GPRASP2基因编辑猪胎儿成纤维细胞系的建立

目的：采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G蛋白偶联受体相关分选蛋白2（G protein?coupled receptor associated sorting protein 2，GPRASP2）基因敲除的猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast，PFF），为构建GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型提供相应的供体细胞。方法：采用生物信息学方法对人与猪GPRASP2基因进行亲缘性和同源性分析，预测人与猪GPRASP2基因编码的氨基酸序列和蛋白二级结构；设计合成靶向巴马猪GPRASP2基因编码区上游和下游的单导向RNA（single guide RNA，sgRNA），以pX330质粒为载体，构建含有Cas9骨架的重组打靶质粒，并将此重组质粒转染至PFF中，G418药物筛选阳性单克隆细胞，测序分析其基因型。结果：生物信息学分析提示人/猪GPRASP2亲缘关系相近，同源性较高，且主要功能结构域Arm2的二维和三维结构相似。构建了靶向猪GPRASP2基因的重组打靶质粒并转染PFF，通过药物筛选、基因型分析和Western blot验证，成功获得GPRASP2基因敲除单克隆PFF。结论：人/猪GPRASP2基因亲缘关系相近且高度同源；采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成功构建GPRASP2基因敲除的单克隆PFF，为建立GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型奠定了前期基础。