恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 了解恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）谷氨酸脱氢酶（GDH）基因全编码区核苷酸序列变异情况。方法 PCR扩增恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH基因全编码区,产物经EcoRI SalI酶切后,定向克隆至pGEX-4T-1质粒,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序,与其它生物GDH进行同源性分析。结果 成功扩增了恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH编码基因,大小为1410bp,无内含子,与Thailand株GDH基因相比,两有2个碱基不同,推导的氨基酸序列完全相同;与蓝氏贾第鞭毛虫,克鲁氏锥虫和梭状芽孢杆菌GDH的同源性分别为57.90%(260/449),56.51%(243/430),42.05%(164/390);与人的GDH-1,GDH-2的同源性分别为29.02%（101/348）,28.73%(100/348)。结论 FCC1/HN株与Thailand株GDH高度同源,疟原虫GDH明显不同于其它生物GDH。     

Sequence determination of exp- 1 Gene of Plasmodium Falciparum Isolate FCC1／HN

目的 测定恶性疟原虫FCCl／HN株exp-1基因序列。方法 根据exp-1基因已知序列设计合成1对引物，用PCR技术从FCCl／HN株基因组DNA中扩增exp-1基因；将exp-1基因克隆入pMD-18T载体，转化大肠杆菌JMl09感受态细胞，铺x—gal LB平板；挑取阳性菌落，用酶切，PCR扩增进行鉴定。以正确的重组质粒为模板，用双脱氧链末端终止法测定exp-1基因序列。结果 从恶性疟原虫FCCl／HN株基因组DNA中获取exp-1基因，成功克隆入pMD-18T载体；测序表明FCCl／HN株exp-1基因全长937bp，编码162个氨基酸。结论 克隆了恶性疟原虫FCCl／HN株exp-1基因，并测定了其核苷酸序列，为进-步研究其功能奠定基础。     

间日疟原虫部分乳酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的克隆并测定我国间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)的部分基因序列并进行生物信息学分析。方法根据PvLDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从间日疟原虫基因组DNA中扩增LDH基因,定向克隆入pMD18质粒。阳性质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用生物信息学网站www.ncbi.nlm.nih.gov、www.expasy.ch对获得的基因及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到特异的间日疟原虫LDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒。测序结果表明,获得的间日疟原虫LDH基因全长897bp,编码299个氨基酸。DNAMAN预测PvLDH存在10个潜在抗原表位,均与PfLDH的相应预测表位间有同源序列。同源性分析显示,我国间日疟原虫与SalvadorⅠ株和Belem株间日疟原虫的氨基酸序列同源性为99%,与其它疟原虫LDH的同源性为88%～90%。结论成功克隆了我国间日疟原虫LDH基因,其基因序列与其它疟原虫LDH基因序列有高度同源性。     

恶性疟原虫海南株节结相关组氨酸富集蛋白基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）节结相关组氨酸富集蛋白（KAHRP）基因，并进行序列分析。方法 采用PCR技术分两段从FCC1／HN株基因组A趸扩增出部分序列重叠的KAHRP基因片段，分别克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定这2个片段的序列，从而得到全长KAHRP基因序列。应用AnthProt、DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果 恶性疟原虫FC1/HN KAHRP全基因长2358个核苷酸，在112至564位核苷酸是内含子，全基因编码634个氨基酸残基，其中赖氨酸含量为14．35％，丙氨酸含量为9．15％，组氨酸含量为7．72％；分子量为69．37kDa。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、FCR3、India-1、India-2、NF17、Palo-alto,PUPSP株KAHRP基因编码的氨基酸残残留基有52个氨基酸残基替代位点，并存在氨基酸残基序列的增加和缺失。经多参数综合分析，可能有5个潜在的抗原表位区。结论 克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株KAHRP基因。序列测定及同源性分析表明，FCC1／HN株与其它分离株KAHRP基因编码的氨基酸序列存在一定差异。     

恶性疟原虫海南、云南、安徽株裂殖子表面抗原MSA2基因的克隆和序列分析

应用ＰＣＲ技术扩增并克隆了恶性疟原虫海南、云南、安徽三个地理株的ＭＳＡ２基因，测定并分析了全基因序列。结果表明，海南、云南、安徽株ＭＳＡ２基因序列完全相同，全长为７９５ｂｐ，编码２６４个氨基酸，与ＦＣＱ－２７／ＰＮＧ株ＭＳＡ２高度同源。对抗原表位进行多参数综合分析表明，我国虫株除具有国外已确定的抗原表位ＳＴＮＳ、ＤＴＰＴＡＴＥ外，在第５３—７２位氢基酸间可能具有一个新的抗原表位。     

恶性疟原虫海南、云南、安徽株裂殖子表面抗原MSA1第二区基因的克隆和序列分析

应用ＰＣＲ技术扩增并克隆恶性疟原虫海南、云南、安徽３个地理株ＭＳＡ１第二区基因，测定并分析其基因序列。结果表明，海南、云南、安徽株扩增片段长度为４２３ｂｐ，基因序列完全相同，我国虫株ＭＳＡ１与ＷＥＬＬＣＯＭＥ株最为相似，存在ＭＡＤ和Ｋ１两种等位基因型的基因内重组现象。     

恶性疟原虫海南、云南、安徽株裂殖子表面抗原MSA1第二区基因的克隆和序列分析

本文应用ＰＣＲ技术扩增并克隆了恶性疟原虫海南、云南、安徽三个地理株ＭＳＡ１第二区基因，测定并分析了基因序列。结果表明，海南、云南、安徽株扩增片段长度为４２３ｂｐ，基因序列完全相同，我国虫株ＭＳＡ１与ＷＥＬＬＣＯＭＥ株最为相似，存在ＭＡＤ和Ｋ１两种等位基因型的基因内重组现象。     

恶性疟原虫Pf332基因片段的克隆及表达

[目的]构建含恶性疟原虫Pf332抗原基因片段的重组质粒，并检测在大肠杆菌BL21/DE3中的表达情况。[方法]应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNAS中扩增Pf332基因（Pf332)片段，P332-R0、P332-R2，并分别插入pGEX4T-1原核表达载体，阳性克隆的重组质粒DNA经酶切及PCR扩增鉴定，用DNAstar软件对FCC1/HN株与3D7株Pf332和P332-R1、P332-R2片段进行同源性比较，由IPTG诱导在大肠杆菌BL21/DE3中表达重组蛋白。[结果]PCR扩增得到特异的FCC1/HN株Pf332片段，P332-R0、P332-R1、P332-R2，大小分别为489，429和393bp。酶切及PCR鉴定获得了正确的pGEX-P332-R0,pGEX-P332-R1,pGEX-P332-R2重组质粒，序列分析结果显示，与3D7株相比，FCC1/HN株P332-R1、P332-R2片段编码多肽分别缺少2、4个相应的重复单元，在大肠杆菌BL21/DE3中表达出3个重组蛋白，相对分子质量分别为46、44和42。[结论]扩增、克隆了恶性疟原虫Pf332片段，P332-R0、P332-R1、P332-R2，并在大肠杆菌BL21/DE3中成功表达，FCCl/HN株与3D7株的P332-R1、P332-R2片段编码多肽所包含的重复单元数目不同。     

恶性疟原虫FCC1／HN株CSP基因表达产物免疫鼠体内抗原定位研究

目的：用恶性疟原虫FCC1／HN株CSP基因表达产物免疫小鼠，观察其在宿主体内各组织的抗原分布情况。方法：提取目的基因PfCSP在HeLa细胞中的表达产物，免疫注射BALB／c小鼠。取免疫后4周及7周小鼠心脏、肝脏、脑、脾及肌肉，通过免疫酶组织化学法及间接免疫荧光法检测组织内的抗原。结果：免疫7周后的BALB／c小鼠肝脏组织枯否氏细胞内及肝细胞膜上可见棕黄色特异性抗原－抗体反应，而免疫鼠心、脑、肌肉未出现明显的阳性反应。结论：恶性疟原虫FCC1／HN株CSP基因表达蛋白能被肝实质细胞特异性识别，其免疫后的抗原分布主要在肝脏。     

恶性疟原虫红内期p41-3基因真核表达重组质粒的构建及序列分析

[目的]构建恶性疟原虫海南(FCC1/HN)株p41-3基因真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3;测定p41-3基因序列,并了解FCC1/HN株与其它分离株p41-3序列的差异.[方法]根据p41-3基因已知序列设计合成2对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增p41-3基因;将p41-3基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;用酶切,PCR扩增鉴定筛选到的重组质粒阳性克隆.以正确的重组质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定p41-3基因序列,应用软件辅助分析p41-3序列及进行同源性比较.[结果]PCR扩增得到特异的FCC1/HN株p41-3基因;正确的pcD-NA3-p41-3重组质粒被筛选和鉴定.测序表明,FCC1/HN株p41-3基因大小为2 137 bp,编码375个氨基酸.恶性疟原虫FCC1/HN株与FCBR株p41-3基因核苷酸序列同性为98.98%,编码氨基酸序列同源性为99.73%.[结论]从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中获取p41-3基因,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,并测定了FCC1/HN株p41-3基因的序列;FCC1/HN株与其它分离株p41-3基因有高度的同源性.     

恶性疟原虫海南株线粒体复合体Ⅱ辅基铁-硫蛋白基因克隆及序列分析

目的：构建恶性疟原虫海南株线粒体复合体Ⅱ琥珀酸-泛醌还原酶辅基铁-硫蛋白(iron-sulfur protein,Ip)基因原核表达质粒pET28α-Ip，测定Ip基因序列，为研究铁-硫蛋白基因功能奠定基础。方法：采用PCR技术从恶性疟原虫海南株基因组DNA中扩增出Ip基因，扩增产物经纯化后，用BamHI XhoI双酶切，定向克隆入pET28α质粒，转化大肠杆菌DH5α，再用BamHI XhoI酶切及PCR扩增对重组子进行鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定，并进行同源性比较。结果：筛选出编码海南株Ip基因的原核表达质粒pET28α-Ip，海南株Ip基因序列与K1、3D7株高度同源。结论：pET28α-Ip重组质粒的构建，为进一步研究铁-硫蛋白基因奠定基础。     

恶性疟原虫MESA基因的克隆和测序

目的克隆、测定恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)成熟疟原虫感染红细胞表面抗原(MESA)基因序列，并进行序列分析。方法根据恶性疟原虫palo-alto株MESA基因已知序列，设计合成四对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出4个部分序列重叠的MESA基因片段，分别克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定这4个基因片段的序列，拼接得到全长MESA基因序列。应用DNAstar、AnthProt软件辅助进行序列同源性比较和抗原表位区预测。结果PCR扩增得到特异的恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因片段，酶切及PCR鉴定获得了包含MESA基因片段的重组质粒。测序结果表明，FCC1／HN株MESA全基因编码区长4102bp，A T含量为72．11％，G C含量为27．89％，有1个内含子；编码1323个氨基酸残基，分子量为154470u。序列分析表明，FCC1／HN株与Palo-aho、D10株MESA蛋白在长度和序列组成上呈多态性，序列差异较大区域位于MESA蛋白的氨基酸重复区1、3、4、5和7。经多参数综合分析，有7个潜在的抗原表位区。结论测定、分析了恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因序列。FCC1／HN株MESA基因与其它分离株的MESA基因编码的氨基酸序列存在一定差异。     

恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)EBA-175Ⅱ区F2结构域基因的克隆与表达

目的 构建EBA-175Ⅱ区F2结构域基因的原核表达载体。方法采用PCR的方法从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出EBA-175Ⅱ区F2结构域856～1848bp基因,定向克隆入PMD18-T质粒,再经BamHI和XhoI酶切亚克隆人高效表达载体pET23a( )。重组质粒经PCR、酶切、测序鉴定后,在BL21(DE3)菌株中进行IPTG诱导表达。结果重组质粒经序列测定证实插入基因为目的基因,符合表达框架,经IPTG诱导,在BL21(DE3)菌株中以非融合蛋白形式表达,SDS-PAGE电泳显示在约36．4kDa处可见明显蛋白增粗条带,与预期结果一致。结论成功构建了重组EBA～175Ⅱ区F2结构域基因表达载体,并在BL21(DE3)中有效表达。     

恶性疟原虫子孢子表面蛋白2基因的克隆与序列分析

目的：克隆恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)子孢子表面蛋白2(PfSSP2)基因，并进行序列分析。方法：根据PfSSP2基因已知序列设计合成一对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出PfSSP2基因，并克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测序，用DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN株PfSSP2基因序列，酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-PfSSP2重组质粒。测序表明，所克隆的PfSSP2基因大小为1680bp，编码559个氨基酸残基。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、DD2、FCR3、HB3A、K1、Thai814、Thai838、Thai842、Thai947及7G8株PfSSP2的氨基酸序列在33个位点存在氨基酸替代，1处氨基酸序列增加；各株间PfSSP2的氨基酸序列同源性都在95.7％以上。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株PfSSP2基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫不同分离株间有高度的同源性。     

恶性疟原虫核糖体小亚基rRNA部分基因片段的克隆及序列分析

目的了解我国恶性疟原虫云南地理株核糖体小亚基rDNA的核苷酸序列。方法根据已知恶性疟原虫核糖体小亚基rDNA序列．在其基因的中下游分别设计引物,采用聚合酶链式反应（PCR）技术,从云南省来源的恶性疟体外培养原虫的基因组DNA中扩增出的基因片段酶切后将其插入pUC118／119载体,用Biosystems373ADNA序列分析仪测定。结果我国恶性疟原虫云南地理株核糖体小亚基rDNA核苷酸序列,与巴西IMTM22／7G8株的序列比较,在该基困的第1563位有一个A被T替换。结论该突变点位于真核生物核糖作小亚基rRNA基因已知序列种类的第三个可变区域内。