胞经刺激后可以产生神经干细胞特性。方法:对6周龄VC大鼠右眼玻璃体腔内注射神经毒素混合液(含NMDA,kainate,FGF2和insulin)刺激Mller细胞,左眼玻璃体内注射PBS作为对照眼。1wk后取眼并分离Mller细胞体外原代纯化培养7d。流式细胞技术鉴定Mller细胞纯度,通过细胞免疫荧光组织化学和流式细胞技术鉴定神经干细胞标志物nestin在Mller细胞上的表达。结果:流式细胞分析结果显示,本实验分离培养的原代Mller细胞纯度可达96%以上;细胞免疫荧光组织化学显示激活后Mller细胞能表达nestin,流式细胞技术证明,激活后培养的细胞中表达nestin的细胞可达总细胞量的53.5%。结论:成年大鼠视网膜Mller细胞经神经毒素在体刺激后可以产生神经干细胞特性。     

缺氧对视网膜Müller细胞VEGF和PEDF表达的影响

目的探讨缺氧对体外培养的大鼠视网膜M櫣ller细胞血管内皮生长因子(vas-cular endothelial growthfactor,VEGF)和色素上皮衍生因子(pigment epitheliumderived fac-tor,PEDF)表达的影响。方法采用RT-PCR和Western印迹分析方法分别对不同缺氧时间视网膜M櫣ller细胞VEGF和PEDF的mRNA及蛋白水平进行测定。结果M櫣ller细胞VEGF mRNA及蛋白表达在缺氧12h后明显升高,缺氧24h更为显著,24h时2者分别为对照组的2.12倍(P<0.05)和1.70倍(P<0.05)。PEDF mRNA及蛋白表达在缺氧6h后明显下降(P<0.05),缺氧24h下降更为显著,24h时2者分别为对照组的0·11倍(P<0.01)和0.54倍(P<0.05)。结论缺氧条件下,体外培养的大鼠M櫣ller细胞VEGF和PEDF表达失衡,PEDF表达下降,同时VEGF表达增加,2者的表达失衡可能在视网膜病理性新生血管形成过程中起一定作用。     

缺氧下外源性血管内皮生长因子对体外大鼠Müller细胞的影响

目的:观察缺氧条件下外源性血管内皮细胞生长因子(VEGF)对体外大鼠Müller细胞的影响.方法:体外酶消化法纯化培养并鉴定大鼠Müller细胞.台盼兰染色测定细胞活性.应用光镜、细胞计数、免疫细胞化学、MTT法、原位细胞凋亡等方法分析Müller细胞在不同的缺氧时间(0～24 h)、添加不同浓度VEGF(10～100μg/L)及VEGF受体FIk-1阻断剂SU1498处理后,细胞中VEGF和FIk-1,FIt-1的表达、细胞活性及凋亡等变化.结果:纯化培养至第3代的Müller细胞,经鉴定其纯度为90%,活力是87.3%.缺氧8～12h时Müller细胞胶质源纤维酸性蛋白(GFAP)染色增强,VEGF和FIk-1,FIt-1表达增加,可见细胞肿胀、脱落.缺氧20h时,与对照组相比,细胞增生降低到79.3%,细胞凋亡指数增加了6.5倍.缺氧24h前加入75μg/L VEGF使细胞活性增强了1.3倍,凋亡指数下降到2/3.VEGF在10～75μg/L 范围内此作用呈剂量依赖性.正常情况下,FIk-1,FIt-1表达很少,但是缺氧后,表达量明显上升,FIt-1更显著.加入SU1498后能部分抑制VEGF对Müller细胞的作用.结论:短时间缺氧使Müller细胞反应性增生,VEGF和FIk-1,FIt-1表达增加,外源性VEGF可能部分地借助于受体FIk-1和FIt-1对缺氧的Müller细胞起到保护作用.     

碱性成纤维细胞生长因子在糖基化终产物作用下视网膜Müller细胞中的表达及对血管内皮生长因子影响

目的 观察糖基化终产物(AGEs)作用下兔视网膜Müller细胞中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达,以及bFGF对该细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响,探讨AGEs对于糖尿病视网膜病变(DR)发生发展的可能作用机制.方法 制备牛血清白蛋白AGEs(AGEs-BSA)及其对照物并将其作用于体外培养的兔视网膜Müller细胞,采用免疫细胞化学(ICC)方法 半定量检测不同时间点(1d、3d、6d、9d)Müller细胞bFGF表达变化.利用外源性bFGF(0.1、1.0、10.0、50.0、100.0)ng/mL干预Müller 细胞,采用ICC方法 半定量检测不同时间点(1d、3d、6d、9d)M üller细胞VEGF的表达变化.结果 AGEs作用下兔视网膜M üller细胞bFGF的表达增高(P<0.05或P<0.01)且具有一定的时间和浓度依赖性.外源性bFGF可上调视网膜M üller细胞VEGF的表达,且具有一定的浓度依赖性及时限性.结论 AGEs可以上调视网膜Mü ller细胞表达bFGF,而bFGF可以上调Müller细胞表达VEGF,推测AGEs可能通过增加bFGF的表达,以及通过分泌的bFGF间接促进VEGF的表达,从而在DR形成过程中起重要作用.

Abstract：

Objective To investigate the effect of advanced glycosylation end products (AGEs) on expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) in rabbit retinal Müller cells, also the effect ofbFGF on expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in rabbit retinal Müller cells in vitro. Methods Rabbit retinal Müller cells were cultured first, then AGEs-BSA and its control were prepared. Müller cells were treated with 5 different concentration series of AGEs-BSA and AGEs-BSA control for 1, 3, 6 and 9 days, while blank control group was incubated without any intervention. Then bFGF expression in Müller cells was half-quantitatively identified by immunocytochemistry (ICC). Cultured rabbit Müller cells were also treated with bFGF of 5 concentrations (0.1, 1.0, 10.0, 50.0, 100.0) ng/mL for 1, 3, 6, 9 days, while blank control group was incubated without any intervention. Then VEGF expression in Müller cells was half-quantitatively identified by ICC. Results Comparing with control group, AGEs-BSA evoked a time and concentration-dependent increase ofbFGF expression on cultured retinal Müller cells (P ＜0. 05 or P ＜0. 01). And comparing with blank control group, bFGF also evoked a time and concentration-dependent increase of VEGF expression on retinal Mi ller cells in a certain range. Conclusions AGEs up-regulates the expression ofbFGF, which can up-regulate the expression of VEGF in Müller cells. These results indicate that AGEs might promote the progress of DR.     

雌激素对缺氧视网膜Müller细胞PEDF和VEGF表达的影响

目的：探讨雌激素对缺氧视网膜Müller细胞色素上皮衍生因子（PEDF）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法：采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western-blot印迹分析方法分别测定不同浓度雌二醇（E2）作用于缺氧Müller细胞后,细胞内PEDF mRNA,VEGF mRNA及相应的蛋白表达水平。结果：缺氧24h后PEDFmRNA及蛋白表达明显降低,10-5mmol/L和10-6mmol/LE2作用于Müller细胞后可明显缓解由于缺氧引起的细胞内PEDF mRNA及蛋白表达的降低,并与E2的浓度有关。缺氧24h后VEGF mRNA及蛋白表达明显升高,10-5mmol/L和10-6mmol/LE2作用于Müller细胞后可以明显降低细胞内VEGF mRNA及蛋白表达水平,并与E2的浓度有关。结论：雌激素可以调控缺氧条件下视网膜Müller细胞内PEDF和VEGF的表达,对视网膜病理性新生血管的形成具有保护作用。     

高浓度胰岛素对视网膜Müller细胞VEGF表达的影响(英文)

目的:探讨在高浓度胰岛素条件下,体外培养的兔视网膜Müller细胞的血管内皮细胞生长因子(vas-cularendothelialgrowthfactor,VEGF)的变化。方法:在不同浓度胰岛素条件下(4,8,12kU/L),体外培养兔视网膜Müller细胞,采用免疫细胞化学法、原位杂交法,定性测定Müller细胞分泌VEGF的变化,采用ELISA方法,定量测定Müller细胞分泌VEGF的变化。结果:高浓度胰岛素能明显增强VEGF的表达(P< 0.05)。结论:高浓度胰岛素可能通过刺激Müller细胞编码VEGF基因的转录,进而增强VEGF蛋白的表达,而在糖尿病视网膜病变的新生血管生成中发挥重要作用。     

糖基化终产物诱导视网膜微血管内皮细胞VEGF和ZO-1 mRNA合成的变化

目的 观察糖基化终产物(advanced glycosylation end products,AGEs)作用下,大鼠视网膜微血管内皮细胞(rat retinal microvascular endothelial cells,rRMEC)的增生和活力的变化,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)合成和紧密链接蛋白-1(zonula occludens protein-1,ZO-1)mRNA合成的变化.方法 采用免疫磁珠法分离培养rRMEC,0 mg·L-1、10 mg·L-1、100 mg·L-1和600 mg·L-1糖基化牛血清白蛋白(AGE-bovine serum albumin,AGE-BSA)作用rRMEc,观察4 d内细胞增生变化,并采用台盼蓝染色法测定细胞活力.不同浓度的AGE-BSA(0 mg·L-1、10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1、600 mg·L-1)作用12 h,100 mg·L-1的AGE-BSA作用不同时间(0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h)后,采用RT-PCR和Elisa测定rRMEC中VEGF mRNA、ZO-1 mRNA和上清中VEGF含量.结果 rRMEC在0 mg·L-1、10 mg·L-1和100 mg·L-1 AGE-BSA环境中可以继续增生,600 mg·L-1细胞增生可能受到抑制,造成rRMEC活力降低.在浓度为10～400 mg·L-1 AGE-BSA作用12 h时,VEGF mRNA合成增强,上清液中VEGF蛋白表达升高;在100 mg·L-1 AGE-BSA作用2～24 h,VEGF mRNA合成首先升高,后降低并趋于稳定;作用后各组均高于作用前(P＜0.01),上清液中VEGF蛋白表达随时间延长逐渐增加.随AGE-BSA浓度的增加,ZO-1 mRNA逐渐降低;随AGE-BSA作用时间的延长,ZO-1 mRNA逐渐降低.结论 在一定范围内,VEGF mRNA和ZO-1 mRNA合成呈AGE-BSA剂量和时间依赖性.VEGF可能是促进rRMEC ZO-1 mRNA合成降低的重要因素之一.