宫颈糜烂及HPV16/18 E6的表达关系研究

目的:研究肉眼拟诊为宫颈糜烂的患者其组织学诊断及人乳头瘤病毒16型(或18型)E6蛋白(HPV16/18E6)的表达及其临床意义。方法:随机抽取年龄为18～65岁的肉眼观为宫颈糜烂的患者100例,分为宫颈轻度糜烂组(30例)、中度糜烂组(41例)、重度糜烂组(29例),光滑组100例(对照组)。分别行阴道镜下宫颈活检,作出病理组织学诊断,采用免疫组织化学法(SP法)测定宫颈组织中HPV16/18E6表达情况。结果:(1)各组宫颈活检的病理结果分为正常、宫颈炎、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)Ⅰ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌(Ca)。各组间疾病构成差异有统计学意义(P0.01),且CINⅡ、CINⅢ及Ca随着疾病严重程度亦呈增加趋势。(2)宫颈光滑组、轻度糜烂组、中度糜烂组及重度糜烂组的HPV16/18E6蛋白阳性率分别为21.0%、26.7%、31.7%及51.6%,差异有统计学意义(P0.01)。其中,光滑组与轻度糜烂组及中度糜烂组、轻度糜烂组与中度糜烂组阳性率差异无统计学意义(均P0.05);重度糜烂组与其他各组比较差异有统计学意义(P0.05或P0.01)。结论:肉眼拟诊为宫颈糜烂的患者其组织学诊断多样化,糜烂程度越高,发生宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的可能性越大,HPV16/18E6的表达水平亦有随之升高的趋势。     

喉鳞癌中Ezrin和CD44-v6的表达及临床研究

目的探讨Ezrin、CD44-v6在人喉鳞癌中的表达及临床意义。方法应用Western-blot法检测Ezrin和CD44-v6在36例喉鳞癌组织的癌中心区、过渡区(距肿瘤边缘≤1cm)及无癌区(距肿瘤边缘>1cm)中的表达。结果Ezrin和CD44-v6在喉鳞癌组织的无癌区、过渡区及癌中心区中的表达水平递增;二者的表达与喉鳞癌的T、N分期和病理分级有关;Ezrin和CD44-v6二者之间密切相关。结论过度表达的Ezrin和CD44-v6在喉鳞癌的生长及转移中起重要作用;Ezrin可作为判断喉鳞癌预后的标志物。     

抑癌FHIT基因在喉鳞状细胞癌中表达的研究

目的：探讨喉鳞状细胞癌患者肿瘤组织FHIT基因（fragile histidine triad gene)mRNA的表达。方法：应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法。结果：发现64.1%(25/39例）喉鳞癌组织有FHIT基因的异常表达,56.0%(14/25例）有异常表达同时有正常表达,其相应的正常组织中只有正常的FHIT基因的表达。结论：结果表达FHIT基因的异常表达与喉鳞癌的发生有明显的关系。初步说明FHIT基因可能是一种有潜势的抑癌基因。     

肿瘤抗原基因MAGE-A9的克隆及原核表达

目的扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A9cDNA,构建原核表达载体,表达并纯化MAGE-A9蛋白。方法从人肝癌组织提取总RNA,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从中扩增出MAGE-A9 cDNA,插入载体pMD18-T中,测序正确后,构建重组表达载体pBAD/gⅢ-MAGE-A9,转化大肠杆菌TOP10株。以L-Arabi-nose进行诱导表达,并纯化。结果获得MAGE-A9cDNA,测序结果与GenBank一致。成功构建表达载体,表达可溶重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其相对分子质量为35 000。结论成功地构建了pBAD/gⅢ-MAGE-A9原核表达质粒,获得了MAGE-A9蛋白,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

HPV16、18E6蛋白表达在宫颈癌组织中的意义

目的评价HPV16、18早期蛋白E9表达在宫颈癌组织中的应用价值。方法采用SP免疫组化染色法,检测50例宫颈鳞状细胞癌,40例慢性宫颈炎及40例正常宫颈组织中HPV16、18E6蛋白表达。结果癌组中E6的阳性率为68%(34/50),慢性宫颈炎中5%(2/40),正常宫颈组织中均为阴性,良恶性组HPV16、18E6的阳性率差异有显著意义(P<0.05)。结论HPV16、18E6感染与本地区宫颈癌病因学密切相关,E6单抗可作为预测HPV16、18感染及判断早期宫颈癌的标记之一。     

ROCK1基因在鼻咽癌组织中的表达及其与细胞侵袭的关系

目的观察干扰ROCK1基因对鼻咽癌的细胞侵袭影响。方法 收集2016年1—12月临沂市河东区人民医院30例鼻咽癌病人临床鼻咽癌标本及同期鼻咽癌的癌旁组织,通过免疫组织化学法(免疫组化)检测ROCK1的表达;培养鼻咽癌细胞株6-10B和永生化的鼻咽上皮细胞NP69,蛋白质印迹法(Western Blot)方法检测ROCK1的表达;使用ROCK1的抑制剂Y-27632处理6-10B细胞株,通过Transwell小室实验,检测鼻咽癌的细胞侵袭。结果 免疫组化结果显示,30例鼻咽癌组织中,ROCK1有18例阳性,12例阴性;而对照组中只有2例阳性,鼻咽癌组的ROCK1明显高表达,与对照组相比差异有统计学意义(χ² =19.20,P<0.000 1);Western Blot检测结果显示,6-10B组的ROCK1表达明显高于NP69细胞组;侵袭实验结果显示,未处理组为(171.67±17.89),明显高于10 μM组(120±19.07)和30 μM组(67.33±13.58),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 ROCK1基因与鼻咽癌的细胞侵袭有关。     

C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原的原核表达及免疫原性

 目的   原核表达C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitis B virus core antigen,HBcAg）〔HBcAg(aa 1-149）〕,并研究其在小鼠中的免疫原性。方法   用聚合酶链反应扩增C端截去34个氨基酸的HBcAg基因片段,构建含HBcAg（aa 1-149）基因的克隆质粒及表达质粒,在大肠杆菌Rossatta2中以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白的表达。表达产物经Ni²⁺亲和层析柱纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质印迹法鉴定。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,用ELISA法检测血清抗-HBc水平。结果   重组原核表达质粒pET15b HBcAg(aa 1-149)经双酶切和SDS-PAGE鉴定证明构建正确。重组HBcAg（aa 1-149）在大肠杆菌中获得高效表达,表达形式主要为可溶性蛋白。蛋白质印迹法显示在预期位置（相对分子质量约17 000位置）出现特异性条带。纯化后的重组蛋白纯度较高（＞90%）,并可在小鼠中诱生较高水平的抗-HBc。结论   重组HBcAg（aa 1-149）在原核系统中获得成功表达,并可在小鼠中诱导抗体应答。     

Artemin在食管癌中表达作用的研究

目的:探讨Artemin(ATRN)在食管癌中的表达及作用.方法:采用免疫组化和real-time PCR方法检测ATRN在食管癌组织126例、癌旁组织126例和正常组织21例中的表达水平;应用siRNA技术在食管癌TE11细胞系中研究ATRN表达及对肿瘤细胞的凋亡影响.结果:126例食管癌中ATRN的阳性表达率为73.81%(93/126),癌旁组织的阳性表达率为44.44%(56/126);21例正常食管组织中的ATRN阳性表达率为14.29%(3/21),正常食管组织与食管癌组织及癌旁组织比较差异均有统计学意义(x2分别为32.89、23.15.均P＜0.01);TE11-siRNA细胞系ATRN的mRNA和蛋白表达水平均低于TE11-CK细胞系中相应的表达水平.siRNA抑制食管癌细胞中ATRN的表达后,促进了TE11细胞的凋亡.结论:ATRN与食管癌的生物学行为有关.     

膀胱不同细胞系中CDC25B蛋白表达及意义

目的探讨膀胱癌不同细胞系中CDC25B蛋白表达及意义。方法采用蛋白印迹法检测CDC25B蛋白在膀胱永生化细胞SV-HUC-1细胞系和膀胱癌BIU-87和T24细胞系中的表达。结果 T24细胞中CDC25B蛋白表达水平高于BIU-87细胞和SV-HUC-1细胞系中的表达水平(P<0.05);且BIU-87细胞中CDC25B蛋白表达水平高于SV-HUC-1细胞中的表达水平(P<0.05)。结论 CDC25B可能成为评价肿瘤恶性程度的新指标。     

汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中的克隆及表达

目的：在大肠埃希菌中克隆和表达汉坦病毒SEO型及HTN型S基因。方法：PCR扩增汉坦病毒SEO型L99株及HTN型Z10株S基因读码区，前者经EcoRI及XhoI双酶切，后者经SacI及XhoI双酶切，将两者定向克隆入pET32a（＋），转入感受态E．coli Top10。获取重组质粒，经PCR、双酶切及序列分析鉴定后，转入E．coli BL21感受态。经IFTG诱导表达，其产物经SDS-PAGE和Western-blot检测。结果：SEO型L99株及HTN型Z10株S基因正确克隆于pET32a（＋），目的蛋白的分子质量约为67．1ku，表达量占菌体总蛋白的40％以上，Western-blot有特异性条带。结论：SEO型及HTN型汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中获得表达，为其后的应用奠定了基础。     

大肠癌组织Survivin基因表达与细胞凋亡的相关性研究

目的：检测大肠癌组织中Survivin基因的表达及凋亡指数,探讨二者的相关性及其临床意义。方法：采用分子信标荧光探针实时定量PCR法,检测49例大肠癌和14例大肠正常组织中Survivin基因mRNA模板拷贝数,TUNEL法检测凋亡细胞,计算凋亡指数（AI）。结果：肿瘤组织与正常组织比较Survivin基因模板拷贝数和AI差异均有统计学意义;肿瘤组织中mRNA拷贝数与肿瘤部位、性别、年龄和Dukes分期无关,与淋巴结转移和病理类型有关;结肠组AI显著高于直肠组;肿瘤组织中Survivin基因表达阴性组AI显著高于阳性组。结论：Survivin基因在肠癌组织中高表达,可成为预测淋巴结转移的参考指标。     

人nanog-delta48基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:构建pcDNA5/FRT-nanog-delta48真核表达载体,检测其在肝癌SMMC-7721细胞中的表达。方法:通过RT-PCR的方法克隆nanog基因的选择性剪接变异体nanog-delta48全长编码序列,连接入pMD18-T载体,经鉴定正确后亚克隆入pcDNA5/FRT,构建pcDNA5/FRT-nanog-delta48真核表达载体,测序无误后经脂质体介导转染到SMMC-7721细胞中,通过RT-PCR初步鉴定其在SMMC-7721细胞中的表达,并通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测转染前后的细胞增殖活力。结果:成功克隆nanog-delta48基因全长编码区,测序证明pcDNA5/FRT-nanog-delta48重组真核表达载体构建成功,使其在SMMC-7721细胞中过表达,MTT检测nanog-delta48转染入SMMC-7721细胞后,增殖能力增强。结论:剪接变异体nanog-delta48基因可能具有与nanog基因类似的活性。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达

目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子 1(hIGF 1) ,构建hIGF 1原核表达载体 ,并进行表达与纯化。方法以pUCIGF质粒为模板 ,PCR扩增了hIGF 1基因。经适当酶切后 ,构建表达载体pRSET IGF ,转入大肠杆菌BL2 1(DE3)进行表达 ,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化。结果带有重组质粒pRSET IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,以可溶性形式表达 7.8kD大小的蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白量的10 %～ 2 0 % ,纯化后目的蛋白纯度达 95 %以上 ,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF 1抗原活性。结论构建了pRSET IGF重组质粒 ,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达 ,为获得大量基因工程产品奠定了基础     

48例非小细胞肺癌MDR1及MRP基因表达结果分析

目的：探讨多药耐药（MDR1）基因,多药耐药相关蛋白（MRP）基因在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达情况及其与组织类型的关系。方法：用逆转录多聚酶链反应（RT－PCR）方法检测新鲜肺癌组织标本。结果：48例NSCLC标本MDR1,MRP基因阳性表达率分别为62．5％,66．7％,二种基因共同表达率为43．8％,肺鳞癌MRP基因表达明显高于腺癌（P＜0．01）,而鳞癌与腺癌之间MDR1基因表达无显著性差异（P＞0．05）,结论：MDR1,MRP基因可以共同或分别存在于肺癌组织中,肺鳞癌MRP基因表达率较腺癌高。     

大肠杆菌偏嗜性人胰岛素样生长因子1基因的克隆及表达

目的：提高以大肠杆菌为工程菌制备重组人胰岛素样生长因子1（rhIGF-1）的产率。方法：依据大肠杆菌遗传密码子使用频率表，人工合成3条DNA单链，PCR拼接扩增出适于在大肠杆菌中表达的人IGF-1基因。将此基因克隆入pGEM-T载体进行DNA序列分析后亚克隆入表达载体pBV220，诱导表达，表达产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定，酶联免疫分析（ELISA）检测表达产物中rhIGF-1的含量。结果：经基因改造后．rhIGF-1主要以包涵体的形式存在于碎菌后的沉淀中，其产率较改造前提高近4倍。结论：所构建的大肠杆菌偏嗜性人IGF-1基因可显著提高rhIGF-1的产率。     

sMICA基因的克隆表达及其纯化

目的构建重组MICA原核表达载体并探讨MICA对NK细胞毒效应的影响。方法经RT-PCR从Hela细胞获取MICA基因,经适当酶切后构建表达载体pBV220-MICA,转入大肠杆菌DH5α进行表达。重组MICA蛋白经纯化后与NK92细胞孵育观察对NK细胞毒效应的影响。结果带有重组质粒pBV220-MICA的大肠杆菌经热诱导后,以可溶性形式表达重组MICA蛋白,纯化后的重组MICA蛋白纯度为95%。经重组MICA处理的NK92细胞对MICA表达阳性的肿瘤细胞的杀伤作用明显降低。结论构建了pBV220-MICA重组质粒,并在大肠杆菌中获得可溶性表达,为研究MICA与NK细胞受体的相互作用机制奠定了基础。     

Survivin基因在大肠癌中的表达及与端粒酶活性的关系

目的：探讨survivin基因在大肠癌中的表达及与端粒酶活性的关系。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)和端区重复扩增法酶联免疫吸附测定(TRAP—ELISA)方法检测大肠癌及其癌旁组织survivin mR—NA表达和端粒酶活性情况。结果：(1)65％大肠癌组织表达survivin mRNA，而癌旁组织25％表达。Survivin基因表达与肿瘤大小、侵袭深度、淋巴结转移及分化程度无明显关系。(2)大肠癌组织端粒酶活性阳性率为90％，明显高于癌旁组织的5％，端粒酶表达阳性与大肠癌淋巴结转移、分化不良程度显著相关。(3)Survivin mRNA表达与端粒酶活性明显相关。结论：Survivin基因在大肠癌发生发展中可能起作用。端粒酶可作为诊断大肠癌的标志物。Survivin表达上调和端粒酶激活可能通过各自不同的信号途径在大肠癌变中发挥协同作用。     

P16（CDKN2）,RB在喉癌组织中的表达

为探讨抑癌基因Ｐ１６及其相关基因ＲＢ在喉癌组织中表达的意义和其相互关系，应用免疫组化分析方法（ＳＰ法）对５４例喉癌石腊标本中Ｐ１６、ＲＢ蛋白产物进行检测。结果发现：Ｐ１６、ＲＢ的表达缺失率分别为５１．８％、１６．７％，二者在喉癌中的表达呈负相关关系。Ｐ１６蛋白的表达随肿瘤恶性程度的提高而降低。提示：Ｐ１６蛋白在抑制喉癌的恶性进展中具有重要作用。由Ｐ１６、ＲＢ、ＣＹＣＬＩＮ Ｄ１及ＣＤＫ４、ＣＤＫ６