葡萄糖神经酰胺合成酶在人白血病细胞中的表达及其与多药耐药的关系

目的 观察葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase。GCS）基因在人白血病细胞的表达及其与肿瘤多药耐药的关系。方法采用RT-PCR方法分析耐药／非耐药白血病患者GCS基因和多药耐药（multidrug resistance，MDR）基因（mdr1）的表达水平及其两者的差异。结果白血病耐药组GCS基因扩增条带光密度相对比值明显高于非耐药组（P〈0．05）；白血病患者标本GCS基因扩增条带显著增强时往往伴有mdr1基因的表达，两者呈正相关（P〈0．01、7=0．6）。结论白血病多药耐药患者GCS基因的表达明显强于非耐药患者，GCS基因的表达与mdr1基因相关。提示GCS基因可能在白血病多药耐药中起着重要作用。     

米非司酮调控卵巢癌细胞表达葡萄糖神经酰氨合成酶并逆转其多药耐药性

目的 观察米非司酮体外逆转COC1/DDP细胞对顺铂的多药耐药性(MDR)以及对细胞葡萄糖神经酰氨合成酶(GCS)表达的影响,初步探讨其增敏机制.方法 以米非司酮为MDR修饰剂,MTT法检测米非司酮对COC1/DDP的增敏效应.RT-PCR技术分析耐药株COC1/DDP的MDR逆转前后以及亲本株COC1细胞的GCS在mRNA水平的表达.结果 米非司酮增强COC1/DDP细胞对DDP敏感性;与COC1相比,COC1/DDP细胞的GCS在mRNA水平的表达增强;米非司酮使GCS表达降低,效应呈剂量依赖关系.结论 无毒性剂量米非司酮可以在体外增加卵巢癌COC1/DDP细胞对DDP的敏感性.作用机制与抑制GCSmRNA表达有关.     

葡萄糖神经酰胺合成酶siRNA表达载体的构建

目的:构建针对葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)mRNA的siRNA表达载体,并观察其对转染细胞中GCS表达的影响.方法:根据人GCS mRNA编码序列,设计并合成3对针对GCS的发卡状RNA的寡核苷酸,各64个碱基,退火后插入pSUPER EGFP载体重组构建RNAi质粒,进行双酶切及测序鉴定.重组质粒用脂质体包裹转染入SGC7901/VCR细胞,采用RT-PCR检测GCS mRNA表达水平的变化.结果:重组构建的载体经酶切鉴定与测序分析,显示特定位点靶序列与设计序列完全一致.转染SGC7901/VCR细胞后,GCS mRNA表达明显降低.结论:GCSsiRNA表达载体构建成功,并可有效抑制人胃癌耐药SGC7901/VCR细胞中GCS的表达,为后续研究及肿瘤的基因治疗奠定了基础.     

葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株KBV200的表达及其与肿瘤多药耐药性的关系

目的 观察葡萄糖神经酰胺合酶(glucosylceramide synthase，GCS)基因在人口腔表皮样癌多药耐药细胞株KBV200的表达及其与肿瘤多药耐药性(MDR)的关系。方法 采用RT-PCR分析KBV200及其亲本KB细胞株GCS基因表达的差异，运用MTT法分析KBV200经糖脂合成酶抑制剂苯基棕榈酰胺吗啡丙醇(DL-PPMP)及钙离子通道阻滞剂异搏定处理前后细胞MDR的变化，应用RT-PCR技术检测KBV200细胞耐药逆转后GCS及mdr1基因的表达。结果 KBV200细胞GCS和mdr1基因的表达明显强于KB细胞，而KB细胞mdr1基因表达为阴性。5～25umol／L DL-PPMP均可抑制KBV200 GCS mRNA表达，25umol／L时抑制强度最大；10umol／L异搏定即可抑制KBV200 GCS mRNA表达，15umol／L时抑制作用明显。DL-PPMP和异搏定均可抑制mdr1基因的表达，KBV200经25umol／L DL-PIMP作用48h后细胞内mdr1表达为阴性。结论 异搏定和DL-PPMP对GCS和mdr1基因表达的抑制调节呈浓度依赖性，它们可通过抑制GCS和mdr1基因表达，逆转KBV200对长春新碱的耐药。KBV200 GCS基因的表达与MDR存在正相关，GCS基因可能在肿瘤的多药耐药过程中起着重要作用。     

肿瘤的多药耐药与神经酰胺糖基化的研究进展

近年来 ,研究证明鞘脂类物质 (sphingolipids)广泛参与信号传导过程 ,控制细胞的生长和凋亡[1 ] 。鞘脂类包括诱导细胞凋亡的神经酰胺 (ceramide) ,以及诱导细胞增殖的鞘氨醇 1 磷酸 (sphingosine 1 phosphate ,Sph1P)、葡萄糖苷基神经酰胺(glucosylceramide ,GlcCer)和其他鞘糖脂 (GSLs)。凋亡和增殖相互作用 ,哪条途径占优势 ,将决定细胞是生存还是凋亡。多药耐药的肿瘤细胞神经酰胺糖基化能力加强 ,阻断神经酰胺糖基化 ,提高细胞内神经酰胺的水平 ,可以诱导多药耐药(MDR)细胞发生凋亡。本文就此综述如下。1　神经酰胺诱导细胞凋亡1.…     

四氢异喹啉类化合物HZ08通过降低白血病细胞的葡萄糖神经酰胺合成酶和MDR1表达水平逆转耐药作用

通过对比K562/A02细胞株和耐药白血病临床样本的实验结果,探讨四氢异喹啉类化合物HZ08对多药耐药的逆转作用和逆转机制。将阿霉素与10 μmol/L HZ08合用,MTT法测得阿霉素对临床耐药的白血病细胞的IC₅为0.60 μmol/L,对K562/A02细胞的IC₅₀为0.83 μmol/L,逆转倍数分别为27.87和20.49。使用免疫印迹法检测细胞内葡萄糖神经酰胺合成酶（GCS）表达水平,荧光实时定量聚合酶链反应检测MDR1的mRNA表达水平。结果显示：各浓度的HZ08（15,20,25 μmol/L)与阿霉素合用均能降低GCS的表达,与单用阿霉素组相比,阿霉素与HZ08合用可显著降低MDR1的mRNA表达(P<0.01)至空白组水平。结果表明,HZ08与阿霉素合用给药,对K562/A02细胞株和耐药的临床耐药白血病细胞均有较强的逆转作用,其机制可能与降低细胞内GCS蛋白的表达和MDR1 mRNA的表达有关。     

葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株KBV200的表达及其与肿瘤多药耐药性的关系

目的 观察葡萄糖神经酰胺合酶(glucosylcerarnide synthase,GCS)基因在人口腔表皮样癌多药耐药细胞株KBV_(200)的表达及其与肿瘤多药耐药性(MDR)的关系。方法 采用RT-PCR分析KBV_(200)及其亲本KB细胞株GCS基因表达的差异,运用MTT法分析KBV_(200)经糖脂合成酶抑制剂苯基棕榈酰胺吗啡丙醇(DL-PPMP)及钙离子通道阻滞剂异搏定处理前后细胞MDR的变化,应用RT-PCR技术检测KBV_(200)细胞耐药逆转后GCS及mdrl基因的表达。结果 KBV_(200)细胞GCS和mdrl基因的表达明显强于KB细胞,而KB细胞mdrl基因表达为阴性。5～25μmol/L DL-PPMP均可抑制KBV_(200)GCS mRNA表达,25 μmol/L时抑制强度最大;10 μmol/L异搏定即可抑制KBV_(200)GCS mRNA表达,15 μmol/L时抑制作用明显。DL-PPMP和异搏定均可抑制mdrl基因的表达,KBV_(200)经25μmol/L DL-PPMP作用48h后细胞内mdrl表达为阴性。结论 异搏定和DL-PPMP对GCS和marl基因表达的抑制调节呈浓度依赖性,它们可通过抑制GCS和mdrl基因表达,逆转KBV_(200)对长春新碱的耐药。KBV_(200)GCS基因的表达与MDR存在正相关,GCS基因可能在肿瘤的多药耐药过程中起着重要作用。     

反义寡核苷酸阻断乳腺癌细胞中葡萄糖神经酰胺合成酶的表达和意义

目的探讨靶向葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase,GCS）的基因试剂MBO－asGCS逆转乳腺癌多药耐药的作用机制及其意义。方法MBO-asGCS处理体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7及其耐药型MCF-7／AdrR,采用细胞毒性分析测定MBO—asGCS对MCF-7-AdrR存活率的影响,RT—PCR和Western印迹分析对耐药型细胞GCS的表达变化,检测对caspase3／7的活性影响及流式细胞仪测定MBO-asGCS对耐药型细胞的凋亡情况。结果MBO-asGCS转染人耐药型乳腺癌细胞MCF-7／AdrR后,与未转染组细胞的Ic50分别是0．18μmol／L和12．50μmol／L,药物敏感性提高了69倍;MBO—asGCS抑制GCS的mRNA表达70％,减少GCS蛋白表达39％（P〈0．01）;转染MBO．asGCS后耐药型细胞的caspase3／7活性上升53％（P〈0．05）,细胞凋亡率上升5．6倍（P〈0．01）。结论GCS过表达是耐药型乳腺癌细胞的特征,靶向人GCS的反义寡核苷酸可直接抑制GCS的过表达,诱导耐药细胞凋亡,有效逆转其耐药性,GCS可能是治疗耐药型乳腺癌的一个潜在靶点。     

葡萄糖糖基神经酰胺合成酶特异性小干扰RNA表达载体的构建及其逆转乳腺癌细胞耐药的研究

目的　构建葡萄糖糖基神经酰胺合成酶(GCS)小干扰RNA表达载体,观察其对乳腺癌耐药细胞(MCF- 7 /ADR)GCS基因表达和耐药性的影响。方法　设计合成2对GCS基因的特异性siRNA,分别定向克隆入真核表达载体pSUPER,构建pSUPER -GCS1和pSUPER -GCS2重组质粒,脂质体LipofectAMINE2000介导转染MCF -7 /ADR细胞,空载体pSUPER转染作为对照,逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)分析GCSmRNA的表达,流式细胞仪观察GCS蛋白的表达,四氮唑盐法检测阿霉素对MCF -7 /ADR细胞的半数抑制浓度(IC50 ),流式细胞技术检测细胞凋亡率的改变。结果　酶切分析和测序证实成功构建了针对GCS的siRNA表达载体pSUPER -GCS1和pSUPER GCS2。两对重组质粒均可特异性抑制GCS基因表达,转染后48hGCSmRNA抑制率分别为89 .4%、88. 5%,GCS蛋白含量分别下降为8 .3%±1 .0%, 9. 2%±0 .8%,四氮唑盐法显示重组质粒对阿霉素耐药性相对逆转率分别为93. 7%、91. 6%,明显提高了乳腺癌细胞对于阿霉素的药物敏感性,流式细胞仪结果表明细胞凋亡率增加为15. 38±1 .16, 13. 92±1 .73,而空载体对照组无以上作用。结论　GCS特异性siRNA表达载体构建成功,且有效抑制了GCS基因表达,并通过诱导耐药细胞凋亡率增加,逆转乳腺癌细胞多药耐药。     

腺病毒介导p53基因逆转乳腺癌耐药的实验研究

目的探讨腺病毒介导p53基因（Ad-p53）对人乳腺癌阿霉素（ADM）耐药细胞株MCF-7／ADM的耐药性及多药耐药基因1（MDR1）的影响。方法以Ad-p53转染MCF-7／ADM细胞株,流式细胞术检测p53蛋白变化;锥虫蓝活细胞拒染法观察细胞生长情况;MTT法观察MCF-7／ADM细胞对阿霉素耐药性的变化,实时荧光RT—PCR法检测MDR1 mRNA变化。结果流式细胞术观察到MCF-7／ADM细胞经MOI50的Ad-p53作用48h后,p53蛋白表达率由10．24％升高到36．20％;细胞抑制率为7．4％（P=0．003）;逆转MCF-7／ADM对ADM的耐药倍数11．6倍（P=0．001）;实时荧光RT-PCR检测结果显示MDR1 mRNA相对表达量由1．25±0．01下降至0．91±0．01（P=0．011）。结论腺病毒介导p53基因能抑制MCF-7／ADM细胞MDR1基因的表达,并能部分逆转MCF-7／ADM的耐药性,增加阿霉素化疗敏感性。     

重组腺病毒介导MRP反义RNA逆转人肝癌细胞多药耐药表型的体外实验研究

目的探讨重组腺病毒介导的多药耐药相关蛋白（MRP）反义RNA对阿霉素诱导的人肝癌耐药细胞株SMMC-7721／ADM多药耐药表型的体外逆转作用。方法应用自行构建的携带反义MRP的重组腺病毒（Ad—Asmrp）,在体外转染人肝癌耐药细胞,测定转染后细胞对阿霉素（ADM）及柔红霉素（DNR）的半数致死量（IC50）并计算耐药倍数（RF值）;在转染后不同时间点用流式细胞仪动态测定细胞对DNR摄取的变化及细胞膜表面P。。表达、并用RT—PCR反映细胞MRP之mRNA水平的变化。结果携带MRP反义RNA的重组腺病毒转染后的人肝癌耐药细胞对ADM、DNR的IC50分别为0．487μg／ml、0．328μg／ml,RF值分别为97．4、109．3,RF值分别下降36．8和35．4。在转染后24h,MRPmRNA水平开始下降并呈持续下降趋势（P〈0．01）,48h后伴有P190蛋白表达的持续下降（P〈0．01）,二者趋势一致。转染后48h,经流式细胞仪测得细胞内DNR浓度明显上升（P〈0．01）。结论重组腺病毒介导的MRP反义RNA可有效封闭MRP基因表达,在体外实验中能增加人肝癌耐药细胞株对化疗药物的敏感性,对肝癌耐药细胞的MDR表型有较好的逆转作用。     

Upregulation of glucosylceramide synthase protein in papillary thyroid carcinoma

Background Glucosylceramide synthase （GCS） can reduce ceramide levels and help cells escape ceramide-induced apoptosis, thus leading to multidrug resistance （MDR）. However, its expression and clinical significance in thyroid neoplasms still remain unclear. We aimed to elucidate the expression of GCS and explore its correlation with the clinicopathological characteristics in papillary thyroid carcinomas （PTCs）. Methods We retrospectively investigated GCS protein expression level in tissue specimens obtained from 108 consecutive PTC patients by immunohistochemistry and Western blotting. Results GCS was weakly positive or negative in normal follicular cells, but it was frequently overexpressed in PTC cells. GCS overexpression was associated with primary tumor size, local infiltration, lymph node metastasis, and local recurrence, but not associated with gender, age, pathological variants, tumor multifocality, tumor stage or distant metastasis. Western blotting also showed that GCS protein levels were much higher in PTCs＇ tissues than in normal thyroid tissues. Conclusion GCS was upregulated in PTCs and might be an independent factor affecting prognosis.     

白血病K562/ADM细胞耐药性与白血病干细胞及耐药蛋白表达的关系

目的 观察白血病药物敏感和耐受细胞中白血病干细胞(ISC)、耐药蛋白表达和耐药性的关系.方法 以白血病多药耐药株K562/ADM细胞及其亲本K562细胞为模型,MTT比色法测定细胞的药物耐受性;流式细胞术检测细胞免疫标志、P-糖蛋白(P-gp)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)的表达;甲基纤维素集落形成法检测细胞的自我更新和增殖潜能.结果 K562/ADM细胞对阿霉素、柔红霉素和鬼臼乙叉苷高度耐受.K562/ADM细胞中CD34+、CD123+和CD34+CD38-细胞含量均显著高于K562细胞,LSC细胞相对含量是K562细胞的4.12倍;共表达P-gP和BCRP的K562/ADM细胞比K562细胞高11.25倍,其中CD34+ CD38- CD123+ BCRP+和CD34+ CD38- P-gp+ BCRP+细胞数量分别为K562细胞的3.66倍和11.37倍.K562/ADM细胞集落形成率是K562细胞的4.17倍,与LSC含量相当.结论 白血病K562/ADM耐药细胞中存在的高表达耐药蛋白的耐药性LSC是其多药物耐受性的根源.     

新型寡核苷酸对乳腺癌细胞葡萄糖神经酰胺合酶与P-糖蛋白表达的影响

目的: 观察新型反义寡核苷酸MBO-asGCS对乳腺癌细胞中葡萄糖神经酰胺合酶(GCS) 与 P-糖蛋白(P-gp)表达的影响.方法: 实时PCR检测MBO-asGCS处理的耐药型乳腺癌细胞MCF-7-AdrR,蛋白质印迹分析MCF-7-AdrR及其转化细胞中GCS与P-gp的蛋白表达,TUNEL法检测MBO-asGCS处理的MCF-7-AdrR中的细胞凋亡情况.结果: 在耐药株和GCS过表达的MCF-7-AdrR/GCS中GCS和P-糖蛋白表达特征性上升,而在asGCS转化细胞MCF-7-AdrR/asGCS中GCS和P-糖蛋白表达明显下降; MBO-asGCS处理的MCF-7-AdrR中GCS基因表达下调63.6%,凋亡细胞显著增加(P<0.01).结论: 乳腺癌细胞的耐药机制中可能存在GCS和P-糖蛋白的某种关联,升高的GCS可促进神经酰胺的代谢并增强P-糖蛋白的表达,产生耐药现象,反义寡核苷酸可抑制GCS表达,下调P-糖蛋白并促进凋亡.     

人结肠癌细胞HCT-8/V及HCT-8中葡萄糖神经酰胺合成酶的表达

目的:观察人结肠癌HCT-8细胞和其耐药细胞株HCT-8/V中葡萄糖神经酰胺合成酶(CCS)的表达及意义.方法:体外培养HCT-8细胞和HCT-8/V,采用CCK8法检测2种细胞对长春新碱(VCR)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)及顺铂(DDP)的耐药性,计算IC50.采用免疫细胞化学法和RT-PCR法检测2种细胞中GCS蛋...