人卵巢癌顺铂耐药细胞EZH2基因沉默对Drosha基因表达的影响

目的探讨RNA干扰沉默果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)基因对卵巢癌获得性耐药细胞株A2780/DDP的Drosha基因表达的影响。方法获得稳定表达EZH2短发夹状RNA(shRNA)的人卵巢癌获得性耐药细胞株A2780/DDP-shEZH2,实时荧光定量PCR法和免疫印记法检测转染株的Drosha基因表达。结果以未转染组A2780/DDP细胞Drosha的表达水平为100.00%,EZH2-shRNA转染组A2780/DDP-shEZH2细胞Drosha的mRNA及蛋白水平分别上升(53.33±9.24)%和(51.28±3.25)%。结论沉默EZH2基因可以上调Drosha基因的表达。     

卵巢癌顺铂耐药细胞中DNA转录与修复相关基因的表达

目的 研究DNA转录与修复相关基因的表达与卵巢癌顺铂耐药性之间的关系。方法 以卵巢癌亲本细胞系COC1为对照,应用cDNA微阵列检测其顺铂耐药细胞系COC1/DDP中DNA转录与修复相关基因的表达。结果和结论 与COC1细胞相比,COC1/DDP细胞有143个基因的表达水平发生改变,其中共有20个DNA转录与修复相关基因的表达发生改变,表达上调的有13个基因,表达下调的有7个基因,包括CAD、DDB1、DDIT4等大量DNA修复基因以及一般转录因子RNA多聚酶Ⅰ、Ⅱ基因和DHX9、DDX3X基因的表达上调以及MLH1和BTF3基因的低表达,提示COC1/DDP细胞对顺铂的耐药性与DNA转录和损伤修复能力的异常有关。     

人卵巢癌顺铂耐药细胞裸鼠腹腔转移模型的建立

目的　探讨建立人卵巢癌顺铂耐药细胞裸鼠腹腔转移模型的方法。方法　人卵巢癌细胞株 3AO和顺铂耐药细胞株 3AO/cDDP细胞体外培养。 4× 10 6个 3AO、3AO/cDDP分别接种于裸鼠腹腔 96h后 ,各随机分为 2组 ,分别腹腔内注射生理盐水和顺铂 (cDDP) ,观察各组裸鼠的致瘤率、生存期和生存延长率。采用流式细胞技术观察转移瘤LRP、MRP基因的表达情况。转移瘤瘤体行病理学检查。结果　 3AO、3AO/cDDP细胞的裸鼠致瘤率差异无显著性 ,P >0 .0 5 ;cDDP能提高 3AO荷瘤鼠的生存期及生存延长率 ,与 3AO/cDDP荷鼠相比 ,差异有显著性 ,P <0 .0 5 ;3AO/cDDP转移瘤的LRP、MRP基因的表达水平显著高于 3AO转移瘤 ,P <0 .0 5 ;病理学检查提示裸鼠腹腔转移瘤细胞具人恶性特征。结论　该方法建立裸鼠卵巢癌腹腔转移模型具有成瘤率高的特点 ,并能保持顺铂耐药特征。     

卵巢癌顺铂耐药细胞中DNA转录与修复相关基因的表这

目的 研究DNA转录与修复相关基因的表达与卵巢癌顺铂耐药性之间的关系。方法 以卵巢癌亲本细胞系COC1为对照，应用cDNA微阵列检测其顺铂耐药细胞系COC1／DDP中DNA转录与修复相关基因的表达。结果 和结论与COC1细胞相比．COC1／DDP细胞有143个基因的表达水平发生改变，其中共有20个DNA转录与修复相关基因的表达发生改变，表达上调的有13个基因，表达下调的有7个基因，包括CAD、DDB1、DDIT4等大量DNA修复基因以及一般转录因子RNA多聚酶Ⅰ、Ⅱ基因和DHX9、DDX3X基因的表达上调以及MLH1和BTF3基因的低表达．提示COC1／DDP细胞对顺铂的耐药性与DNA转录和损伤修复能力的异常有关。     

凋亡相关基因及蛋白的表达与人卵巢癌细胞顺铂耐药的关系

目的探讨COC1/DDP和COC1中凋亡相关基因及凋亡相关蛋白的表达与人卵巢癌顺铂耐药的关系。方法采用流式细胞仪检测不同浓度顺铂作用于COC1及COC1/DDP细胞48h后细胞凋亡率;RT-PCR及Western blot法检测凋亡相关基因及蛋白Bcl-2、Caspase-3、Smac和Survivin在COC1和COC1/DDP中的表达。结果DDP作用于COC1和COC1/DDP细胞48h后细胞随着DDP浓度的升高,凋亡率也相应增高。COC1/DDP中抗凋亡基因及蛋白Bcl-2、Survivin的表达明显高于COC1。COC1/DDP中促进凋亡的基因及蛋白Smac、Caspase-3的表达明显低于COC1。结论在COC1/DDP中抗凋亡基因及蛋白Bcl-2、Survivin的高表达以及促进凋亡的基因及蛋白Smac和Caspase-3的低表达可能参与COC1/DDP对DDP耐药的发生机制。     

人卵巢癌顺铂耐药细胞株的建立及耐药机制研究

目的：建立人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1／DDP,探讨其耐药的机制。方法：采用逐步递增DDP浓度、体外间歇诱导法诱导卵巢癌细胞系COC1,建立卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1／DDP;CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit-8）检测各种抗癌药对COC1和COC1／DDP细胞增殖的抑制作用,并计算耐药指数;GSH和GSSG试剂盒检测细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）的水平;高效液相色谱测定细胞内顺铂的含量。结果：历时5个月建立COC1／DDP,对顺铂耐药性稳定,耐药指数为9．44;与COC1比较,COC1／DDP细胞内GSH的水平增高,顺铂含量下降（P〈0．01）。结论：入卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1／DDP耐药性稳定,耐药机制可能与GSH／GST-π解毒系统活性增强,减少细胞内顺铂含量有关。     

人卵巢癌顺铂耐药细胞株的建立及其耐药机制的研究

目的 通过建立人卵巢癌体外耐药模型，研究卵巢癌对顺铂的耐药机制。方法应用顺铂连续作用并逐步提高药量的递增压力选择法，从人卵巢腺癌细胞ＣＯＣ１中分离出对顺铂耐药的细胞亚株（ＣＯＣ１／ＤＤＰ），并比较耐药细胞和亲代细胞某些生物学特性差异。结果ＣＯＣ１／ＤＤＰ细胞对顺铂的耐药性是ＣＯＣ１的６．５倍，群体倍增时间较亲代细胞缩短了１２．９％。对卡铂和丝裂霉素Ｃ有不同程度的交叉耐药性，对阿霉素和５－氟尿嘧啶则保持敏感。并且耐药细胞内铂离子含量及ＤＮＡ链间交联指数均明显低于ＣＯＣ１细胞，但免疫细胞化学显示ＣＯＣ１及ＣＯＣ１／ＤＤＰ细胞内均无Ｐ糖蛋白表达。结论ＣＯＣ１／ＤＤＰ细胞对顺铂耐药的主要原因是细胞内药物浓度降低及ＤＮＡ链间交联形成减少，与Ｐ糖蛋白关系不大。     

放疗对卵巢癌顺铂耐药细胞的影响

目的 探究放疗对卵巢癌顺铂(cisplatin, CDDP)耐药细胞耐药性的影响,并探讨相关机制。方法 取对数期卵巢癌SKOV3细胞株、SKOV3/CDDP耐药细胞株,二甲基噻唑(dimethythiazole, MTT)法检测SKOV3、SKOV3/CDDP对CDDP敏感性,以及放疗对SKOV3/CDDP的杀伤作用;取对数期SKOV3/CDDP耐药细胞株,采用0.5 Gy×4次低剂量分割放疗干预,设为低剂量分割放疗组,取不处理SKOV3/CDDP耐药细胞株为空白组,平板克隆实验测定2组的克隆形成能力;流式细胞术测定凋亡率;碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色测定细胞周期;Western blot检测细胞周期蛋白-D1(cyclin-D1)、骨髓细胞瘤病毒癌基因(cellular-myelocytomatosis viral oucogene, c-myc)、β-链蛋白(β-catenin)、p-β-catenin蛋白表达。结果 CDDP对SKOV3、SKOV3/CDDP细胞的半数抑制剂量(half inhibitory concentration, IC_...     

顺铂诱导人卵巢癌细胞凋亡的形态学观察

顺钱在孵巢肿瘤化疗中疗效肯定,为进一步探讨其作用机制,本实验采用ＡＯ１０／１７细胞为标本,通过光镜、电镜观察顺铂作用后细胞的形态改变,流式细胞仪（ＦＣＭ）分析其ＤＮＡ含量及二苯胺法测定其ＤＮＡ降解。结果发现２０ｕｍｏｌ／Ｌ顺铂作用后２４～３６ｈ,发生细胞凋亡,其细胞形态学改变包括体积缩小;核染色质浓缩,并沿核膜周围聚集,最后形成有膜包绕的凋亡小体,并被邻近细胞吞噬;还有一些细胞胞浆中出现空泡。２０ｕｍｏｌ／Ｌ顺铂作用后１２ｈ,ＦＣＭ显示Ｇ１峰前出现凋亡峰,其ＤＮＡ含量为Ｇ１期细胞的３０％～７０％…     

卵巢癌顺铂耐药细胞系的建立

目的 :建立人卵巢癌体外耐药模型 ,研究卵巢癌对顺铂的耐药特征。方法 :模仿临床卵巢癌化疗模型 ,采用中等浓度、间歇作用法 ,从人卵巢癌细胞株SKOV3培养出对顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP ;倒置显微镜下观察细胞形态 ;MTT法、单克隆形成法检测耐药细胞的耐药指数 ;流式细胞仪检测两种细胞的细胞周期分布。结果 :SKOV3/DDP细胞形态无明显改变 ;耐药指数用MTT法检测为 1 8,单克隆形成法检测为 8;SKOV3主要分布于G0 -G1期 ,SKOV3/DDP主要分布于S期及G2 -M期。结论 :中等剂量、间歇作用法可以诱导出卵巢癌细胞株SKOV3对顺铂耐药性。此项研究结果可为临床卵巢癌化疗方案的制定、复发癌二线化疗药物的选择提供理论依据     

Effect of Silencing EZH2 on Drosha Gene Expression in Cisplatin-resistant Ovarian Cancer Cell Line A2780/DDP

目的 探讨RNA干扰沉默果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)基因对卵巢癌获得性耐药细胞株A2780/DDP的Drosha基因表达的影响.方法 获得稳定表达EZH2短发夹状RNA(shRNA)的人卵巢癌获得性耐药细胞株A2780/DDP-shEZH2,实时荧光定量PCR法和免疫印记法检测转染株的Drosha基因表达.结果 以未转染组A2780/DDP细胞Drosha的表达水平为100.00%,EZH2-shRNA转染组A2780/DDP-shEZH2细胞Drosha的mRNA及蛋白水平分别上升(53.33±9.24)%和(51.28±3.25)%.结论 沉默EZH2基因可以上调Drosha基因的表达.     

Ad.mda-7/IL-24的构建及在卵巢癌耐药癌细胞株中的感染表达

目的 利用Adeasy 1系统,构建并鉴定人mda-7/IL-24重组腺病毒(Ad.mda-7/IL-24).方法 从质粒pREP4-mda-7中扩增目的基因mda-7/IL-24,亚克隆至pAdTrack CMV穿梭质粒中,与pAdEasy 1质粒在E.coli BJ5183中进行同源重组为腺病毒载体质粒,线形化后转染293细胞进行包装扩增得到Ad.mda-7/IL-24.感染人卵巢癌泰素耐药株OVCAR-8/TR,Western-blot检测感染后MDA-7/IL-24蛋白表达.结果 重组腺病毒载体经测序、酶切电泳及感染后蛋白表达检测均表明成功构建Ad.mda-7/IL-24;病毒感染量为10 μL时,感染OVCAR-8/TR细胞可达100%感染率.细胞感染后可表达MDA-7/IL-24目的蛋白.结论 成功构建了人Ad.mda-7/IL-24,并能有效感染卵巢癌耐药细胞株,为进一步研究mda-7/IL-24基因在卵巢癌耐药中的作用奠定了基础.     

卵巢癌中多药耐药基因的表达及其意义

为探讨卵巢癌隐含的耐药机制及其对化疗的影响,用RT－PCR方法对7例正常卵巢组织及32例卵巢癌进行了多药耐药基因（mdr1)检测,结果表明：正常卵巢组织中,rdr1基因均无表达,32例卵巢癌中,mdr1表达阳性率为28．1％,mdr1基因表达与病理类型有关（P＜0．05）,而且mdr1表达阳性者耐药发生率（55．6％）显著高于阴性者（8．6％,P＜0．01）。结果提示：卵巢癌中隐含有由mdr1介导的多药耐药机制,mdr1的表达与卵巢癌的化疗耐药有一定的关系。     

实时定量RT-PCR检测乳腺癌组织Drosha基因表达及其意义

目的通过检测Drosha在乳腺癌组织中的表达情况,探讨其在乳腺癌发生发展中的意义。方法乳腺癌肿瘤组织与正常乳腺组织标本各78例自身配对分成肿瘤组与正常组,提取总RNA,利用SYBR Green1实时定量RT-PCR方法检测Drosha基因mRNA的表达情况。结果在mRNA水平上,Drosha基因在71.80%(56/78)的癌组织中下调,28.20%(22/78)上调。经REST软件分析,其表达下调具有统计学意义(P0.01),Drosha mRNA低表达与TNM分期差异有统计学意义(P0.01),与患者年龄、月经状态、肿瘤大小、淋巴结是否转移、组织学分级、激素受体状态(ER、PR和HER-2)等差异均无统计学意义(P0.05)。结论 Drosha基因在乳腺癌中表达下调,可能与乳腺癌的发生发展有关。     

Ad.mda-7/IL-24对卵巢癌耐药细胞株生长及耐药的影响

目的 探讨抑癌基因mda-7/IL-24对卵巢癌耐药细胞株OVCAR-3、OVCAR-8/TR生长和耐药性的影响.方法 以前期研究成功构建的mda-7/IL-24基因重组腺病毒载体Ad.mda-7/IL-24感染OVCAR-3、OVCAR-8/TR两种卵巢癌耐药细胞株,Western blot检测MDA-7/IL-24蛋白的表达,MTT法检测细胞感染后的生长增殖情况,以及对顺氯氨铂(DDP)、阿霉素(ADM)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、泰素(Taxol)4种化疗药物敏感性的变化.结果 OVCAR-3、OVCAR-8/TR细胞在病毒感染量为10 μL时,均达到100%感染率;细胞感染后可成功表达MDA-7/IL-24蛋白; Ad.mda-7/IL-24感染OVCAR-3、OVCAR-8/TR后细胞生长抑制明显,第5d细胞生存率分别降至10.5%和35.8%;感染后两种细胞的泰素药敏分别约为未感染前的2.76和1.52倍,OVCAR-3细胞对ADM和5-FU药敏分别约为未感染前的1.6和3.01倍.结论 mda-7/IL-24基因对卵巢癌耐药细胞有生长抑制作用,同时可能逆转肿瘤细胞对泰素的耐药性.     

新藤黄酸诱导卵巢癌A2780细胞凋亡的作用研究

目的 研究新藤黄酸对卵巢癌细胞增殖的抑制作用及其可能的机制。方法 采用MTT检测新藤黄酸对卵巢癌A2780细胞存活率的影响,采用fluo-3AM染色荧光显微镜观察新藤黄酸对A2780细胞钙离子水平的影响,采用Hoechst 33342染色荧光显微镜观察细胞的凋亡率,采用PI染色流式细胞仪检测新藤黄酸对细胞周期的影响,采用Annexin Ⅴ-FITC/PI染色流式细胞仪检测新藤黄酸对细胞凋亡率的影响,采用Western blot检测凋亡相关蛋白表达的影响。结果 MTT检测结果表明,新藤黄酸对卵巢癌细胞A2780的增殖具有抑制作用,且抑制作用具有明显的剂量依赖性;fluo-3AM染色荧光显微镜下观察,可见各浓度新藤黄酸均能升高A2780细胞内钙离子水平,且呈现浓度依赖关系;PI染色流式细胞仪检测结果表明,新藤黄酸能阻滞A2780细胞于G0/G1期;Hoechst 33342染色和Annexin Ⅴ-FITC/PI染色流式细胞仪检测结果表明,随着新藤黄酸浓度的增加,A2780细胞凋亡率呈现增高的趋势;Western blot检测结果表明,新藤黄酸可以促进凋亡相关蛋白p53、细胞色素C以及Caspase-9表达水平升高。结论 新藤黄酸具有抑制卵巢癌A2780细胞增殖和诱导肿瘤细胞发生线粒体凋亡的作用。     

OSTP增强紫杉醇诱导卵巢癌A2780细胞凋亡的作用

目的 研究卵巢癌特异性结合肽（OSTP）及联合紫杉醇对卵巢癌A2780细胞生长及凋亡的影响.方法 体外培养卵巢癌A2780细胞,随机分为4组：溶剂对照组（1640和0.1％ DMSO组）、OSTP组、紫杉醇组、OSTP联合紫杉醇组.采用四甲基偶氮唑盐（MTT法）检测OSTP对A2780细胞生长的影响;用Annexin-V-FITC和PI双染法标记A2780细胞,通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 MTT法检测OSTP以不同浓度作用于卵巢癌A2780细胞时,可对该细胞的生长起到抑制作用,与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）.应用流式细胞技术检测细胞凋亡发现：不同浓度的OSTP（20、40、80、160、320μmol/L）对A2780细胞的凋亡率分别7.88％、8.348％、8.727％、9.393％和10.68％,与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）,提示OSTP可诱导细胞凋亡.OSTP和紫杉醇联合应用,在不同的预处理组（加OSTP80μ mol/L 0、3、6、12h）后再加紫杉醇10μmol/L作用48h,结果发现细胞凋亡率分别是39.40％、53.09％、48.18％和45.62％,均高于OSTP和紫杉醇单独用药及两者的凋亡率相加值,且差异有统计学意义（P ＜0.001）.提示OSTP能增强紫杉醇诱导的卵巢癌A2780细胞凋亡作用.结论 OSTP对卵巢癌A2780细胞有生长抑制及凋亡作用,尤其是OSTP能增强紫杉醇诱导卵巢癌A2780细胞凋亡的作用,对于探讨和开发OSTP作为靶向化疗增敏剂治疗卵巢癌有良好的应用前景.     

bcl-2-反义寡核苷酸对卵巢癌顺铂耐药细胞株的耐药逆转作用

目的：探讨bcl-2—反义寡核苷酸(bck-2—AODN)对卵巢癌顺铂(DDP)耐药细胞耐药性的逆转作用。方法：以卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP为模型,用脂质体转染的方法,将bck-2-AODN转染A2780/DDP细胞,同时以转染bcl-2正义链(bcl-2-SODN)作对照。采用DNA凝胶电泳检测转染后是否诱导细胞出现凋亡,应用免疫组织化学技术检测Bcl—2蛋白表达变化,RL-PCR检测Bcl—2mRNA表达水平的变化。MTT法检测细胞抑制率与药物半数抑制浓度。结果：脂质体转染bcl-2反义寡核苷酸12h后,倒置显微镜下即可见A2780/DDP有40％细胞出现变化,收集细胞检测,bcl-2蛋白表达降低;实验组bcl—2mRNA表达水平与转染前相比,基因扩增条带亮度明显减弱,mRNA表达率下降(P＜0．05);DNA凝胶电泳出现梯带状条带;细胞药物半数抑制浓度下降(P＜0．05)。结论：bcl-2-AODN可通过增加细胞的凋亡而一定程度地逆转卵巢癌细胞的顺铂耐药性,提高卵巢癌细胞对化学治疗药物的敏感性。