人参皂苷Rg1促进人牙周膜干细胞增殖与成骨分化

目的 观察人参皂苷Rg1对体外培养的人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)增殖和成骨分化的影响.方法 选取第3代PDLSCs,采用MTT法和细胞周期检测不同浓度(0.25、0.5、1、2、4μmol/L)人参皂苷Rg1对PDLSCs增殖的影响;采用碱性磷酸酶(ALP)活性、实时荧光定量RT-PCR和放免法检测人参皂苷Rg1对PDLSCs成骨分化的影响;采用ELISA方法检测人参皂苷Rg1对PDLSCs碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)表达的影响.结果 与对照组比较,浓度为0.5、1、2μmol/L的人参皂苷Rg1能明显提高PDLSCs的增殖能力(P＜0.05),其中浓度为1μmol/L的促增殖作用最强,S+G2/M期细胞百分率明显高于对照组(P＜0.05);浓度为1μmol/L的人参皂苷Rg1组ALP活性、骨钙素(osteocalcin,OCN)和bFGF的表达水平明显高于对照组(P＜0.05).结论 人参皂苷Rg1对体外培养的PDLSCs有促进增殖和成骨分化的作用.     

p38丝裂原活化蛋白激酶在炎症微环境作用下对牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在慢性牙周炎组织来源的牙周膜干细胞中的表达及其对炎症微环境作用下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响。方法 2012年10月至2013年5月收集中国人民解放军总医院口腔科因治疗需要拔除的无龋前磨牙及慢性牙周炎牙齿,培养正常及炎症微环境下的牙周膜干细胞(H-PDLSCs,P-PDLSCs)。采用酶联免疫吸附试验及实时定量PCR检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β的分泌及基因表达量,免疫荧光检测p38在细胞内的表达,Western blot法检测两种细胞成骨诱导7 d后p38及磷酸化p38(p-p38)的表达。使用p38 MAPK特异性抑制剂SB-203580干扰后体外成骨诱导7 d,实时定量PCR检测细胞成骨关键基因Runx2和碱性磷酸酶(ALP)的基因表达水平,成骨诱导21 d后茜素红染色检测PDLSCs的矿化结节形成情况。结果 P-PDLSCs的TNF-α和IL-1β分泌量均显著高于H-PDLSCs(68.80±6.70比34.10±3.07,P=0.001;57.10±4.23比26.90±2.58,P=0.000)。P-PDLSCs中TNF-α的基因表达水平较H-PDLSCs上升1.4倍(P=0.011),IL-1β的基因表达水平也上升1.7倍(P=0.009)。P-PDLSCs的p38表达量高于H-PDLSCs;成骨诱导后两种PDLSCs中的p-p38表达均升高,但p38表达水平有所降低。SB-203580干扰后PDLSCs的Runx2和ALP表达水平显著降低(H-PDLSCs:P=0.044、0.036;P-PDLSCs:P=0.017、0.004),矿化结节形成数量减少。结论在慢性炎症微环境中,p38 MAPK参与细胞的炎性反应,抑制p38后炎症微环境作用下PDLSCs的成骨分化能力也被显著抑制。     

p38 丝裂原活化蛋白激酶在炎症微环境作用下对牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的 探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在慢性牙周炎组织来源的牙周膜干细胞中的表达及其对炎症微环境作用下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响。方法 2012年10月至2013年5月收集中国人民解放军总医院口腔科因治疗需要拔除的无龋前磨牙及慢性牙周炎牙齿,培养正常及炎症微环境下的牙周膜干细胞(H-PDLSCs,P-PDLSCs)。采用酶联免疫吸附试验及实时定量PCR检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β的分泌及基因表达量,免疫荧光检测p38在细胞内的表达,Western blot法检测两种细胞成骨诱导7 d后p38及磷酸化p38(p-p38)的表达。使用p38 MAPK特异性抑制剂SB-203580干扰后体外成骨诱导7 d,实时定量PCR检测细胞成骨关键基因Runx2和碱性磷酸酶(ALP)的基因表达水平,成骨诱导21 d后茜素红染色检测PDLSCs的矿化结节形成情况。结果 P-PDLSCs的TNF-α和IL-1β分泌量均显著高于 H-PDLSCs(68.80±6.70比34.10±3.07,P=0.001;57.10±4.23比26.90±2.58,P=0.000)。P-PDLSCs中TNF-α的基因表达水平较H-PDLSCs上升1.4倍(P=0.011),IL-1β的基因表达水平也上升1.7倍(P=0.009)。P-PDLSCs的p38表达量高于H-PDLSCs;成骨诱导后两种PDLSCs 中的p-p38表达均升高,但p38表达水平有所降低。SB-203580干扰后PDLSCs 的Runx2和ALP表达水平显著降低(H-PDLSCs:P=0.044、0.036;P-PDLSCs:P=0.017、0.004),矿化结节形成数量减少。结论 在慢性炎症微环境中,p38 MAPK参与细胞的炎性反应,抑制p38后炎症微环境作用下PDLSCs的成骨分化能力也被显著抑制。     

不同浓度雌激素对人源性牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的：对比研究不同浓度的雌激素对人源性牙周膜干细胞成骨分化的影响。方法：采用DMEM完全培养基将人牙周膜干细胞制成单细胞悬液,分别加入浓度为0、10×10^-10、10×10^-9、10×10^-8、10×10^-7、10×10^-6、10×10^-5mol/L的雌激素,以未加入雌激素的成骨诱导液组（普通DMEM培养基中加入10mMβ-甘油磷酸钠、50μM维生素C及10nM地塞米松）作为阴性对照。培养后实时定量PCR方法分别检测成骨早中晚期关键指标Runx2、ALP和OCN mRNA表达。结果：浓度为10×10^-10、10×10^-9、10×10^-8、10×10^-7、10×10^-6、10×10^-5mol/L的雌激素对人源性的牙周膜干细胞培养均无毒性;不同浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）;在成骨诱导7、14、21天时,Runx2、ALP及OCN mRNA表达在10×10^-7组最高（P＜0.05~0.01）。在不同浓度雌激素组中成骨相关基因的表达均高于阴性对照组（P＜0.05）。结论：当雌激素浓度＜10×10^-7mol/L时,雌激素能够以剂量依赖的方式促进人牙周膜干细胞成骨分化过程中成骨相关基因的表达。当雌激素浓度＞10×10^-7mol/L时,雌激素浓度的增加并未促进成骨相关基因的表达。     

purmorphamine促进人牙周膜干细胞应力成骨

目的研究purmorphamine在动态张应力促人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,PDLSCs)向成骨细胞分化过程中的作用。方法分离培养鉴定PDLSCs,在矿化诱导环境中加入purmorphamine,采用Flexcell FX-4000T应力加载系统对细胞加力24 h,以Real-time PCR检测成骨相关指标Runx2、alkaline phosphatase(ALP)以及Hedgehog(Hh)通路的标志物GLI1、Pathed1(PTCH1)、Smoothend(SMO)。结果动态张应力作用24 h后,成骨相关指标Runx2、ALP,Hh通路的标志物GLI1、PTCH1、SMO的表达水平明显升高(P<0.05);加入purmorphamine后,成骨相关指标Runx2、ALP,Hh通路的标志物GLI1、PTCH1、SMO的表达水平较加力组均有增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 purmor-phamine可能通过激活Hh通路,进而增强人PDLSCs应力条件下向成骨细胞分化。     

miR-17在炎症状态下的人牙周膜干细胞成骨分化中的调控作用

慢性炎症,如风湿性关节炎、牙周炎等,是导致骨组织破坏的常见疾病。间充质干细胞,因具有多向分化及自我更新潜能,已成为骨再生的重要种子细胞。而慢性炎症微环境中,干细胞的特性将发生怎样的改变,以及其调控机制仍不清楚。microRNA（miRNA）是一类长约19～22个核苷酸的小分子非编码RNA,     

JNK通路在低频脉冲电磁场促进牙周膜干细胞成骨分化的作用研究

目的：通过JNK特异性抑制剂SP600125干预JNK信号通路,探究JNK通路是否参与低频脉冲电磁场(LPEMF)诱导人牙周膜干细胞(hPDLSCs)的成骨分化。方法：LPEMF(15HZ、0-3mT、1h/每隔12h)体外辐照hPDLSCs,通过 qRT-PCR检测细胞内Runt 相关转录因子 2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)等成骨相关基因表达量,来确定LPEMF诱导hPDLSCs成骨分化的能力、并筛选适宜的磁场作用强度;通过Western-blotting检测LPEMF刺激下胞内JNK蛋白和p-JNK蛋白的表达量,以及使用不同浓度SP600125抑制剂干预后细胞内成骨基因表达量的变化,来确定JNK通路在PEMF促进hPDLSCs成骨分化过程中是否发挥作用。结果：15Hz、2.5mT的LPEMF辐照hPDLSCs时,Runx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因表达量高于其他磁场强度分组(P ＜ 0.05);LPEMF刺激下明显促进了细胞内JNK蛋白和p-JNK蛋白表达量(P ＜ 0.05);JNK通路抑制后细胞内成骨相关基因表达量降低,且随着SP600125抑制剂浓度的升高对成骨基因表达的抑制效果更明显(P ＜ 0.05)结论：LPEMF物理刺激部分激活了hPDLSCs内JNK通路参与诱导成骨分化。     

BMPs-ERK5信号通路调控人牙周膜干细胞成骨分化的研究

目的 比较骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)2、7、9对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)成骨分化的诱导作用,探讨BMPs-ERK5信号通路在成骨分化中的作用.方法 首先采用组织块酶消化法分离培养原代hPDLSCs并鉴定,利用腺病毒载体介导的GFP、BMP2、BMP7和BMP9(Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9)分别感染hPDLSCs,通过早期成骨分化指标碱性磷酸酶活性定性和定量检测、茜素红染色检测晚期成骨分化指标钙盐结节沉积情况、qRT-PCR检测细胞成骨分化相关基因骨钙蛋白和骨桥蛋白mRNA表达,比较发现BMP9对细胞成骨分化的作用最强;采用Ad-BMP9感染hPDLSCs 24 h后,检测BMP9作用PDLSCs后对ERK5磷酸化水平的影响和ERK5信号通路特异性抑制剂BIX02189预处理后BMP9-ERK5通路对hPDLSCs成骨分化的影响.结果 ①分离培养的hPDLSCs为成纤维细胞样,呈漩涡状生长,抗波形蛋白表达阳性,抗角蛋白表达阴性,具有间充质属性和克隆形成能力.②BMP2、BMP7和BMP9均有促进细胞成骨分化作用,其中3组的碱性磷酸酶定量结果和成骨分化相关基因相对表达量与GFP组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05),且BMP9效力最强.③Western blot检测显示BMP9增强p-ERK5的表达.而抑制剂BIX02189呈剂量依赖性地抑制p-ERK5的表达.BIX02189预处理细胞后、感染Ad-BMP9的结果显示,BMP9对细胞的促成骨作用较未处理组明显降低,其中BMP9组的碱性磷酸酶定量分析结果与成骨分化相关基因相对表达量与BIX02189处理组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 BMP9具有较强的促hPDLSCs成骨分化作用,ERK5信号转导途径在BMP9诱导hPDLSCs成骨分化过程中发挥了正向调节作用.     

微环境下Wnt/β-catenin通路参与牙周膜干细胞骨向分化机制的研究进展

牙周膜干细胞作为牙周组织中的干细胞,具有分化成骨的能力,在牙槽骨修复过程中具有巨大的潜力.Wnt/β-catenin通路在身体发育中起重要作用.目前,已发现多种微环境可通过Wnt/β-catenin通路调节牙周膜干细胞的成骨分化.该文综述Wnt/β-catenin通路在不同微环境中调控牙周膜干细胞成骨分化的过程,为牙周...     

基因芯片筛选人牙周膜干细胞成骨分化生物学标记物的研究

目的：发现牙周膜干细胞（PDLSCs）骨向分化后显著高表达的环状RNA（circRNA）,探索circRNA在PDLSCs骨向分化中生物学标记物的作用。方法用酶消化法体外培养牙周膜细胞,通过免疫磁珠法分选出PDLSCs。用普通培养基和成骨诱导培养基分别培养PDLSCs 21 d,茜素红染色检测矿化结节的形成,RT－qPCR检测碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）和Runt相关转录因子2（Runx2）的表达。采用Arraystar公司的circRNA芯片检测PDLSCs骨向分化前后整体circRNAs的差异表达,将芯片中上调变化最显著的前10位circRNAs进行PCR引物设计,RT－qPCR检测circRNA的表达情况。结果 PDLSCs骨向诱导21 d后,茜素红染色阳性,有大量矿化结节形成,ALP、OCN和Runx2表达量明显升高。 Hsa＿circ＿0008433在PDLSCs骨向诱导21 d后显著高表达。结论Hsa＿circ＿0008433将来可能是PDLSCs骨向分化新的生物学标记物。     

炎症微环境下miR-30a调控Runx相关转录因子2对人牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的:探究炎症微环境下微小RNA-30a(miR-30a)调控Runt相关转录因子2(Runx2)对人牙周膜干细胞成骨分化的影响.方法:体外培养人牙周膜干细胞(hPDLSCs),随机分为对照组、模型组、miR-30a mimics(模拟物)组、miR-30a mimics阴性对照组、miR-30a inhibitor(...     

去分化间充质干细胞成骨再分化潜能的实验研究

目的:研究去分化间充质干细胞(de－differentiated mesenchymal stem cells,De－MSCs)成骨再分化能力?方法:以MSCs为对照,分别采用Cell Count Kit(CCK8)法?实时定量PCR(qPCR)?碱性磷酸酶(ALP)活性和茜素红染色法检测De－MSCs增殖能力?成骨相关基因?成骨再分化能力等?结果:De－MSCs可表达干细胞表面标志,在成骨培养基中增殖能力高于MSCs(P < 0.05),成骨相关基因(Runx2?Osterix?Bmp2)表达明显增加(P < 0.05),ALP活性检测发现De－MSCs明显高于MSCs组(P < 0.05),28 d后茜素红染色可见红色结节?结论:De－MSCs具备某些MSCs特征,但是体外再次成骨效率明显提高,De－MSCs可作为更优质种子细胞,为再生医学开拓新的思路?     

低频脉冲电磁场增强骨形态发生蛋白9诱导牙周膜干细胞成骨分化作用

目的 探讨低频脉冲电磁场能否增强骨形态发生蛋白9（BMP9）诱导人牙周膜干细胞（PDLSC）成骨分化的作用。方法 培养健康人前磨牙牙周膜组织细胞，通过免疫磁珠分选后得到CD146⁺/STRO-1⁺细胞，即PDLSC。用携带过表达BMP9基因的重组腺病毒（Ad-GFP-BMP9）感染PDLSC，并暴露于频率为15Hz、磁场强度分别为0.6、1.2、1.8、2.4、3.0mT的脉冲电磁场进行干预（每12h辐照1h）。通过qRT-PCR和蛋白质印迹法检测Runt相关转录因子2（Runx2）、碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）、骨钙蛋白（OCN）等成骨基因及蛋白表达量。结果 过表达BMP9基因可以促进PDLSC中成骨标志物Runx2、ALP、OCN、OPN的表达（P<0.05）。给予磁场强度分别为1.2、1.8、2.4、3.0mT的脉冲电磁场干预后，PDLSC内的成骨标志物表达水平均较单独BMP9时增高（P<0.05），并且在磁场强度为2.4mT时达到最高峰（P<0.05），表明低频脉冲电磁场可以增强BMP9诱导PDLSC成骨分化并且存在“窗口效应”。结论 磁场强度为1.8~3.0mT的15Hz脉冲电磁场可以体外增强BMP9诱导人PDLSC的成骨分化。     

miR-34a对人牙周膜干细胞成骨分化的促进作用及其机制

探讨微小RNA-34a（miR-34a）对人牙周膜干细胞（PDLSCs）成骨分化的影响,并阐明其作用机制。     

脉冲电磁场诱导干细胞成骨分化机制的研究进展

骨质疏松症(OP)是严重威胁老年人健康的疾病之一.由于OP患者极易发生骨折并发症,严重时可致患者残疾,甚至死亡,因此寻找预防OP的方法已成为了当前研究的一个热点.近年来,脉冲电磁场技术在临床预防OP中起着重要的作用,其中诱导干细胞的成骨分化是其中最重要的机制之一.由于人们对脉冲电磁场诱导干细胞成骨分化机制认识还不深,本文对近年来脉冲电磁场诱导成骨分化的研究进行归类整理,主要从脉冲电磁场诱导成骨分化相关基因表达、调节干细胞周围的微环境以及促进相关信号通路传导等方面的研究进展作一综述.弄清脉冲电磁场促进干细胞成骨分化的具体机制对将来OP预防具有重要的指导意义.     

寡核苷酸YW002对人牙周膜干细胞增殖、周期、凋亡和早期成骨分化的影响

目的：探讨免疫刺激型寡核苷酸（ODN） YW002对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）增殖、周期、凋亡和成骨分化的影响,阐明ODN YW002对hPDLSCs生物学性能的调控作用。方法：原代培养hPDLSCs至3~5代,将细胞分为空白对照组、免疫抑制型ODN MT01组和ODN YW002组,共培养1、2、3和5d后采用MTT法检测各组hPDLSCs的增殖活性,采用流式细胞术检测各组hPDLSCs的细胞周期和凋亡情况,采用磷酸苯二钠微板法检测各组hPDLSCs中碱性磷酸酶（ALP）活性。结果：与空白对照组比较,ODN YW002组在培养1和3d时hPDLSCs增殖活性升高（P<0.01）;培养5d时hPDLSCs细胞增殖活性升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。与ODN MT01组比较,ODN YW002组培养1d时hPDLSCs增殖活性下降（P<0.05）;培养3和5d时细胞增殖活性升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。与空白对照组和ODN MT01组比较,ODN YW002组培养1 d时G₀/G₁期hPDLSCs百分比降低,但差异无统计学意义（P>0.05）;S期hPDLSCs百分比升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。与空白对照组比较,ODN YW002组培养1 d时hPDLSCs早期和晚期细胞凋亡率降低（P<0.05）;培养2 d时早期和晚期细胞凋亡率降低,但差异无统计学意义（P>0.05）。与ODN MT01组比较,ODN YW002组培养2d时hPDLSCs早期和晚期细胞凋亡率降低（P<0.05）。与空白对照组比较,培养1、3和5d时ODN YW002组hPDLSCs中ALP活性升高（P<0.01）;与ODN MT01组比较,ODN YW002组培养1和5d时hPDLSCs中ALP活性升高（P<0.05）,培养3d时ALP活性降低（P<0.05）。结论：ODN YW002可通过抑制细胞凋亡以促进hPDLSCs增殖,且诱导ALP活性升高,提示其有潜在的促hPDLSCs成骨分化功能。     

模拟炎症微环境下紫草素对人牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响

目的 探究紫草素在牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的炎症微环境下对人牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响。方法 从健康人牙周膜组织中分离培养人牙周膜干细胞,采用流式细胞术鉴定细胞表面标志物CD29、CD105、CD34、CD45。CCK-8法检测不同浓度紫草素对正常及模拟炎症微环境下人牙周膜干细胞增殖活性的影响：首先筛选出紫草素促进增殖人牙周膜干细胞作用的适宜浓度范围,再取牙周膜干细胞进行后续实验分组：空白组(单纯培养基)、紫草素组(实验药物浓度紫草素)、LPS组(牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,P.g-LPS,10μg/mL)、紫草素+LPS组(实验药物浓度紫草素+P.g-LPS)。3 d时采用酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中IL-6、IL-18水平;7 d时进行碱性磷酸酶染色及碱性磷酸酶活性测试、21 d时进行茜素红染色检测成骨的分化能力;168 h时进行RT-PCR检测骨钙素、RUNT相关转录因子2、碱性磷酸酶等成骨基因的表达。结果 分离培养的人牙周膜干细胞主要呈束状长梭形,流式鉴定结果表面标志物CD29(99.9...