MMPs激动剂和抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1／2以及I型胶原表达的作用研究

目的研究基质金属蛋白酶（MMPs）家族MMP-1、MMP-2激动剂和抑制剂对人巩膜I型胶原表达的作用,探讨MMP-1和MMP-2在人巩膜胶原代谢中的作用。方法应用人巩膜成纤维细胞系作为研究模型,用荧光定量检测MMPs激动剂醋酸氨基苯汞（APMA）及抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1和MMP-2活性的影响;实时荧光定量反转录聚合酶链反应以及免疫印迹蛋白定量法检测比较激动剂组与抑制剂组对MMP-1／2以及I型胶原mRNA和蛋白表达的变化;最后用siRNA干扰敲除MMP-1、MMP．2或MMP-1／2后,检测巩膜成纤维细胞I型胶原蛋白水平的变化。结果MMPs激动剂引起MMP．1／2活性显著增加,I型胶原mRNA和蛋白表达下降,MMPs抑制剂引起MMP．1／2活性显著下降,相应的I型胶原mRNA和蛋白表达增加（均P〈0．01）。激动剂可引起MMP．1mRNA表达增加（P〈0．01）,对MMP-2mRNA表达无明显影响（P〉0．05）,而抑制剂能引起MMP．2mRNA表达下降（P〈0．01）,但对MMP．1mRNA表达无显著影响（P〉0．05）。应用siRNA干扰方法敲除MMP-1、MMP-2或两者同时被敲除后,MMP-1蛋白表达均显著降低（均P〈0．01）,MMP-2除在MMP-1siRNA干扰敲除组无明显变化外（P〉0．05）,其余各组均显著下降（均P〈0．01）;I型胶原的表达在各敲除组中显著增加,当MMP-1和MMP．2均干扰敲除时,I型胶原的表达增加最为显著（均P〈0．01）。结论在人巩膜成纤维细胞系中,MMP-1／2激动剂和抑制剂均能引起MMP-1／2活性改变及相应的MMP-1／2蛋白表达变化,并最终导致I型胶原表达的变化;MMP．1和MMP-2是调控人巩膜I型胶原重塑的关键因子。     

葛根素对极低频电磁场下人胚胎眼巩膜成纤维细胞增殖活性及I型胶原蛋白表达的影响

目的研究葛根素对极低频电磁场（ELF-EMFs）作用下人胚胎眼巩膜成纤维细胞（HFSFs）增殖活性及I型胶原蛋白（COL1A1）表达的影响。方法实验研究。体外培养HFSFs,根据是否暴露于0.2 mT电磁场分为暴露组和非暴露组,暴露组又分为不同终浓度葛根素组（0.0、0.1、1.0、10.0 µmol/L）。MTT比色法检测不同暴露时间（0、12、24、48 h）暴露组和非暴露组HFSFs增殖活性,及各浓度葛根素组HFSFs暴露于0.2 mT电磁场24 h时增殖活性;用Real-time PCR和Western-Blot检测非暴露组和暴露于0.2 mT电磁场24 h时各浓度葛根素组HFSFsmRNA转录水平和COL1A1蛋白表达。2组间比较采用独立样本t检验,各组整体比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验。结果暴露组各时间点HFSFs增殖活性差异有统计学意义（F=4.560,P<0.05）,暴露于0.2 mT磁场24 h开始即出现HFSFs增殖受抑（t=5.000,P<0.01）;与非暴露组相比,暴露组细胞内COL1A1蛋白表达下调（t=7.956,P<0.01）,同时mRNA转录也下调（t=17.364,P<0.01）,而1.0 µmol/L葛根素开始使HFSFs增殖活性增强（P<0.01）,0.1 µmol/L葛根素即使暴露组HFSFs内COL1A1蛋白（P<0.05）和mRNA表达上调（P<0.05）,且浓度越高变化越明显。结论葛根素可逆向改变ELF-EMFs引起的HFSFs增殖活性下降、细胞内COL1A1 mRNA和蛋白表达下调,可能对巩膜基质重塑具有预防作用。     

缺氧对巩膜成纤维细胞内质网应激反应的激活作用及其对巩膜重塑的影响

目的　探讨缺氧对巩膜成纤维细胞（HFSF）内质网应激反应的激活作用及其对巩膜重塑的影响。方法　取HFSF随机分为缺氧0 h组、缺氧12 h组、缺氧48 h组。缺氧0 h组细胞正常培养,缺氧12 h组及48 h组细胞分别在含氧体积分数2%的三气培养箱中缺氧处理12 h及48 h。采用Western blot 检测肌醇需求酶l (IRE1α)、P-IRE1α、COL1A1、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、BAX及BCL-2蛋白表达情况,免疫荧光染色检测HFSF中α-SMA蛋白含量,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,CCK-8检测细胞增殖情况。结果　Western blot检测结果显示:与缺氧0 h组相比,缺氧12 h组IRE1α、α-SMA蛋白表达均升高,COL1A1蛋白表达降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）,其余蛋白表达变化不明显,差异均无统计学意义（均为P>0.05）;与缺氧0 h组相比,缺氧48 h组IRE1α、P-IRE1α、MMP-2、α-SMA、BAX蛋白表达均升高,COL1A1、BCL-2蛋白表达均降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;与缺氧12 h组相比,缺氧48 h组COL1A1、BCL-2蛋白表达降低,BAX蛋白表达升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）,其余蛋白表达变化不明显,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。免疫荧光染色结果显示:缺氧12 h组及缺氧48 h组α-SMA蛋白荧光强度均较缺氧0 h组增高,且缺氧48 h组较缺氧12 h组α-SMA蛋白荧光强度升高更明显。流式细胞仪检测结果显示:缺氧0 h组、缺氧12 h组、缺氧48 h组细胞凋亡率分别为（0.617±0.032）%、（2.187±0.212）%、（4.130±0.395）%;缺氧12 h组及缺氧48 h组细胞凋亡率均高于缺氧0 h组,差异均有统计学意义（均为P<0.05）,且缺氧48 h组细胞凋亡率高于缺氧12 h组,差异有统计学意义（P<0.05）。CCK-8检测结果显示:缺氧12 h组及缺氧48 h组D₄₅₀均低于缺氧0 h组,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;缺氧48 h组与缺氧12 h组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。结论　缺氧激活HFSF内质网应激反应,并且可能通过调节胶原代谢、促进细胞转分化及凋亡来参与巩膜重塑。     

MMPs激动剂和抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1/2以及Ⅰ型胶原表达的作用研究

目的 研究基质金属蛋白酶(MMPs)家族MMP-1、MMP-2激动剂和抑制剂对人巩膜Ⅰ型胶原表达的作用,探讨MMP-1和MMP-2在人巩膜胶原代谢中的作用.方法 应用人巩膜成纤维细胞系作为研究模型,用荧光定量检测MMPs激动剂醋酸氨基苯汞(APMA)及抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1和MMP-2活性的影响;实时荧光定量反转录聚合酶链反应以及免疫印迹蛋白定量法检测比较激动剂组与抑制剂组对MMP-1/2以及Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达的变化;最后用siRNA干扰敲除MMP-1、MMP-2或MMP-1/2后,检测巩膜成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白水平的变化.结果 MMPs激动剂引起MMP-1/2活性显著增加,Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达下降,MMPs抑制剂引起MMP-1/2活性显著下降,相应的Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达增加(均P＜O.01).激动剂可引起MMP-1 mRNA表达增加(P＜0.01),对MMP-2 mRNA表达无明显影响(P＞0.05),而抑制剂能引起MMP-2 mRNA表达下降(P＜0.01),但对MMP-1 mRNA表达无显著影响(P＞0.05).应用siRNA干扰方法敲除MMP-1、MMP-2或两者同时被敲除后,MMP-1蛋白表达均显著降低(均P＜0.01),MMP-2除在MMP-1 siRNA干扰敲除组无明显变化外(P＞0.05),其余各组均显著下降(均P＜O.01);Ⅰ型胶原的表达在各敲除组中显著增加,当MMP-1和MMP-2均干扰敲除时,Ⅰ型胶原的表达增加最为显著(均P＜0.01).结论 在人巩膜成纤维细胞系中,MMP-1/2激动剂和抑制剂均能引起MMP-1/2活性改变及相应的MMP-1/2蛋白表达变化,并最终导致Ⅰ型胶原表达的变化;MMP-1和MMP-2是调控人巩膜Ⅰ型胶原重塑的关键因子.     

PPARy受体激动剂罗格列酮对形觉剥夺性近视和正常豚鼠屈光度的影响

目的　探讨过氧化物酶体增殖物激活受体y（PPARy）激动剂罗格列酮在豚鼠形觉剥夺性近视（FDM）中的作用。方法　选取40只3周龄豚鼠（均为右眼）,随机分成4组:正常组、FDM组、正常+罗格列酮组、FDM+罗格列酮组,其中正常组豚鼠不做处理,FDM组豚鼠使用头套法造模,正常+罗格列酮组豚鼠每天腹腔注射罗格列酮5 mg·kg^-1,FDM+罗格列酮组豚鼠每天戴头套并腹腔注射罗格列酮5 mg·kg^-1,持续28 d。实验前和实验后28 d测量豚鼠屈光度,实验后28 d测量豚鼠眼轴长度,保留眼球,免疫组织化学及Western blot测量豚鼠I型胶原蛋白(COL-I)、转化生长因子-β1（TGF-β1）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）蛋白的分布与表达,HE染色观察巩膜形态变化。结果　与正常组相比,FDM组豚鼠右眼屈光度和眼轴长度均增加,形成相对近视,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;巩膜明显变薄,胶原纤维排列紊乱,断裂明显,分布不规则。与正常组相比,正常+罗格列酮组豚鼠右眼屈光度和眼轴长度变化差异均无统计学意义（均为P>0.05）;巩膜形态没有明显变化。与正常组相比,FDM+罗格列酮组豚鼠右眼屈光度和眼轴长度变化差异均无统计学意义（均为P>0.05）。与FDM组相比,FDM+罗格列酮组豚鼠右眼屈光度和眼轴长度均减少,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;巩膜胶原纤维排列松散,分布略紊乱。Western blot检测结果显示,与正常组相比,FDM组豚鼠巩膜中COL-I、TGF-β1、TIMP-2蛋白表达量均减少,MMP-2蛋白表达量增加,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;与正常组相比,正常+罗格列酮组豚鼠巩膜中,COL-I、TGF-β1蛋白表达量均增加,差异均有统计学意义（均为P<0.05）,TIMP-2和MMP-2蛋白表达量差异均无统计学意义（均为P>0.05）;与正常组相比,FDM+罗格列酮组豚鼠巩膜中COL-I蛋白的表达接近正常组,差异无统计学意义（P>0.05）,TGF-β1、TIMP-2蛋白表达量均增加,MMP-2蛋白表达量减少,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;与FDM组相比,FDM+罗格列酮组豚鼠巩膜中COL-I、TGF-β1、TIMP-2蛋白表达量均增加,MMP-2蛋白表达量减少,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。豚鼠巩膜中COL-I、TGF-β1、TIMP-2、MMP-2蛋白免疫组织化学表达趋势与Western blot检测结果一致。结论　PPARy受体激动剂罗格列酮可能通过调节TGF-β1、COL-I、TIMP-2和MMP-2蛋白的表达水平抑制FDM,对正常豚鼠的屈光影响不大。     

形觉剥夺对小鸡后极部巩膜MMP-2基因表达的影响

目的：研究形觉剥夺对小鸡后极部巩膜MMP-2基因表达影响的动态性变化,以揭示FDM巩膜重塑的发生机制.方法：1 d龄来亨雏鸡进行单眼遮盖以制备形觉剥夺性近视眼（FDM）动物模型,按遮盖时间不同分为FDM4,7,14,21,30d 5组,对侧眼作为自身对照组.随机选取同龄、非遮盖小鸡作为正常对照组,每组10只.采用明胶酶谱法、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）一步法、免疫组化法分别检测各组小鸡后极部巩膜明胶酶活性、mRNA及蛋白质表达.结果：FDM组后极部巩膜MMP-2酶活性与mRNA水平显著增高,与相应自身对照组、正常对照组比较差别均有统计学意义（P＜0.01）;随遮盖时间延长后极部巩膜MMP-2酶活性、mRNA水平逐渐增高,尤其在被剥夺4～14d最明显,21d达高峰,其后稍下降,但仍维持于较高水平.FDM组组间差别有统计学意义（P＜0.01）.上述改变与免疫组化结果一致.结论：形觉剥夺可明显促进小鸡后极部巩膜MMP-2酶活性表达,其中基因表达转录调节参与FDM后极部巩膜MMP-2酶活性调控.     

转录活性蛋白1在实验性近视眼豚鼠巩膜重塑中对I型胶原表达的调控作用

目的　研究近视巩膜重塑中转录活性蛋白1（specificity protein 1,Sp1）作为转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）下游信号转录因子的表达情况和调节I型胶原（Collagen Ⅰ）表达的作用。方法　出生7 d的有色豚鼠75只,随机选取50只左眼使用6号无色半透明乳胶气球作为头套诱导形觉剥夺性近视（form deprivation myopia,FDM）动物模型为FDM组,右眼作为自身对照组,另外25只不作处理为正常组。记录各组豚鼠屈光度及眼轴长度变化。Western blot和RT-PCR检测正常组和FDM组豚鼠遮盖后0周（遮盖前）、2周、4周、6周及遮盖4周去遮盖1周（4/-1周）时巩膜中Sp1和Collagen Ⅰ蛋白和mRNA的表达变化,并分析两者的关系。结果　FDM组豚鼠眼随着遮盖时间延长,由遮盖前远视状态逐渐变为近视状态,眼轴长度也逐渐增长。与正常组相比,FDM组巩膜内Sp1和Collagen Ⅰ的蛋白和mRNA表达均下调,且随遮盖时间的延长,其表达不断减弱。正常组及FDM组遮盖后0周、2周、4周、4/-1周、6周,Sp1蛋白相对表达量分别为1.864±0.014、1.856±0.016、1.215±0.016、0.752±0.013、0.945±0.017、0.518±0.012;Collagen Ⅰ蛋白相对表达量分别为2.922±0.005、2.836±0.001、2.336±0.002、1.500±0.003、1.754±0.006、1.082±0.001;Sp1 mRNA:0.599±0.025、0.557±0.024、0.510±0.013、0.349±0.013、0.457±0.009、0.168±0.012;Collagen Ⅰ mRNA:1.071±0.014、1.010±0.021、0.947±0.006、0.626±0.010、0.770±0.020、0.331±0.004。遮盖2周后各时间点与正常组相比,Sp1和Collagen Ⅰ蛋白和mRNA表达差异均有统计学意义（均为P<0.05）。Sp1与Collagen Ⅰ的蛋白和mRNA表达均呈明显正相关（均为r=1.00,P<0.05）。结论　Sp1作为TGF-β1的下游信号转录因子可能参与了近视巩膜重塑中Collagen Ⅰ的调控,提示Sp1信号转录因子可能通过TGF-β1-Sp1-Collagen Ⅰ信号通路在近视巩膜重塑中发挥重要作用。     

电针干预对透镜诱导型近视豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3及Col3α1表达的影响

目的　探讨电针干预对透镜诱导型近视豚鼠睫状肌中基质金属蛋白酶（MMP）-3、金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）-3和III型胶原α1（Col3α1）表达的影响。方法　2周龄三色豚鼠90只随机分为正常对照（NC）组、透镜诱导型近视（LIM）组以及LIM+电针干预（LIM+EA）组;其中,NC组豚鼠不作任何干预,LIM组和LIM+EA组豚鼠右眼均配戴-6.00 D透镜作为造模眼,左眼不戴镜作为自身对照;LIM+EA组豚鼠右眼戴镜的同时在太阳、合谷穴给予电针刺激。各组豚鼠于造模后1周、2周和4周均进行屈光度和眼轴长度测量,制备病理组织切片观察各组豚鼠睫状肌的形态变化,并应用q-PCR和酶联免疫吸附实验（ELISA）检测各组豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的 mRNA及蛋白表达。结果　造模后1周、2周和4周,与NC组相比,LIM组豚鼠造模眼与自身对照眼近视屈光度和眼轴长度的差值均显著增加（均为P<0.001）;与LIM组相比,LIM+EA组造模眼与自身对照眼近视屈光度和眼轴长度的差值均减小（均为P<0.05）。病理组织切片结果发现,NC组豚鼠睫状肌纤维排列均匀、紧密有序;LIM组豚鼠睫状肌纤维排列松散混乱、有机纤维溶解断裂;LIM+EA组豚鼠睫状肌纤维排列相较于LIM组更为有序,相对完整。q-PCR和ELISA检测结果显示,造模后1周和2周,与NC组相比,LIM组豚鼠造模眼睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA及蛋白相对表达水平均明显升高（均为P<0.05）;与LIM组相比,LIM+EA组豚鼠造模眼睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA及蛋白相对表达水平均明显下降（均为P<0.05）。造模后4周,与NC组相比,LIM组豚鼠造模眼睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA及蛋白相对表达水平均降低（均为P<0.05）;与LIM组相比,LIM+EA组豚鼠造模眼睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA及蛋白相对表达水平均升高（均为P<0.05）。结论　近视发展初期,电针干预可显著下调透镜诱导型近视豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表达,明显延缓近视的发生发展。     

康柏西普对豚鼠形觉剥夺性近视的干预作用及相关机制分析

目的　探讨抗新生血管生长因子融合蛋白康柏西普（Conbercept）球结膜下注射对豚鼠形觉剥夺性近视的干预作用及其可能的作用机制。方法　普通级3周龄断乳花色豚鼠48只随机分为空白对照组、单纯手术组、生理盐水组、Conbercept组,每组各12只。其中空白对照组豚鼠不作处理,单纯手术组、生理盐水组、Conbercept组使用眼睑缝合法遮盖右眼,生理盐水组、Conbercept组分别在缝合时、缝合后7 d右眼球结膜下注射0.05 mL生理盐水、0.5 mg（0.05 mL）Conbercept。记录各组眼睑缝合前及缝合后7 d、14 d时的眼轴长度、屈光度,并取后极部巩膜组织采用RT-PCR、Western blot方法检测各组豚鼠巩膜中基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）、转化生长因子（TGF）-β1、TGF-β2 mRNA和蛋白表达情况。结果　眼睑缝合后7 d、14 d,单纯手术组较空白对照组豚鼠右眼眼轴长度、屈光度均增加,MMP-2、TGF-β2 mRNA和蛋白相对表达量均增加,TGF-β1、TIMP-2相对表达量均减少,差异均具有统计学意义（均为P<0.05）;单纯手术组与生理盐水组各指标相比差异均无统计学意义（均为P>0.05)。眼睑缝合后7 d,与生理盐水组相比,Conbercept组眼轴长度、屈光度及TIMP-2、TGF-β1 mRNA和蛋白相对表达量差异均无统计学意义（均为P>0.05）,MMP-2、TGF-β2 mRNA和蛋白相对表达量均减少,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;眼睑缝合后14 d时,与生理盐水组相比,Conbercept组眼轴长度、屈光度及MMP-2、TGF-β2、TGF-β1 mRNA和蛋白相对表达量差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　0.5 mg Conbercept球结膜下注射可延缓豚鼠形觉剥夺性近视形成,且可能是通过调节巩膜中的MMP-2、TGF-β1、TGF-β2表达而发挥作用。     

MK2抑制剂PF-3644022对视网膜分支静脉阻塞模型大鼠的治疗作用

目的　探讨MK2抑制剂PF-3644022对视网膜分支静脉阻塞（BRVO）模型大鼠的治疗作用。方法　通过激光光凝建立BRVO模型大鼠,将BRVO模型大鼠随机分为5组（n=12）:对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。低、中和高剂量组大鼠分别按1 mg·kg^-1、5 mg·kg^-1、10 mg·kg^-1给予2 mL丝裂原活化蛋白激酶激活的蛋白激酶2（MK2）抑制剂PF-3644022灌胃,对照组和模型组大鼠给予2 mL蒸馏水或生理盐水灌胃,共治疗21 d。分别在治疗后1 d、7 d和14 d进行眼底照相、光学相干断层扫描(OCT)和荧光素眼底血管造影(FFA)检查,利用苏木精-伊红（HE）染色观察各组大鼠视网膜变化,采用免疫荧光染色及Western blot检测各组大鼠视网膜组织中MK2、p-MK2和血管内皮生长因子-α（VEGF-α）的表达。结果　HE染色、眼底照相、FFA和OCT检查结果均显示,MK2抑制剂PF-3644022以剂量依赖性方式减轻BRVO模型大鼠视网膜水肿、血管排列紊乱和收缩、视盘陷凹消失等病理现象。Western blot检测结果显示,治疗后1 d,与模型组（1.00±0.05）相比,低剂量组（0.75±0.04）、中剂量组（0.52±0.03）和高剂量组（0.43±0.02）大鼠视网膜组织中VEGF-α蛋白的相对表达水平均显著降低,并呈剂量依赖性降低（均为P<0.05）;治疗后21 d,各组大鼠视网膜组织中VEGF-α蛋白的表达均无明显差异（均为P>0.05）。治疗后1 d和21 d,与模型组（1.00±0.05、1.00±0.06）相比,低剂量组（0.51±0.03、0.47±0.02）、中剂量组（0.26±0.01、0.23±0.01）和高剂量组（0.22±0.01、0.21±0.01）大鼠视网膜组织中MK2蛋白的磷酸化水平均显著降低,并呈剂量依赖性降低（均为P<0.05）。结论　MK2抑制剂PF-3644022通过减轻视网膜水肿、调节VEGF-α蛋白的表达、抑制MK2活性等作用对BRVO动物模型发挥治疗作用。     

极低频电磁场作用下人胚胎眼巩膜成纤维细胞的分子病理改变

背景 极低频电磁辐射产生的热效应与人类癌症的关系及其对眼表的影响已有较多研究.但眼球暴露于极低频电磁场(ELF-EMFs)下是否会导致巩膜的病理改变,从而影响近视的发生、发展目前鲜见报道. 目的 研究ELF-EMFs作用下人胚胎眼巩膜成纤维细胞(HFSFs)的分子病理改变及其在近视发生发展中的可能机制.方法 对HFSFs进行体外培养和传代,根据细胞是否暴露于50 Hz电磁场分为暴露组和对照组,应用实时定量聚合酶链反应( real-time PCR)法检测不同磁场强度(0、0.1、0.2、0.5、1.0 mT)、不同暴露时间(0、6、12、24、36、48 h)下HFSFs中Ⅰ型胶原蛋白(COL1A1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)的基因表达水平变化,同时应用CCK-8法检测两组HFSFs的细胞增生情况,并以细胞免疫荧光法对HFSFs中COL1A1和MMP-2蛋白的表达进行确认.结果 与对照组相比,暴露组在磁场强度0.2 mT下作用6h可见HFSFs中COL1A1 mRNA的表达下调,差异有统计学意义(对照组:0.099±0.008,暴露组:0.050±0.004;P=0.009),且表达量随着磁场强度的增加而减少；在磁场强度0.1 mT下暴露24 h,HFSFs细胞中的MMP-2 mRNA表达上调,差异有统计学意义(对照组:0.009±0.001,暴露组:0.018±0.003:P=0.038),并随着暴露时间的延长表达增强.磁场强度0.2 mT下暴露24 h,HFSFs细胞增牛的吸光度(A450)值明显下降,差异有统计学意义(P=0.009);免疫荧光分析也显示暴露组HFSFs细胞中COL1A1表达下调,MMP-2表达上调.结论 ELF-EMFs暴露可在一定范围内影响体外培养的HFSFs的增生及COL1 A1的合成,可能是诱导巩膜发生病理性重塑进而导致近视发生、发展的危险因素之一.     

正常角膜与圆锥角膜中的Ⅰ型、Ⅵ型胶原与金属蛋白酶-2

目的对比正常角膜与圆锥角膜中的Ⅰ型,Ⅵ型胶原及金属蛋白酶-2的定位与含量。方法应用酶免疫组化及间接免疫荧光技术检测正常与圆锥角膜中Ⅰ型、Ⅵ型胶原及金属蛋白酶-2（MMP-2)的定位。阳性结果应用图像分析系统进行定量分析。结果免疫组化结果显示所有角膜中Ⅰ型胶原存在于前弹力层和基质中;Ⅵ型胶原存在于上皮基底膜、前弹力层、基质、后弹力层;MMP-2存在于上皮、基质、内皮中。同正常角膜比,圆锥角膜中Ⅰ型、Ⅵ型胶原的含量无差别而MMP-2的含量明显增多,差异有显著性。结论圆锥角膜的MMP-2含量增多,其所导致的胶原降解异常可能是圆锥角膜发病的关键。     

脑源性神经营养因子（BDNF）对高糖环境下视网膜Müller细胞的保护作用

目的　探讨脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）对高糖环境下视网膜Müller细胞的保护作用。方法　该研究实验分为3组,对照组、高糖组（对照组中添加25 mmol·L^-1葡萄糖）、BDNF组（高糖组添加100 mg·L^-1 BDNF）,实验干预24 h后,在倒置显微镜下观察各组细胞形态和生长状态,并进行各项指标检测。用倒置荧光显微镜观察各组视网膜Müller细胞的生长状态并检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）荧光强度;流式细胞仪检测视网膜Müller细胞凋亡率,Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达情况。结果　与对照组相比,高糖组Müller细胞生长状态差,细胞突起减少,细胞失去原有形态,由原来的不规则形变为类圆形,折光性增强;而BDNF组与对照组相比无明显差异;与高糖组相比,BDNF组细胞生长状态明显改善,细胞突起增多,细胞折光性减弱。与对照组相比,高糖组Müller细胞内ROS含量显著升高（P<0.01）,BDNF组细胞内ROS含量亦升高（P<0.01）;与高糖组相比,BDNF组ROS含量显著减少（P<0.01）。与对照组相比,高糖组细胞凋亡率显著升高（P<0.01）,BDNF组凋亡率仍高于对照组（P<0.01）;与高糖组相比,BDNF组凋亡率明显减少（P<0.01）。与对照组相比,高糖组Bcl-2蛋白相对表达量显著减少,Bax蛋白相对表达量明显升高,Bcl-2/Bax二者比值降低（P<0.01）,BDNF组与对照组相比相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）;与高糖组相比,BDNF组Bcl-2蛋白相对表达量明显升高,Bax蛋白表达减少,Bcl-2/Bax比值升高（P<0.01）。结论　高糖环境能诱导视网膜Müller细胞凋亡,而给予外源性BDNF能够显著抑制高糖环境诱导的视网膜Müller细胞凋亡,对视网膜Müller细胞起到保护作用。     

转化生长因子β 1对人巩膜成纤维细胞Smad泛素化调节因子2和Ⅰ型胶原α 1影响的研究

目的探讨Smad泛素化调节因子2(Smurf2)在人胚胎眼巩膜成纤维细胞(HFSFs)中的表达,检测转化生长因子β₁(TGF-β₁)影响下HFSFs中Smurf2和Ⅰ型胶原α₁(COLIA1)含量的变化。 方法HFSFs复苏并稳定传代后,用免疫细胞化学法检测细胞中Smurf2的表达。分别用不同浓度的TGF-β₁(0 、1 ng/ml、5 ng/ml及10 ng/ml)处理HFSFs 24 h以及10 ng/ml TGF-β₁处理HFSFs不同时长(1 h、6 h、12 h及24 h)后,用实时荧光定量法检测各组Smurf2信使核糖核酸(mRNA)和COLIA1 mRNA表达水平。数据以均数±标准差( ±s )描述,不同浓度和不同时长的组间比较采用单因素方差分析,当差异有统计学意义时,进一步采用SNK法两两比较。 结果免疫细胞化学检测的结果显示,HFSFs中有COLIA1 mRNA和Smurf2蛋白的表达。与空白对照组比较,TGF-β₁ 10 ng/ml组COLIA1 mRNA的表达呈上升趋势(F＝3.17,P<0.05),TGF-β₁ 5 ng/ml、10 ng/ml组Smurf2 mRNA表达上调(F＝2.35,2.00;P<0.05)。10 ng/ml TGF-β₁干预HFSFs培养1 h、6 h、12 h及24 h后,24 h组COLIA1 mRNA表达显著升高(F＝29.20,P<0.05)。Smurf2 mRNA表达改变呈先上升后下降趋势,在6 h达到最高(F＝10.65,P<0.05)。 结论TGF-β₁可能通过调控HFSFs Smurf2的表达,诱导HFSFs COLIA1的合成。     

PDGF对人RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响

背景研究表明血小板源性生长因子（PDGF）能调节多种细胞中基质金属蛋白酶／基质金属蛋白酶组织抑制剂（MMP／TIMP）的表达和平衡,但视网膜色素上皮（RPE）细胞中MMP／TIMP的表达与PDGF作用剂量和作用时间的关系尚不明确。目的观察PDGF对RPE细胞中MIP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响。方法体外培养人RPE细胞系ARPE-19,将达到70％～80％融合的细胞分为5个组。分别将0、0．1、1、10、50mg／LPDGF加入RPE细胞培养基作用36h,分别采用逆转录PCR（RT—RCR）法和Western blot法检测各组RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及其蛋白的表达。PDGF组采用10mg／LPDGF组PDGF分别刺激RPE细胞24、36和48h,对照组用不含PDGF的培养液培养,采用逆转录PCR（RT—RCR法和Western blot法分别检测RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及蛋白的表达。结果随着PDGF质量浓度的增加和刺激时间的延长,RPE细胞生长速度加快,细胞增生明显。PDGF刺激RPE细胞36h,随着PDGF质量浓度的增加,MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA在RPE细胞中表达相对值逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F=79．304,P=0．000;MMP-9 mRNA：F=8．465,P=0．003）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值随着PDGF质量浓度的增加而逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2：F=26．550,P=0．000;MMP-9：F=80．993,P=0．000）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。各质量浓度PDGF组RPE细胞中TIMP-1 mRNA和蛋白表达相对值差异均无统计学意义（F=0．143,P=0．962;F=1．955,P=0．178）。随着10mg／L PDGF刺激RPE细胞时间的延长,RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达逐渐增加,差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F时间=83．250,P=0．002;MMP-9 mRNA：F时间=6．785,P=0．019）;各时间点RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显增加,差异均有统计学意义（MMP-2：F时间=11．185,P=0．041;MMP-9：F时间=968．413,P=0．000）。PDGF作用不同时间点对照组与PDGF组间MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白在RPE细胞中的表达差异均有统计学意义（分组：均P=0．000,时间点：P〈0．05）,而各时间点2个组间RPE细胞中TIMP-1表达相对值的差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论PDGF上调PRE细胞中MMP-2和MMP-9的表达,其作用呈剂量和时间依赖性,但对PRE细胞中TIMP-1的表达无明显影响。PDGF导致RPE细胞中MMP／TIMP的平衡失调,从而导致细胞外基质的破坏,促进RPE细胞的迁移。     

6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶（PFKFB3）抑制剂3PO对高糖环境下人脐静脉血管内皮细胞新生血管形成的影响

目的　探讨6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶（6-phosphofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase 3,PFKFB3）抑制剂3-（3-吡啶基）-1-（4-吡啶基）-2-丙烯-1-酮［3-（3-pyridinyl）-1-（4-pyridinyl）-2-propen-1-one,3PO］对高糖环境下人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）增殖、迁移和管腔形成的影响。方法　将传代培养的HUVEC随机分为4组:正常对照组（5.5 mmol·L^-1葡萄糖）、高渗组 （5.5 mmol·L^-1葡萄糖 +24.5 mmol·L^-1甘露醇）、高糖组 （30.0 mmol·L^-1葡萄糖）及高糖+3PO组（30.0 mmol·L^-1葡萄糖+ 10 μmol·L^-1 3PO）。细胞同步化后按分组情况更换相应培养基,继续培养细胞,用于后续实验。采用MTS实验检测细胞增殖率,细胞划痕实验检测细胞迁移率,体外管腔形成实验检测细胞成管情况,实时荧光定量PCR检测PFKFB3 mRNA表达,Western blot检测PFKFB3及ERK蛋白表达情况。结果　与正常对照组相比,高渗组细胞增殖能力降低（均为P<0.05）;24 h高糖组细胞增殖能力无明显升高（P>0.05）,48 h高糖组细胞增殖能力升高（P<0.05）。与高糖组相比,高糖+3PO组细胞增殖能力明显被抑制（均为P<0.05）。与正常对照组相比,高渗组细胞迁移率明显升高（均为P<0.05）;24 h高糖组细胞迁移率明显升高（P<0.05）,但在48 h高糖组中细胞迁移率升高不明显（P>0.05）。与高糖组相比,高糖+3PO组细胞迁移率明显降低（均为P<0.05）。与正常对照组相比,高渗组及高糖组细胞管腔形成能力均明显减弱（均为P<0.05）。与高糖组相比,高糖+3PO组细胞管腔形成能力减弱（P<0.05）。与正常对照组相比,高渗组PFKFB3 mRNA的表达水平变化不大（P>0.05）,高糖组PFKFB3 mRNA的表达升高 （P<0.05）。与高糖组相比,高糖+3PO组 PFKFB3 mRNA的表达明显降低（P<0.05）。与正常对照组相比,高渗组及高糖组中p-ERK/ERK蛋白比值及PFKFB3蛋白表达均升高（均为P<0.05）。与高糖组相比,高糖+3PO组p-ERK /ERK蛋白比值及PFKFB3蛋白表达下降（均为P<0.05）。结论　PFKFB3抑制剂3PO可明显降低高糖环境下HUVEC的增殖、迁移和管腔形成的能力,其作用机制可能与MAPK/ERK信号通路有关。     

高迁移率蛋白1的小干扰RNA对高糖环境下视网膜血管内皮细胞凋亡的影响

目的　探讨高迁移率蛋白1（high-mobility group box-1,HMGB1）的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）对视网膜血管内皮细胞的影响。方法　采用siRNA对HMGB1的表达进行抑制,采用CCK8检测试剂盒、Hochest33342染色、流式细胞仪检测,观察高糖环境下HMGB1 siRNA对视网膜血管内皮细胞的影响,同时通过Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果　HMGB1转染后,siRNA组的蛋白表达与正常对照组相比减少了73%（P<0.05）,siRNA组的蛋白表达与非特异性siRNA（scr-siRNA）组相比减少了75%（P<0.05）,而正常对照组和scr-siRNA组之间差异无统计学意义（P>0.05）。流式细胞仪检测结果显示,正常对照组、高糖组、scr-siRNA组和siRNA组细胞的总凋亡率分别为（0.40±0.03）%、（49.80±3.50）%、（47.60±1.98）%和（23.60±2.40）%。与正常对照组相比,高糖组、scr-siRNA组、siRNA组的细胞凋亡率均明显升高（均为P<0.05）;与scr-siRNA组相比,siRNA组的细胞凋亡率明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）;而scr-siRNA组和高糖组的细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。与正常对照组相比,高糖组和scr-siRNA组的cleaved-caspase 3蛋白（半胱天冬酶3）表达分别增加了（233±10）%、（266±22）%（均为P<0.05）;与scr-siRNA组相比,siRNA组的cleaved-caspase 3蛋白表达减少了（43±3）%（P<0.05）;而高糖组和scr-siRNA组的蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。与正常对照组相比,高糖组和scr-siRNA组的B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）蛋白表达分别减少了（32±2）%、（29±3）%（均为P<0.05）;与scr-siRNA组相比,siRNA组的Bcl-2蛋白表达增加了（42±2）%（P<0.05）;而高糖组和scr-siRNA组的蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论　HMGB1 siRNA可以通过抑制cleaved-caspase 3的活化和增加Bcl-2蛋白的表达减轻高糖环境下视网膜血管内皮细胞的凋亡。