刺五加MDD基因启动子的克隆与生物信息学分析

目的克隆并分析刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)基因的启动子序列。方法根据刺五加MDD基因的c DNA序列,采用PCR扩增和热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术,克隆MDD基因5’端的DNA序列及启动子序列。利用Plant CARE等软件对其进行生物信息学分析。结果克隆得到长1 423 bp的刺五加MDD基因启动子序列及长1 024 bp的5’端DNA序列。该启动子序列含有49个TATA-box、25个CAAT-box。还含有脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、胚乳表达必须顺式作用元件、干旱胁迫响应元件、光响应元件等多种顺式作用元件,以及2个MYBHv1与2个MBY结合位点。结论首次克隆并分析了刺五加MDD基因的启动子序列,为该基因的表达调控奠定了基础。     

芍药肌动蛋白基因的克隆及表达分析

目的 克隆芍药肌动蛋白(Actin)基因并应用RT-PCR技术分析Actin基因在芍药不同组织中的表达情况.方法 根据近缘物种Actin基因的保守序列设计一对PCR扩增引物,以“桃花飞雪”芍药根部总RNA反转录而成的cDNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出芍药Actin cDNA全长并克隆至pMD 18-T载体上,阳性克隆经菌落PCR、质粒PCR及酶切鉴定后进行测序.基于测序结果设计特异性PCR引物,应用RT-PCR技术分析Actin基因在芍药根、茎、花、叶不同组织中的表达情况.结果 测序结果表明芍药Actin基因全长l 134 bp序列,共编码377个氨基酸,GenBank登录号为JX310002;序列分析表明芍药Actin蛋白中存在3种肌动蛋白特征信号序列,与其他植物肌动蛋白氨基酸同源性达99％;基于同源模建预测的3D结构中含有4个结构域;生物信息学软件预测芍药肌动蛋白的相对分子质量为4.17×104,等电点(pI)为5.31,是一个定位于胞液、不含跨膜域、不含信号肽分子的亲水性、稳定蛋白;半定量RT-PCR技术分析表明Actin基因在芍药根、茎、叶、花组织中的表达量保持恒定.结论 首次从芍药中克隆了Actin基因,半定量RT-PCR表达分析结果表明Actin基因适合作为芍药功能基因表达分析的内标基因,为有效利用该基因奠定了基础.     

太子参玉米黄质环氧化酶基因的克隆与表达分析

玉米黄质环氧化酶(zeaxanthin epoxidase,ZEP)在植物脱落酸(abscisic acid,ABA)生物合成间接途径中发挥着重要调节作用。该研究根据太子参转录组数据,克隆获得太子参的Pseudostellaria heterophylla玉米黄质环氧化酶基因,命名Ph ZEP。对其序列进行生物信息学分析,结果表明Ph ZEP的开放阅读框(open reading frame,ORF)为1 263 bp,编码420个氨基酸,预测其蛋白的相对分子质量为47.34 k Da,等电点(theoretical p I)为6.64;具有脂质蛋白附着点和黄素蛋白单加氧酶的特征性结构域,且在N端含有分泌信号肽。实时荧光PCR分析发现,Ph ZEP在叶片中表达量最高,其次是茎和须根;Ph ZEP在盛花期后10,40 d块根中的表达量较高;ABA处理后Ph ZEP表达量与对照组相当,经氟啶酮处理后Ph ZEP的表达量显著高于对照组。该研究从太子参中分离鉴定了ZEP基因,对后续研究其基因的功能特点和解析ABA在太子参生长发育过程的遗传调控提供研究基础。     

猪苓菌核2种热激蛋白基因的克隆及其表达分析

该研究采用RT-PCR技术从中国野生猪苓菌核Polyporus umbellatus中克隆得到2种热激蛋白基因,其中Pu Hsp90基因的开放阅读框2 091 bp,编码696个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量约78.9 k Da;Pu Hsp70基因的开放阅读框1 944 bp,编码647个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量约70.5 k Da;蛋白质结构预测及同源比对分析表明,这2个基因编码的核苷酸序分别具有Hsp90,Hsp70蛋白的保守结构域。进化树分析表明,Pu Hsp90与变色栓菌Hsp90聚为一类,Pu Hsp70与肝色牛排菌Hsp70聚为一类。qRT-PCR分析表明,蜜环菌侵染的情况下,这2个基因在猪苓菌核中均上调表达。这2个基因在蜜环菌侵染猪苓菌核的状态下有相同的表达模式,预示这2个基因其可能在抗生物胁迫中起重要作用。     

铁皮石斛丙酮酸激酶基因的克隆与表达分析

目的 克隆珍稀濒危药用植物铁皮石斛丙酮酸激酶（pyruvate kinase,PK）基因（DoPK）,并进行生物信息学分析以及检测基因在不同器官中的表达情况。方法 采用RACE技术获得基因的全长cDNA;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 6.0和MEGA 4.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助r实时荧光 (real-time quantitative) PCR (RT-qPCR)分析基因在不同器官中的表达情况。结果 克隆获得DoPK（GenBank注册号KC178572）的cDNA全长1 895 bp,编码一条由511个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为55 040,等电点7.00;DoPK基因与江南卷柏、拟南芥、马铃薯和葡萄等植物的PK基因有71%、86%、89%和91%的相似性;DoPK蛋白包含保守的丙酮酸激酶结构域（21～497）和活性位点（235～247）;DoPK属于胞质型的CYTOSOLIC-1亚类,与单子叶植物亲缘关系较近;DoPK基因为组成型表达,其转录本在石斛茎中的相对表达量较高,为叶中的2.29倍,根中次之,为叶中的1.28倍。结论 克隆了胞质型的铁皮石斛DoPK基因的全长cDNA序列,为进一步研究其在铁皮石斛生长发育中的作用奠定基础。     

铁皮石斛倍半萜合成酶基因的克隆与表达分析

目的克隆铁皮石斛Dendrobium officinale倍半萜合成酶(sesquiterpene synthase,SES)基因,分析其在铁皮石斛不同组织中的表达差异以及在信号分子茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)诱导下的表达模式。方法采用RACE技术克隆铁皮石斛SES(DoSES)cDNA全长,利用相关软件和在线网站对其进行生物信息学分析,并使用实时荧光定量PCR技术分析DoSES的表达模式。结果获得的DoSES cDNA序列(Gen Bank登录号为KX278311)全长1 890 bp,含有1个1 659 bp的完整开放阅读框(ORF),编码552个氨基酸的多肽链,与其他科属植物的同源性达到60%左右。DoSES基因在铁皮石斛茎中表达量最高,从高到低依次是叶、花、原球茎、根;且受到Me JA的诱导。结论克隆了铁皮石斛DoSES基因,为进一步研究调控铁皮石斛萜类代谢奠定了理论基础。     

雷公藤单加氧酶基因全长克隆及表达分析

目的:单加氧酶(Monooxygenase,MO)是一类通过在底物上加一个氧原子的加氧酶,在动植物体内参与多种代谢途径。本实验致力于从雷公藤转录组数据中克隆得到单加氧酶基因c DNA全长,并对克隆得到的MO基因进行初步的功能分析。方法:通过对雷公藤转录组数据中筛选得到MO基因片段设计特异性引物,克隆MO基因c DNA全长,通过生物信息学方法对得到的MO基因进行分析,主要包括多重序列比对,蛋白结构预测和构建进化树分析等。结果:根据分析结果Tw MO基因全长为2 193 bp,共编码507个氨基酸,等电点为8.84,相对分子质量为55.20 k Da,多重序列比对显示它与其他植物的MO基因具有较高的同源性。雷公藤悬浮细胞经外源茉莉酸甲酯(Me JA)诱导后,实时荧光定量结果显示,TwMO的表达量明显增加,并在48 h达到最高,提示Tw MO基因与雷公藤的次生代谢产物的生成有关。结论:本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到MO基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

党参CpUGPase基因的克隆、序列分析与原核表达

目的为研究党参多糖代谢途径,从党参Codonopsis pilosula根中克隆多糖代谢关键酶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶CpUGPase基因,并进行序列分析和原核表达。方法根据党参转录组中CpUGPase基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增得CpUGPase开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体PET-28a-CpUGPase,转入大肠杆菌BL21(DE3)后,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下进行表达。结果 CpUGPase ORF序列全长1 413bp,编码470个氨基酸。序列分析表明,CpUGPase基因具有保守的UGPase_euk催化位点,属于A型糖基转移酶蛋白家族。构建PET-28a-CpUGPase重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约54 900,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论从党参根中克隆得到CpUGPase基因,并建立了稳定的原核表达体系,为进一步纯化CpUGPase蛋白,研究其结构和功能奠定了基础。     

中国红豆杉TcAPLs基因的克隆及表达分析

目的克隆中国红豆杉altered phloem development(APL)基因,研究APL在中国红豆杉剥皮后树皮再生过程中的表达状况,以揭示其可能的调控作用机制。方法利用反转录PCR(RT-PCR)方法克隆得到3个中国红豆杉APL(TcAPLs)基因的cDNA全长序列,分别命名为TcAPL1、TcAPL2和TcAPL3,进一步利用生物信息学工具对其进行分析,最后利用半定量RT-PCR对中国红豆杉不同组织和qRT-PCR技术对其剥皮再生不同时期的TcAPLs进行表达分析。结果系统进化树结果显示,TcAPL1与TcAPL2编码的蛋白与川桑的APL蛋白亲缘关系最近,聚为一类;TcAPL3处在APL另一个大的独立分支上。组织表达谱分析表明TcAPL1和TcAPL22个基因主要在根、茎、叶片和韧皮部(含形成层)中均高表达;TcAPL3在叶片中表达量较高,而在根和木质部(含形成层)表达较低。在中国红豆杉剥皮再生过程中,TcAPL1和TcAPL22个基因的表达水平随着时间的延长表现为先上升后下降的趋势,均在36 d下降最明显;TcAPL3的表达则在整个组织再生过程中被抑制。结论克隆了3个TcALs基因,3个基因在中国红豆杉剥皮再生过程中均有响应,推测它们在中国红豆杉植物剥皮后组织再生中起一定的调控作用。     

五味子的UPLC指纹图谱研究

目的 建立五味子Schisandra chinensis的超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱。方法 采用Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm × 2.1 mm,1.8 μm）;以乙腈-水为流动相梯度洗脱;体积流量0.5 mL/min;柱温30 ℃;检测波长216 nm;进样量2 μL。结果 首次建立了五味子的UPLC特征指纹图谱共有模式,标定了21个共有峰,结合保留时间和紫外光谱分析,指认了五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子γ-乙素、五味子乙素和五味子丙素的峰位。19批五味子的相似度均在0.970以上。结论 该方法快速、高效,可用于五味子的质量评价。     

五味子根的化学成分研究

目的 研究木兰科植物北五味子Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.干燥根的化学成分及其苯丙素类化学成分的神经保护作用。方法 综合运用硅胶、MCI、ODS、Sephadex LH-20及HPLC等色谱方法对五味子根中化学成分进行了系统的分离纯化,利用MS、NMR等手段对分离得到的化学成分进行结构鉴定。采用CCK8法评价分离得到化合物对H₂O₂诱导PC12细胞的神经保护作用。结果 从五味子根70%乙醇提取物中分离并鉴定了37个化合物,包括22个苯丙素类:C-藜芦酰乙二醇(1)、baihuaqianhuaside(2)、methyl-4-O-comaroylquinate(3)、7R,8S-threo-4,7,9,9''-tetra-hydroxy-3,3''- dimethoxy-8-O-4''-neolignan(4)、二氢去氢双松柏醇(5)、开环异落叶松树脂酚(6)、(−)-secoisolariciresinol-9-O-β-D- xylopyranoside(7)、(+)-异落叶松树脂醇(8)、ent-isolariciresinol-9''-O-β-D-xylopyranoside(9)、schizandriside(10)、左旋马尾松树脂醇(11)、罗汉松脂素(12)、2-hydroxy-2-(3'',4''-dihydroxy-phenyl)methyl-3-(3'',4''-dimethoxy-phenyl) methyl-γ-butyrolactone(13)、去甲络石苷(14)、络石苷(15)、牛蒡子苷(16)、(+)-neo-olivil(17)、matairesinol 4''-O-β- D-glucopyranoside(18)、3,7-dihydroxy-1,2,13,14-tetramethoxydibenzo cyclooctadiene 12-O-β-D-glucopyranoside(19)、五味子酯D(20)、leptolepisol D(21)、xanthiumnolic C(22);7个单萜类:反式-索布瑞醇(23)、magnoliaterpenoid C(24)、(1S,2S,4R)-2-hydroxy-1,8-cineole-β-D-glucopyranoside(25)、(1S,4R,6R)-6-hydroxy-bornan-2-one 6-O-β-D-glucopyranoside(26)、(1R,4R,5S)-5-endo-hydroxycam-phor5-O-β-D-glucopyrao-side(27)、鸡矢藤苷(28)、paediatrics acid methyl ester(29);5个芳香族类:3-ethoxy-4-hydroxy-benzoic acid(30)、没食子酸乙酯(31)、benzyl β-D-glucopyranoside(32)、3,4- dimethoxyphenyl-β-D-glucopyranoside(33)、草夹竹桃苷(34);2个黄酮类:表儿茶素(35)、taxifolin-3-O-β-D-xylopyranoside(36),以及1个二芳基庚烷类化合物:rhoiptelol C(37)。结论 化合物1~3、6~7、13~17、21、25~31、37为首次从木兰科中分离出来,化合物4~5、9~12、22~23、32、34、36为首次从五味子属植物中分离得到,化合物8、18、33、35为首次从五味子中分离得到。体外神经保护活性研究表明,在6.25 μmol/L时苯丙素类化合物3、10、17细胞存活率较高。     

药用植物五味子内生真菌的分离及其抑菌活性研究

 目的研究药用植物五味子内生真菌及其次生代谢产物的抑菌活性,旨在获得有良好抑菌活性的菌株,以寻找新型抗菌物质。方法以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、单增李斯特菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、酿脓链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和白假丝酵母为试验菌株,用菌饼法及纸片法对分离的真菌及其次生代谢产物进行了抑菌实验。结果从药用植物五味子中分离到36株内生真菌,其中有33株内生真菌对指示菌均表现出不同的抑菌活性,占总分离菌株的91.67%;有30株内生真菌的发酵液对指示菌株也有一定的抑制作用,占总分离菌株的83.33%。结论药用植物五味子的内生真菌及其次生代谢产物中存在着丰富的抑菌天然活性物质,这可为寻找新型抗菌物质提供资源。     

五味子化学成分及抗2型糖尿病活性研究进展

五味子为木兰科(Magnoliaceae)五味子属Schisandra Michx.植物,在我国东南部和东北三省分布广泛。五味子主要化学成分为木脂素类、挥发油类、多糖类和有机酸类等,临床常被用于治疗2型糖尿病,疗效显著。研究显示,五味子具有抗胰岛素抵抗、抗炎、抗细胞凋亡、抗氧化应激、抑制血管病变、保护血管内皮等作用,能较好地改善糖尿病及其并发症。对近40年国内外有关五味子化学成分及其抗2型糖尿病活性研究进展进行综述,为五味子治疗糖尿病相关药物的研发提供参考。     

五味子的研究进展及质量标志物(Q-marker)的预测分析

对近年来五味子的活性成分和药理活性研究系统的整理总结,基于中药质量标志物(Q-marker)的概念,从成分特有性、成分有效性、成分可测性、可入血成分4个方面对五味子Q-marker进行预测。研究建议选择五味子中联苯环辛二烯类木脂素类成分作为Q-marker进行定性、定量分析,为建立和完善五味子质量评价标准研究提供科学依据。     

基于UPLC-Q/TOF-MS的醋制五味子对酒精性肝损伤大鼠胆汁代谢物的影响研究

目的考察五味子醋制前后对由肝脏分泌的胆汁中内源性代谢产物的影响,寻找抗肝损伤潜在的生物标志物,以期探讨五味子醋制增强保肝作用的科学内涵。方法采用基于UPLC-Q/TOF-MS的代谢组学技术,并结合主成分分析(PCA)和正交校正的偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)等方法筛选、鉴定肝损伤相关的生物标志物。结果对照组、模型组、生五味子及醋五味子组胆汁代谢物谱得到明显分离,发现并鉴定了5-膦酰-L-赖氨酸、13-羟酸、tracylglycerol(64:2)、3b,17a-dihydroxy-5a-androstane、12-酮基脱氧胆酸、乙酰左旋肉碱、磷脂酰甘油酯、溶血磷脂酰胆碱8个与肝损伤相关的潜在生物标志物。结论大鼠给予生、醋五味子后可使上述生物标志物代谢水平向正常状态转归,且醋五味子的调节作用强于生五味子,表明五味子经醋制增强抗肝损伤的作用机制可能与调节这些代谢途径相关。     

五味子内生拮抗菌JYg07的定殖研究

目的检测内生拮抗菌JYg07在五味子Schisandra chinensis植株内的定殖情况。方法利用抗生素标记法获得JYg07菌株的抗链霉素和利福平的双抗突变体菌株,采用灌根、喷雾、注射和刺伤叶片等方法接种,测定JYg07菌株在五味子植株内的定殖情况。结果 JYg07菌株可以通过自然孔口和伤口进入五味子体内,并能够在土壤中长期存活;菌液浓度主要影响定殖高峰到来的时间;4种接种方式均可以使JYg07菌株在五味子体内稳定的定殖并传导,并且在根中的定殖能力要高于茎和叶。高浓度接种培养液、灌根接种的方式可以保证JYg07菌株在五味子植株中达到最佳定殖状态。结论JYg07菌株可以在五味子体内稳定定殖并传导,能够作为新的生防菌资源开发利用。     

五味子茎叶的化学成分研究

目的 对五味子Schisandra chinensis茎叶的化学成分进行研究.方法 利用大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶、硅胶柱色谱、半制备高效液相色谱等多种色谱方法分离纯化,根据理化性质及波谱数据对化合物进行结构鉴定.结果 从五味子茎叶75％丙酮提取物中分离得到 15个化合物,分别鉴定为 schisanlatone C(1)...     

五味子中1个新的联苯环辛烯类木脂素

目的 研究中药五味子Schisandra chinensis的木脂素类化学成分。方法 采用硅胶柱色谱、中压反相柱色谱、半制备和制备液相对五味子中富含木脂素类成分的石油醚萃取部位进行分离、纯化,通过波谱数据鉴定化合物的结构。结果 从五味子中分离得到了26个化合物,分别鉴定为绿叶五味子素B(1)、sphaerandrin A(2)、sieverlignan E(3)、arisanschinin G(4)、widdaranalF(5)、戈米辛A(6)、戈米辛B(7)、戈米辛D(8)、戈米辛G(9)、(-)-戈米辛K1(10)、(+)-戈米辛K2(11)、(-)-戈米辛L₁(12)、(+)-戈米辛M1(13)、戈米辛N(14)、当归酰戈米辛H(15)、当归酰戈米辛O(16)、当归酰戈米辛Q(17)、苯甲酰戈米辛Q(18)、五味子醇甲(19)、五味子甲素(20)、五味子乙素(21)、五味子丙素(22)、五味子酯丙(23)、neglschisandrin E(24)、7(18)-dehydroschisandro A(25)、安五脂素(26),其中24个为联苯环辛烯类木脂素(...