一种基于N基因的麻疹病毒实时荧光RT-PCR检测技术

目的引进一种以检测麻疹病毒N基因为目标的荧光RT-PCR技术并运用到新余市麻疹常规监测工作。方法新荧光RT-PCR与国产的荧光RT-PCR试剂盒、IgM抗体ELISA检测试剂盒分别对新余市2014年所采集麻疹疑似病例咽拭子、血清样本进行检测和结果分析。结果新荧光RT-PCR、国产的荧光RT-PCR试剂盒、ELISA试剂盒的检测阳性率分别为25.53%、23.4%、17.02%。与ELISA相比,RT-PCR具有更好的检测灵敏度,且两种荧光RT-PCR之间的总符合率达到97.87%。结论新引进的方法很敏感,适用于麻疹实验室监测以及疑似病例的快速诊断。     

麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒多重RT-PCR法的建立

摘要：目的：建立针对麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的多重RT-PCR 检测方法。 方法：分别根据麻疹病毒M基因、风疹病毒E基因和腮腺炎病毒M基因设计3 对引物,建立同时检测3种病毒的多重RT-CR,并评估其灵敏度和特异性。 结果：建立的多重RT-PCR可同时或分别扩增的3种病毒的111 bp、352 bp和274 bp基因片段,其灵敏度分别达到2.1、2.1、2.2 lg_{CCID 50}/mL;而与脊髓灰质炎病毒和乙型脑炎病毒无交叉反应。 结论: 建立的多重RT-PCR可用于麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的快速检测。     

实时荧光定量RT-PCR在麻疹和风疹病毒检测中的应用

目的探讨实时荧光定量RT-PCR在麻疹和风疹病毒检测中的应用。方法采用病毒分离、荧光定量PCR及ELISA法对临床标本进行检测。结果 20例临床标本病毒分离率为45%,DNA检测阳性率为100%,患者发病5 d内IgM抗体阳性率为65%、10~12 d内为100%。结论荧光定量PCR法适合用于疾病的早期诊断和鉴别诊断。     

HIV-1实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒的比较实验

目的比较及评价市场上主流的3个进口品牌(A-QIAGEN、B-Applied Biosystems、C-Promega) HIV-1病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒的特异性、灵敏度、稳定性及所需反应时间,确定3者中较优的试剂盒,为临床HIV-1病毒的核酸检测提供方法学参考。方法根据3个品牌试剂盒的说明书,对系列稀释的国内HIV-1 RNA标准品和确证的HIV阴性的标本进行相应的荧光定量RT-PCR平行检测分析,最后将荧光收集值(RFU)均设定为100,结合扩增曲线图、Ct值及相应的分析,比较它们的特异性、灵敏度、稳定性及所需反应时间。结果 3种试剂盒的特异性都是100%,但B-Applied Biosystems试剂盒在灵敏度(比A-QIAGEN、C-Promega试剂盒的检出Ct值提前0. 4-1. 5)、稳定性(特别是低浓度(HIV-1 RNA标本浓度为2. 31×102)时)及所需反应时间上均优于A-QIAGEN试剂盒和C-Promega试剂盒。结论不同厂家检测试剂盒的特异性、灵敏度等方面存在一定的差异,导致同样的标本检测的结果会有一定的偏差,甚至漏检。因此,进行临床检测前需要对这些检测试剂盒进行评估。     

实时荧光定量RT-PCR检测乳腺癌VEGF mRNA的表达

目的：建立实时荧光定量逆转录一多聚酶链反应（real—timequantitative,RT—PCR）检测乳腺癌患者肿瘤组织VEGFmRNA表达的方法,并验证其与免疫组织化学LsAB方法检测VEGF蛋白表达的相关性。方法：提取组织总RNA,逆转录成mRNA,采用实时荧光定量RT—PCR检测44例乳腺浸润性导管癌、25例癌旁正常小叶组织、13例乳腺良性疾病组织中VEGFmRNA表达;采用免疫组织化学LSAB法和彩色图像病理分析系统半定量检测其VEGF蛋白表达。结果：乳腺癌组织中VEGFmRNA表达水平显著高于癌旁和良性病组织（｜P〈0．001）,而后两者之间无明显差异（P〉0．05）;VEGF蛋白表达在癌组织,癌旁和良性病组中的分布特点与VEGFmRNA完全一致。结论;本研究所建立的用于检测人乳腺组织VEGFmRNA表达的实时荧光定量RT—PCR方法,是一种快速有效、灵敏度高、特异性好的定量检测方法,与免疫组化LSAB方法检测的VEGF蛋白表达具有良好相关性,在乳腺癌的早期诊断和良恶性鉴别诊断中具有重要的参考价值。     

一步法实时荧光RT-PCR在快速检测甲型流感病毒中的应用

目的建立一种能快速检测甲型流感病毒的一步法实时荧光PCR方法,对样本进行准确检测。方法以甲型流感病毒特异M基因的保守区为靶区域设计特异引物和TaqMan荧光探针,建立一步法实时荧光RT-PCR方法,并对乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒Long株、冠状病毒OC43及229E、副流感病毒1、2、3型以及季节性流感病毒H1、H3进行检测,验证该方法的特异性和灵敏度,并对临床样本进行检测应用。结果所建立的一步法实时荧光RT-PCR可对甲型流感病毒进行特异扩增,操作方便快速,对H1和H3亚型的最低检出限可达0.01TCID50/ml;对384例临床咽拭子样本的检测准确度达99.5%。结论本研究建立的一步法实时荧光RT-PCR方法可实现对甲型流感病毒快速准确的检测,有助于对临床流感病例的快速诊断。     

实时荧光定量RT-PCR检测食管癌Survivin mRNA的表达

SurvivinmRNA是近年来发现的一种新的凋亡抑制因子,属于凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins,IAP)家族的新成员,具有抑制细胞凋亡和调节细胞增殖的双重作用[1]。Survivin选择性地表达于胚胎组织和人类大多数肿瘤组织,而在正常人终末分化组织中不表达[2,3]。对Survivin的     

实时荧光依赖解旋酶恒温扩增技术和实时荧光RT-PCR在手足口病中的应用价值

目的研究实时荧光依赖解旋酶恒温扩增技术和实时荧光RT-PCR在手足口病中的应用价值。方法回顾性分析106例疑似手足口病患儿的临床资料。所有患儿均进行实时荧光RT-PCR检测、实时荧光依赖解旋酶恒温扩增技术检测,以临床表现、实验室检查、血清和病原学的综合诊断结果为临床诊断金标准,比较不同检测方法的诊断结果及效能。结果实时荧光依赖解旋酶恒温扩增技术检测EV通用型、EV71、CoxA16的窗口期及平均用时均短于实时荧光RT-PCR检测,诊断效能均优于实时荧光RT-PCR检测,阳性综合诊断率高于实时荧光RT-PCR检测(P<0.05)。结论实时荧光依赖解旋酶恒温扩增技术在检测手足口病中具有快速、高效、诊断效能高等优势,临床推广应用价值高。     

Simultaneous and rapid detection method for measles and rubella using single-tube multiplex real-time quantitative RT-PCR

Patients with measles or rubella infections manifest acute onset fever accompanying systemic exanthema, which are clinically difficult to be distinguish. Rapid diagnosis and differentiation of such epidemic viral diseases is essential to prevent outbreaks. We developed a single-tube multiplex real-time PCR assay for these indistinguishable viruses. We used previously-reported primer settings, with a slight modification of reporter dye, and applied to multiplex Taqman real-time PCR by cobas z480 (Roche Molecular Systems, Inc.). Consequently, the assay could detect 10 copies/10 μl of measles and rubella with coefficient of variations of 11.2% and 21.8%, respectively. Strengths of our methodology include simplicity of operation, short measurement time (2 h), uses of internal control (confirming a run of PCR), and quantitative measurement with high sensitivity. Both measles and rubella currently cause social outbreaks in Japan. We hope that our single-tube multiplex assay contributes to an early diagnosis, leading to an appropriate infection control measure and prevention of epidemics.     

Clinical validation of a new triplex real-time polymerase chain reaction assay for the detection and discrimination of Herpes simplex virus types 1 and 2

A new triplex real-time polymerase chain reaction (PCR) assay for Herpes simplex virus (HSV) (artus HSV-1/2 TM PCR kit, QIAGEN) was evaluated. This assay simultaneously uses three differently labeled probes targeted to HSV-1 (FAM), HSV-2 (NED), and to the manufacturer's Internal Control (VIC). HSV-1/2 typing capability and quantitation accuracy were determined using HSV stocks and quality control panels. Performance in routine clinical testing was compared with a nested HSV-1/2 PCR assay. Dilution series and quality control panel testing revealed an approximately 10-fold higher HSV-2 sensitivity in real-time PCR compared with an in-house nested PCR assay. The sensitivity for HSV-1 was comparable in both assays. All HSV-positive proficiency panel samples (n = 21) and virus stocks were typed correctly as HSV-1 or HSV-2 using real-time PCR. Quantitation correlated well with reference values (HSV-1, r = 0.98; HSV-2, r = 0.88), and 95% detection limits were determined as 9.4 HSV-2 copies/reaction and 18 HSV-1 copies/reaction. Based on C(t) values, the mean intra-assay coefficient of variation was 1%, whereas the interassay coefficient of variations were 2.7% and 2.5% for HSV-1 and -2, respectively. Testing of 309 clinical samples resulted in 100% specificity and 97% sensitivity. In conclusion, the artus HSV-1/2 TM PCR kit represents an excellent tool for the detection and differentiation of HSV-1 and -2 in clinical samples.     

TaqMan实时定量RT—PCR与常规RT—PCR检测登革病毒的比较

目的:比较TaqMan实时定量逆转录-聚合酶链反应(real-timeRT-PCR)法与常规逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测登革病毒的敏感性、特异性和时效性。方法:建立TaqMan实时定量RT-PCR方法和常规RT-PCR方法,分别对登革病毒、乙型脑炎病毒及西尼罗病毒进行检测,并比较两法的特异性、敏感性和时效性。结果:两种方法都能检测出登革病毒,而对乙型脑炎病毒和西尼罗病毒的检测呈阴性;常规RT-PCR的敏感性为0.1TCID50/mL,TaqMan实时定量RT-PCR的敏感性提高了100倍,达到了0.001TCID50/mL,且至少节约了2h。结论:与常规RT-PCR比较,TaqMan实时定量RT-PCR更适用于登革病毒的实验室快速诊断。