胶原水凝胶支架用于软骨组织工程的实验研究

目的探讨Ⅰ型胶原浓度对胶原水凝胶理化性能的影响,以及在体外组织工程模型中不同浓度的Ⅰ型胶原水凝胶对软骨细胞表型和基因表达的影响。方法制备Ⅰ型胶原浓度为12、8、6 mg/mL的3种胶原水凝胶,记为C12、C8、C6。扫描电镜观察形貌,并通过溶胀性能和抗压性能测试表征其理化性能。取2只新生7日龄新西兰大白兔的关节软骨,酶消化法分离、培养软骨细胞。取第2代软骨细胞与3种胶原水凝胶复合体外培养(C12组、C8组及C6组),1 d后采用二乙酸荧光素(fluorescein diacetate,FDA)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色,激光共聚焦显微镜观察细胞活性,体外培养14 d后行HE和甲苯胺蓝染色观察组织学形态,实时荧光定量PCR测定软骨细胞相关基因,即Ⅱ型胶原、蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅰ型胶原、Ⅹ型胶原、Sox9 mRNA表达。结果随着Ⅰ型胶原浓度从6 mg/mL提高到12 mg/mL,胶原水凝胶的理化性质出现明显变化,扫描电镜下纤维网络变得致密;192 h时C6、C8、C12溶胀率依次增大,分别为0.260±0.055、0.358±0.072、0.539±0.033,比较差异均有统计学意义(P<0.05);压缩模量逐渐增加,分别为(4.86±0.96)、(7.09±2.33)、(11.08±3.18)kPa,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。体外培养1 d,3组凝胶中软骨细胞经FDA/PI染色后,绝大部分被染成绿色,仅有少数被染成红色。14 d后组织学观察示:C12组软骨细胞在组织中聚集明显,并出现明显的甲苯胺蓝异染为紫红色的现象;C8组中也有部分增殖聚集的区域,细胞周围有较明显的甲苯胺蓝异染现象;C6组细胞分布较为均匀,也有较明显的甲苯胺蓝异染现象。实时荧光定量PCR检测显示,3组Ⅱ型胶原mRNA和Aggrecan mRNA表达水平相近;Ⅰ型胶原、Sox9和X型胶原mRNA表达水平C12组最高,C6组最低,C8组介于二者之间,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论提高Ⅰ型胶原浓度至12 mg/mL后,胶原水凝胶具有更好的理化性质,但软骨细胞纤维化和肥大相关基因表达也有所上调。

EXPERIMENTAL STUDY ON COLLAGEN HYDROGEL SCAFFOLDS FOR CARTILAGE TISSUE ENGINEERING