胞苷磷酸激酶基因的克隆与原核表达

目的:克隆胞苷磷酸激酶(CMPK)基因,构建携带CMPK基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组CMPK融合蛋白,获得转基因工程菌.方法:利用PCR法扩增大肠杆菌基因组DNA,纯化的PCR产物链接至pMD18-T载体上,得到重组质粒pMD18-T-CMPK,转化E-coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;分别用BamH I和XhoI限制性内切酶双酶切重组质粒pMD18-TCMPK和pET28a(+)表达载体.连接后,转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定.用终浓度1 mmol/L的IPTG诱导一定时间(3、6h)后,取E.coli上清液做电泳分析.结果:所获CMPK基因全长为786 bp,编码含有262个氨基酸的蛋白,当A值为0.6～0.8时重组质粒经IPTG诱导3h后,相对分子质量约30000处出现目的蛋白条带,随着时间的延长,蛋白表达量增加不明显.结论:成功地克隆CMPK基因,表达了大肠杆菌BL21(DE3)重组CMPK融合蛋白,为胞苷磷酸激酶进一步开发和应用奠定基础.     

脂联素单链抗体基因的克隆及表达

目的 克隆人脂联素单链抗体基因并进行表达。方法提取分泌抗脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA,通过RT-PCR技术,扩增VH和VL,与质粒pUC19载体连接,形成克隆,并对其进行鉴定分析。结果抗体重、轻链可变区扩增拼接后的重、轻链各约为340bp、350bp,基因全长约710bp,将拼接产物插入pUC19质粒中转化大肠杆菌JM109,得到数个克隆,经酶切分析约含710bp片段,与拼接结果基本相同,经测定特异性较好,与其他杂蛋白及载脂蛋白没有交叉反应。结论抗人脂联素单链抗体基因的克隆和表达较为成功。     

人TIMP-2基因的克隆及其原核表达

目的 构建人TIMP-2重组表达载体,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达.方法 提取人肝癌细胞(Hep G2)总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,插入克隆载体pMD18-T;酶切鉴定和测序后将TIMP-2导入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-TIMP-2.将重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21 (DE3)中,IPTG诱导融合蛋白表达后用SDS-PAGE电泳检测并用western blot验证(蛋白质印迹法).结果 成功构建原核重组表达载体pGEX-TIMP-2,并在原核宿主BL21中大量表达融合蛋白GST-TIMP-2.结论 克隆人TIMP-2基因并在原核生物中大量表达.     

舟山眼镜蛇毒细胞毒素的克隆及原核表达

目的构建舟山眼镜蛇毒细胞毒素（Cytotoxin,CTX）原核表达载体（pET42α（＋）-CTX）,并在大肠杆菌中表达CTX重组蛋白。方法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素（CTX）,测定N-末端氨基酸序列并据此设计引物,以提取的舟山眼镜蛇毒腺总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增细胞毒素基因序列（CTXcDNA）。将CTXcDNA定向克隆到原核表达载体pET42α（＋）中,双酶切图谱、PCR和DNA测序鉴定,转化宿主菌E.coliBL21（DE3）,异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导,SDS-PAGE凝胶电泳分析表达产物,GSTrap FF亲和层析纯化融合蛋白CTX;Western-blotting鉴定。结果成功合成CTXcDNA,并构建原核表达质粒pET42α（＋）/GST-CTX,在大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中表达融合蛋白CTX,SDS-PAGE凝胶浓度扫描显示表达量占菌体总蛋白的28.9%,Western-blotting证实纯化蛋白为重组CTX融合蛋白（rCTX）。结论成功构建CTX基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,获得rCTX具有眼镜蛇毒CTX的抗原性。     

抑肽酶基因的克隆和表达

抑肽酶作为天然的非特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂，临床用途广泛。为实现抑肽酶的大量制备，按大肠杆菌惯用密码子用人工方法合成抑肽酶结构基因，克隆于PUC18的EcoRⅠ和PstⅠ位点，转入Top10大肠杆菌（recA)中，经测序证明序列正确，表达体系模拟抑肽酶的体内成熟过程，将其自身的13肽pro序列融合于抑肽酶的N端，并在其间插入胰蛋白酶识别位点，该融合蛋白在使用PET-11C载体表达时，产物以包涵体形式存在于大肠杆菌中，表达量占菌体总蛋白的30%以上，复性实验证明：该肽段不影响抑肽酶的正确折叠，还能帮助抑肽酶包涵体进行体外折叠。提高复性得率，复性后使用胰蛋白酶切割融合蛋白，可得天然构象的活性抑肽酶。     

人胰岛素样生长因子I基因的半合成及其克隆表达

将人胰岛素样生长因子 Ⅰ（ＩＧＦ－ Ｉ）基因克隆到 ｐＥＴ１１Ｃ中,构建成 ｐＥＴＩＧＦ－ Ｉ表达载体,完成人ＩＧＦ－Ｉ基因在大肠杆菌中的高表达。方法：利用固相亚磷酸三酯法化学合成人ＩＧＦ－Ｉ基因的２条寡核苷酸片段,通过互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平成完整的ＩＧＦ－Ｉ双链ＤＮＡ片段,然后经酶切克隆于ｐＴＶ１１８Ｎ载体中,构建ｐＴＶＩＧＦ－Ｉ克隆载体并测定ＤＮＡ序列后,构建ＰＥＴＩＧＦ－Ｉ表达载体。结果：合成的人ＩＧＦ－Ｉ基因经测序证明与设计的一致,人 ＩＧＦ－ Ｉ基因在大肠杆菌中表达量高于 １０％。结论：选用大肠杆菌偏性密码子,小分子的人 ＩＧＦ－ Ｉ在大肠杆菌中可实现高表达     

酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因的克隆及表达

目的酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)丙酮酸脱羧酶 (PDC)基因的克隆和表达。方法利用PCR技术从酿酒酵母的总cDNA中钓取出PDCsc基因 ,构建其高效表达质粒 ,利用Ion和ompT蛋白酶缺陷株EscherichiacoliBL2 1 (DE3)进行表达。结果扩增出长约 1 7kb的PDCsc基因 ,成功构建其表达质粒pSC -2 2b ,对转化菌株的SDS -PAGE分析结果显示 :该基因获得高效表达 ,表达蛋白占细胞总蛋白的 1 8 6 %。结论成功构建高效表达PDCsc基因的工程菌株 ,为实现利用PDCsc进行的生物转化奠定基础     

人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的半合成及其克隆表达

目的 将人胰岛素样样生长因子Ⅰ（ＩＧＦ－Ⅰ）基因克隆到ｐＥＴ１１Ｃ中，构建成ｐＥＴＩＧＦ－Ⅰ表达载体，完成人ＩＧＦ－Ⅰ基因大在大肠杆菌中的表达。方法 利用固相亚磷酸三酯法化学合成人ＩＧＦ－Ⅰ基因的２条寡核苷酸片段，通过互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平成完整的ＩＧＦ－Ⅰ双链ＤＮＡ片段，然后经酶切克隆于ｐＴＶ１１８Ｎ载体中，构建ｐＴＶＩＧＦ－Ⅰ克隆载体并测定ＤＮＡ序列后，构建ｐＥＴＩＧＦ－Ⅰ表达载体。结     

小鼠β-防御素3的原核表达、表达条件优化及其抗菌活性

目的 运用基因工程方法获得重组小鼠β-防御素3(MBD3),优化表达条件,并研究其抗菌活性.方法 通过反转录PCR方法从小鼠肺组织中扩增Mbd3基因,构建其原核表达质粒,将该质粒转入大肠埃希菌表达菌株Rosetta-gami(2).优化融合蛋白的表达条件.通过亲和层析、凝血酶酶切、超滤浓缩得到MBD3的重组成熟肽(rMBD3),并采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和Western blot鉴定其正确性.采用微量液体抗菌实验检测rMBD3对多种常见病原性细菌和真菌的抗菌活性.结果 获得表达MBD3融合蛋白(fMBD3)的工程菌,fMBD3的表达量可达菌体总蛋白的62.9％,可溶性fMBD3约为1.15 g/L.纯化的rMBD3对单细胞真菌和革兰阳性菌显示出较好的抑菌活性.结论 rMBD3具有一定的抗菌活性,为进一步研究该多肽的其他生物学活性及其应用提供参考依据.     

金针菇免疫调节蛋白基因表达及活性初步研究

目的对金针菇免疫调节蛋白(fungal immunomodulatory protein fromflammulina velutipes,FIP-fve)基因进行原核表达及活性测定。方法通过RT-PCR得到FIP-fve,构建pUC19-FIP-fve,和表达质粒pET30-FIP-fve,转化大肠杆菌DE3(BL21),经IPTG诱导,表达产物纯化后进行活性试验。结果该基因在DE3(BL21)中获得了大量表达。表达产物能促进巨噬细胞吞噬功能(P<0.01)、明显增加小鼠血清中IFN-γ的含量(P<0.01)及抑制小鼠移植性S180肉瘤的生长,其抑瘤率分别为31.84%(P<0.05)和36.04%(P<0.05)。结论表达蛋白具有活性,这对于将其开发为免疫调节、抗过敏、抗肿瘤新药具有重要意义。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达

目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子 1(hIGF 1) ,构建hIGF 1原核表达载体 ,并进行表达与纯化。方法以pUCIGF质粒为模板 ,PCR扩增了hIGF 1基因。经适当酶切后 ,构建表达载体pRSET IGF ,转入大肠杆菌BL2 1(DE3)进行表达 ,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化。结果带有重组质粒pRSET IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,以可溶性形式表达 7.8kD大小的蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白量的10 %～ 2 0 % ,纯化后目的蛋白纯度达 95 %以上 ,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF 1抗原活性。结论构建了pRSET IGF重组质粒 ,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达 ,为获得大量基因工程产品奠定了基础     

sMICA基因的克隆表达及其纯化

目的构建重组MICA原核表达载体并探讨MICA对NK细胞毒效应的影响。方法经RT-PCR从Hela细胞获取MICA基因,经适当酶切后构建表达载体pBV220-MICA,转入大肠杆菌DH5α进行表达。重组MICA蛋白经纯化后与NK92细胞孵育观察对NK细胞毒效应的影响。结果带有重组质粒pBV220-MICA的大肠杆菌经热诱导后,以可溶性形式表达重组MICA蛋白,纯化后的重组MICA蛋白纯度为95%。经重组MICA处理的NK92细胞对MICA表达阳性的肿瘤细胞的杀伤作用明显降低。结论构建了pBV220-MICA重组质粒,并在大肠杆菌中获得可溶性表达,为研究MICA与NK细胞受体的相互作用机制奠定了基础。     

人过氧化氢酶基因的克隆与表达

目的利用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达人过氧化氢酶(catalase,CAT)。方法从人cDNA文库中获得CAT编码基因,并利用pMAL-c2x、pBV221质粒分别构建了融合和非融合表达载体并进行了表达和活性检测。结果融合表达与非融合表达均可获得可溶性蛋白质,非融合的表达产物具有CAT活性,而融合表达产物在切除融合蛋白质(MBP)部分后表现出明显的CAT活性。结论从大肠杆菌表达体系能表达具有生物活性的CAT,此项研究为后续重组酶性质的研究和开发利用奠定了基础。     

汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中的克隆及表达

目的：在大肠埃希菌中克隆和表达汉坦病毒SEO型及HTN型S基因。方法：PCR扩增汉坦病毒SEO型L99株及HTN型Z10株S基因读码区，前者经EcoRI及XhoI双酶切，后者经SacI及XhoI双酶切，将两者定向克隆入pET32a（＋），转入感受态E．coli Top10。获取重组质粒，经PCR、双酶切及序列分析鉴定后，转入E．coli BL21感受态。经IFTG诱导表达，其产物经SDS-PAGE和Western-blot检测。结果：SEO型L99株及HTN型Z10株S基因正确克隆于pET32a（＋），目的蛋白的分子质量约为67．1ku，表达量占菌体总蛋白的40％以上，Western-blot有特异性条带。结论：SEO型及HTN型汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中获得表达，为其后的应用奠定了基础。     

人肿瘤抑素(tumstatin)的基因克隆及其原核表达

目的克隆人肿瘤抑素(tumstatin)基因,并进行其在大肠杆菌表达的研究。方法用RT-PCR技术从人肾癌旁组织中扩增出肿瘤抑素的cDNA,构建原核表达载体pQE-tum,IPTG诱导重组蛋白质的表达,并利用Ni-NTAHis-Bind树脂纯化该重组蛋白质。结果经PCR扩增成功获得742 bp的人肿瘤抑素基因,测序正确。在大肠杆菌中目的蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的10%,SDS-PAGE及Western blot分析显示,其相对分子质量为28 000,纯化后的6×His-tumstatin纯度可达92%。结论tumstatin基因克隆、表达及纯化的成功,为其今后的肿瘤抗血管生成治疗研究奠定了基础。     

大肠杆菌偏嗜性人胰岛素样生长因子1基因的克隆及表达

目的：提高以大肠杆菌为工程菌制备重组人胰岛素样生长因子1（rhIGF-1）的产率。方法：依据大肠杆菌遗传密码子使用频率表，人工合成3条DNA单链，PCR拼接扩增出适于在大肠杆菌中表达的人IGF-1基因。将此基因克隆入pGEM-T载体进行DNA序列分析后亚克隆入表达载体pBV220，诱导表达，表达产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定，酶联免疫分析（ELISA）检测表达产物中rhIGF-1的含量。结果：经基因改造后．rhIGF-1主要以包涵体的形式存在于碎菌后的沉淀中，其产率较改造前提高近4倍。结论：所构建的大肠杆菌偏嗜性人IGF-1基因可显著提高rhIGF-1的产率。     

来源于豆豉的纳豆激酶基因在大肠杆菌中活性表达研究

目的构建大肠杆菌表达质粒pTYB10 2 ,实现纳豆激酶基因 (nattokinasegene)在大肠杆菌中高活性表达。方法以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板 ,采用PCR方法分别扩增编码前肽、成熟肽的序列 (pro NK) ,构建大肠杆菌表达质粒pTYB10 2 ,转化大肠杆菌ER2 5 6 6。在IPTG诱导下 ,分别在 37℃ (2h)、30℃ (3h)和 15℃ (14h)培养。结果pTYB10 2能表达有活性的纳豆激酶。SDS PAGE表明 ,15℃表达杂蛋白质更少。结论证明具有 77个氨基酸序列的前肽 (pro序列 )对纳豆激酶的活性表达是必不可少的。     

欧文氏菌SCB125中2—酮醛糖酸还原酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

根据酶活测定PAGE活性染色初步证明欧文氏菌SCB125中存在酶活较高的2－酮醛糖酸还原酶（2－KR）,能够以2,5－二酮－D－葡萄糖酸（1）、2－酮－L－古洛糖酸（2）古洛糖酸（2）或者2－酮－D－葡萄糖酸（3）为底物。抽提欧文氏菌染色体DNA为模板,利用PCR技术扩增,克隆得到两个2－KR酶基因(tkrA和tkrB)通过酶切和测序证明：2－KR A基因发生多处突变,而－KR B基因保守,将含有这两个基因的片段分别连接到表达载体PBL并转化大肠杆菌DH5α后,均获得高酶活表达,如果进一步用基因锡除的方法破坏欧文氏菌染色体上野生型2－KR基因,可以获得一个表达1还原酶的理想宿主,为实现从葡萄糖一步发酵生产维生素C前体2打下基础。